Auswirkungen zweier Vitrifikationsverfahren auf die morphologische und molekulare Qualität in vitro
produzierter boviner Embryonen
INAUGURAL – DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von Katharina Beuing
Ibbenbüren
Hannover 2013
Reproduktionsmedizinische Einheiten der Kliniken
1. Gutachterin: Prof. Dr. Christine Wrenzycki
2. Gutachter: Prof. Dr. Burkhard Meinecke
Tag der mündlichen Prüfung: 13.05.2013
Meiner Familie
1. Einleitung 1
2. Literatur 4
2.1. In-vitro-Produktion von Embryonen 4
2.2. Physikalische Vorgänge beim Einfrieren von Zellen 11
2.3. Kryokonservierungsverfahren 13
2.3.1. Konventionelle Kryokonservierung 14
2.3.2. Vitrifikation 16
2.4. Kryoprotektiva 18
2.4.1. Penetrierende Kryoprotektiva 19
2.4.1.1. Glyzerin 20
2.4.1.2. Ethylenglycol 22
2.4.1.3. Dimethylsulfoxid 25
2.4.1.4. Propylenglycol 29
2.4.2. Nicht-penetrierende Kryoprotektiva 31
2.4.2.1. Zucker 32
2.4.2.2. Makromoleküle 34
2.5. Vergleiche zwischen verschiedenen Trägersystemen zur Vitrifikation
36
2.5.1. Offene Trägersysteme 36
2.5.2. Geschlossene Trägersysteme 40
2.6. Qualität vitrifizierter, boviner Embryonen nach dem Auftauen 43 2.7. Genexpression in präimplantatorischen bovinen Embryonen 48
2.7.1. Glukosetransporter Typ 1 (SLC2A1) 52
2.7.2. Zona occludens-Protein 1 (TJP1) 54
2.7.3. Interferon (IFNT2) 55
2.7.4. Hitzeschockprotein 70 (HSPA1A) 57
2.7.5. Desmocollin 2 (DSC2) 59
2.7.6. Prostaglandin G/H Synthase 2 (PTGS2) 60
3. Material und Methoden 63
3.1. In-vitro-Produktion 63
3.1.1. Herkunft und Transport der Ovarien 64
3.1.2. Bearbeitung der Ovarien 64
3.1.3. Selektion der Kumulus-Oozyten-Komplexe 65
3.1.4. In-vitro-Maturation (IVM) 65
3.1.5. In-vitro-Fertilisation (IVF) 66
3.1.5.1. Vorbereitung der Medien 66
3.1.5.2. Vorbereitung der Spermien 67
3.1.5.3. Fertilisation 67
3.1.6. In-vitro-Kultur (IVC) 68
3.2. Entwicklungskontrollen 68
3.3. Vitrifikation durch Gynemed VitriFreeze Medien 69 3.4. Auftauen der Embryonen durch Gynemed VitriThaw Medien 71 3.5. Vitrifikation durch Origio MediCult Vitrification Cooling Medien 72 3.6. Auftauen der Embryonen durch Origio MediCult Vitrification
Warming Medien
73
3.7. Kontrollen 74
3.7.1. Kontrolle des Einflusses der Vitrifikations- und Auftaumedien 75
3.8. Qualitätskontrollen nach dem Auftauen 75
3.8.1. Reexpansions- und Schlupfrate 75
3.8.2. Lebend-Tot-Färbung 75
3.8.3. mRNA Analyse 78
3.8.3.1. Vorbereitung der Dynabeads-Suspension 79
3.8.3.2. Isolierung der mRNA aus den geschlüpften Blastozysten 80
3.8.3.3. Reverse Transkription 81
3.8.3.4. Polymerase Kettenreaktion 82
3.9. Statistische Analysen 84
3.10. Allgemeiner Versuchsaufbau 85
4. Ergebnisse 86
4.1. Ergebnisse der In-vitro-Produktion 86
4.2. Morphologische Qualitätsbestimmungen 87
4.2.1. Reexpansions- und Schlupfraten 87
4.2.2. Ergebnisse der Zellzahlzählung 89
4.3. Analyse der Genexpression 93
4.3.1. Glukosetransporter Typ 1 (SLC2A1) 93
4.3.2. Zona occludens-Protein 1 (TJP1) 94
4.3.3. Interferon (IFNT2) 95
4.3.4. Hitzeschockprotein 70 (HSPA1A) 96
4.3.5. Desmocollin 2 (DSC2) 96
4.3.6. Prostaglandin G/H Synthase 2 (PTGS2) 97
5. Diskussion 99
5.1. Reexpansions- und Schlupfraten 101
5.2. Zellzahlzählung 103
5.3. Genexpression nach dem Auftauen 104
5.4. Schlussfolgerungen 110
6. Zusammenfassung 112
7. Summary 115
8. Anhang 118
8.1. Verzeichnis der verwendeten Medien 118
8.1.1. Medien für die IVM 118
8.1.2. Medien für die IVF 120
8.1.3. Medien für die IVC 123
8.1.4. Medien für die Lebend-Tot-Färbung 125
8.1.5. Medien für die RT-qPCR 126
8.2. Abkürzungsverzeichnis 128
8.3. Einzeldaten der Zellzahlzählung 132
8.4. Einzeldaten der RT-qPCR 133
8.5. Verzeichnis der Tabellen 134
8.6. Verzeichnis der Abbildungen 138
9. Literaturverzeichnis 140
1. Einleitung
Die Kryokonservierung boviner Embryonen erlangt immer größere Bedeutung in der assistierten Reproduktionsmedizin. Auch die Anzahl der in vitro produzierten Embryonen stieg in den letzten Jahren deutlich an. So wurden im Jahr 2010 11%
mehr bovine Embryonen in vitro generiert als 2009 (STROUD 2010). Nach wie vor ist jedoch die Qualität in vitro produzierter Embryonen den in vivo generierten unterlegen. Dies zeigt sich unter anderem an einer verzögerten Entwicklung, an schlechteren Trächtigkeitsraten, an reduzierten Überlebensraten nach der Kryokonservierung (GREVE et al. 1994) und an der veränderten Expression entwicklungsrelevanter Gentranskripte (WRENZYCKI et al. 2001).
Zur Kryokonservierung von Embryonen werden zwei Hauptverfahren verwendet, die konventionelle Kryokonservierung und die Vitrifikation. Die konventionelle Kryokonservierung, bei der Embryonen durch langsame Kühlraten in speziellen Gefrierautomaten auf Temperaturen unter den Gefrierpunkt heruntergekühlt und dann in flüssigen Stickstoff verbracht werden, wird heutzutage sowohl bei in vitro als auch in vivo generierte Embryonen standardmäßig eingesetzt. Es wurde jedoch nachgewiesen, dass die Vitrifikation als Einfrierverfahren für in vitro produzierte Embryonen besser geeignet ist (MAHMOUDZADEH et al. 1995, KAIDI et al. 2001, DOBRINSKY 2002, VIEIRA et al. 2007, STINSHOFF et al. 2011). Die Vitrifikation stellt eine ultraschnelle Gefriermethode dar, bei der Embryonen durch hohe Konzentrationen an Kryoprotektiva und extrem hohe Kühlraten in einen amorphen, glasähnlichen Zustand überführt werden (LUYET u. HODAPP 1938). Der große Vorteil der Vitrifikation ist, dass durch die hohen Kühlraten und die hohen Konzentrationen der Kryoprotektiva keine intrazellulären Eiskristalle entstehen, welche die Zellmembran schädigen könnten. Dadurch lassen sich nach dem Auftauen im Vergleich zur konventionellen Kryokonservierung gleich gute oder bessere Überlebensraten erzielen (DINNYÈS et al. 1996, KULESHOVA u. LOPATA 2002).
Die Vitrifikation wurde 1985 zum ersten Mal erfolgreich zur Kryokonservierung von Mäuseembryonen eingesetzt (RALL u. FAHY 1985). Seitdem wurde immer wieder an
der Veränderung und Verbesserung der Vitrifikationsprotokolle gearbeitet, um eine praxisreife Methode zu entwickeln. Die Entwicklung einer solchen Methode ist dabei nicht nur im Bereich der Veterinärmedizin, beispielsweise zur Ermittlung des genomischen Zuchtwertes bei Rinderembryonen, sondern auch in der Humanmedizin von großem Interesse. Bei der Präimplantationsdiagnostik werden Biopsien von frühen Embryonalstadien entnommen und die Embryonen für die Dauer der Untersuchungen kryokonserviert. Eine Verbesserung der Konservierungsmethode wäre in diesem Bereich von enormer Bedeutung. Ein Nachteil bei der Vitrifikation besteht jedoch darin, dass die eingesetzten Kryoprotektiva in hohen Konzentrationen zelltoxisch wirken. Um die toxischen Effekte möglichst gering zu halten, werden meist Gemische aus penetrierenden und nicht-penetrierenden Kryoprotektiva verwendet. Penetrierende Kryoprotektiva, wie zum Beispiel Glycerin, Dimethylsufoxid (DMSO) oder Ethylenglykol (EG), zeichnen sich dadurch aus, dass sie die Fähigkeit haben, durch die Zellmembran zu diffundieren, um intrazellulär einen Schutz vor der Bildung schädlicher Eiskristalle zu bewirken. Nicht-penetrierende Kryoprotektiva, wie zum Beispiel Saccharose, Ficoll oder Polyvinylpyrrolidon (PVP), erhöhen die extrazelluläre Osmolarität, wodurch Wasser aus der Zelle transportiert wird. Die geringere intrazelluläre Wasserkonzentration bewirkt dabei ebenfalls einen Schutz vor der Bildung schädlicher Eiskristalle (MERYMAN et al. 1977).
Durch die Veränderung der Vitrifikationsprotokolle konnten in den letzten Jahren deutliche Verbesserungen in den Überlebensraten in vitro produzierter boviner Embryonen erzielt werden. Eine optimale Zusammensetzung der Einfriermedien für eine praxisreife Vitrifikationsmethode konnte allerdings noch nicht ermittelt werden.
Ein häufig kontrovers diskutiertes Thema ist die Frage, ob DMSO als Kryoprotektivum zur Vitrifikation boviner Embryonen geeignet ist. Zum einen hat DMSO eine ausgezeichnete Fähigkeit zur Eisbildung (FRIEDLER et al. 1988, VALDEZ et al. 1992), zum anderen gilt es jedoch als eines der toxischsten Kryoprotektiva (STACHECKI et al. 2008). Der Vergleich der Auswirkungen DMSO-haltiger und DMSO-freier Kryoprotektiva auf die Qualität boviner Embryonen
ergab unterschiedliche Ergebnisse, so dass bisher keine deutliche Aussage getroffen werden konnte, welche Methode besser geeignet ist.
Das Ziel dieser Arbeit war es, die Auswirkungen eines DMSO-haltigen und eines DMSO-freien kommerziell erhältlichen Vitrifikationsmediums auf die Qualität in vitro produzierter boviner Blastozysten nach dem Auftauen zu ermitteln. Dabei sollte sowohl die morphologische Qualität, durch die Ermittlung der Überlebensraten der Embryonen nach dem Auftauen und der Lebend-Tot-Zellratio, als auch die molekulare Qualität, durch die Analyse der Expression sechs entwicklungsrelevanter Gentranskripte, untersucht werden.
2. Literatur
2.1. In-vitro-Produktion von Embryonen
Die In-vitro-Produktion (IVP) von Embryonen umfasst methodisch drei Schritte: Die Reifung (In-vitro-Maturation, IVM), die Befruchtung (In-vitro-Fertilisation, IVF) und die Kultur der befruchteten Eizellen (In-vitro-Culture oder -Kultur, IVC; BAVISTER 1995).
Das Verfahren der IVP wurde erstmalig bei Nagetieren dokumentiert. Die ersten Kaninchen aus in vitro produzierten Embryonen wurden 1959 geboren (CHANG 1959) und 1968 folgte die erste erfolgreiche IVP bei Labormäusen (WHITTINGHAM 1968). Das erste in vitro fertilisierte Kalb wurde 1981 geboren, dabei wurden die in vivo maturierten Oozyten aus dem Eileiter des Muttertieres gespült und nach der Fertilisierung im Labor direkt auf Empfängertiere übertragen (BRACKETT et al.
1982). Das erste, vollständig in vitro produzierte Kalb kam 1987 zur Welt (FUKUDA et al. 1990), seitdem steigt die IVP boviner Embryonen Jahr für Jahr an. Im Jahr 2010 wurden 451000 Rinderembryonen in vitro produziert, von denen rund 340000 übertragen wurden. Im Vergleich dazu waren es im Jahr 2009 11% weniger (International Embryo Transfer Society, IETS; STROUD 2010). In Tabelle 1 sind die Zahlen in vivo und in vitro generierter Embryonen für die Spezies Rind für 2010 und 2009 im Vergleich dargestellt.
Tabelle 1: Vergleich der Anzahl in vivo und in vitro produzierter boviner Embryonen 2009 und 2010 (STROUD 2010)
Rinderembryonen 2009 (ca.) 2010 (ca.) Steigerung (ca., %) In vivo generiert 702000 732000 4,3%
Davon übertragen 534000 591000 10,7%
In vitro generiert 377000 451000 19,7%
Davon übertragen 306000 340000 11,0%
Die für die IVP benötigten Kumulus-Oozyten-Komplexe (KOK) aus Ovarien werden durch zwei Hauptverfahren gewonnen; zum einen durch die transvaginale, ultraschallgeleitete Follikelpunktion (Ovum Pick Up, OPU; PIETERSE et al. 1988) oder zum anderen durch die Gewinnung der Eizellen aus Schlachthofovarien mittels Aspiration oder durch die sogenannte „Slicing-Methode“ (ECKERT u. NIEMANN 1995). Ein Vorteil des OPU ist, dass besonders wertvolle Tiere mehrfach punktiert und so viele Eizellen dieser Tiere gewonnen werden können (BOLS et al. 1995), allerdings können aus Schlachthofovarien, aufgrund der größeren Menge gewonnener KOK und der stärkeren Selektion morphologisch guter Eizellen, häufig KOK besserer Qualität gewonnen werden (MERTON et al. 2003). Diese Qualität zeichnet sich unter anderem dadurch aus, dass die KOK aus Schlachthofovarien meist eine höhere Anzahl Kumuluszelllagen besitzen (BUNGARTZ et al. 1995) und durch den sogenannten „Post-mortem-Effekt“ eine bessere Entwicklungskompetenz erreichen (BLONDIN et al. 1997). Die qualitative Beurteilung der KOK erfolgt zunächst auf morphologischer Ebene. Dabei lässt sich aufgrund der Anzahl der die Zelle umgebenden Kumulusschichten sowie der Homogenität und der Farbe des Zytoplasmas unter dem Mikroskop eine erste Einordnung in Qualitätsklassen durchführen. Oozyten mit einer kompakten und mehrlagigen Kumulusschicht und einem möglichst homogenen Zytoplasma gelten als qualitativ gut (KASTROP et al.
1990), des Weiteren steigt die Wahrscheinlichkeit für eine erfolgreiche Entwicklung zur Blastozyste in vitro mit der Anzahl der Kumulusschichten an (KHURANA u.
NIEMANN 2000; KELLY et al. 2007). Die KOK werden bei der morphologischen Beurteilung hinsichtlich ihrer Qualität selektiert, da nur die als qualitativ gut eingestuften KOK in die IVP eingehen.
Der erste Schritt der IVP, die Maturation, findet unmittelbar nach der Selektion der KOK im Labor statt. Die Reifungsdauer beträgt normalerweise 18-27 Stunden und ist abhängig vom Reifungsmedium und der Qualität der Eizellen (ROSE u. BAVISTER 1992, NAGAI 2001). Sie gliedert sich in die nukleäre und die zytoplasmatische Maturation (HYTTEL et al. 1997) und dient dazu, die in der Oogenese arretierte Reifeteilung fortzusetzen (EDWARDS 1965, SIRARD u. COENEN 2006). In vivo wird die unreife Eizelle in der Follikelflüssigkeit durch das follikuläre Milieu in der
Prophase 1 der 1. Reifeteilung arretiert. Durch Änderungen im follikulären Milieu und den präovulatorischen Anstieg der Gonadotropinkonzentration wird die Prophase 1 schließlich beendet und die 1. Reifeteilung fortgesetzt (SUTTON et al. 2003).
PINCUS und ENZMANN konnten bereits 1935 nachweisen, dass durch die Entnahme unreifer Eizellen aus dem präovulatorischen Follikel und die dadurch bedingte Milieuänderung eine spontane Einleitung der Eizellreifung stattfindet (PINCUS u. ENZMANN 1935). Heute werden durch kommerziell erhältliche Reifungsmedien Reifungsraten von 66-95% erreicht (ADONA 2008). Solche kommerziell erhältlichen Medien sind beispielsweise Tissue Culture Medium 199 (TCM199), Waymouth MB 752/1, Ham’s F12, Minimum Essential Medium (MEM) oder Dulbecco’s Modification of Eagle’s Medium (DMEM). Dabei waren bei bovinen Oozyten die Entwicklungsraten bei Verwendung der Maturationsmedien Waymouth MB 752/1 oder Ham’s F12 signifikant schlechter als bei der Reifung in TCM199 oder MEM (ROSE u. BAVISTER 1992, SUTTON et al. 2003).
Kommerziell erhältlichen Medien werden in der Regel undefinierte oder semidefinierte Proteinzusätze wie beispielsweise fetales Kälberserum (fetal calf serum, FCS), estrous cow serum (ECS), bovines Serumalbumin (bovine serum albumine, BSA) oder auch humanes Serumalbumin (human serum albumine, HSA) zugefügt. Diese sind wichtig, um beispielsweise die Toxizität anderer Medienzusätze oder metabolischer Faktoren zu senken, um die grundsätzlichen Nährstoffanforderungen der Oozyten zu befriedigen oder um die Oozytenreifung zu fördern (ECKERT u. NIEMANN 1995). Ein weiterer Vorteil von Proteinzusätzen ist eine Verbesserung in der Handhabung der Oozyten, da ein Aufschwimmen der Eizellen im Medium vermindert wird. Allerdings entstehen bei dem Einsatz undefinierter Medienzusätze große Variabilitäten in der Zusammensetzung der Maturationsmedien, wodurch die Reproduzierbarkeit von Ergebnissen und die Vergleichbarkeit innerhalb unterschiedlicher Laboratorien, die mit solchen Medienzusätzen arbeiten, erschwert werden (ECKERT u. NIEMANN 1995). Des Weiteren besteht beim Zusatz von beispielsweise FCS oder BSA die Gefahr einer möglichen Kontamination mit Krankheitserregern (SUTTON et al. 2003). Es hat sich allerdings gezeigt, dass bovine Oozyten, welche in einem Maturationsmedium, dem
FCS beigefügt war, gereift wurden, sowohl höhere Maturationsraten als auch höhere Entwicklungsraten zur Blastozyste zeigten, als solche, die ohne Serumzusatz gereift wurden (FUKUI u. ONO 1989, WIEMER et al. 1991, HASLER 2000). Zusätzlich ermöglicht z.B. BSA, als Zusatz zum Maturationsmedium, bei bovinen Blastozysten eine adäquate zytoplasmatische und Kernreifung (MINGOTI et al. 2002).
Eine Alternative zu undefinierten Proteinzusätzen sind Makromoleküle wie Polyvinylalkohol (PVA) oder Polyvinylpyrrolidon (PVP). In Kombination mit Hormonen und anderen Zusätzen, wie z.B. Hypotaurin oder ß-Mercaptoethanol, können diese Maturationsmedien zu Blastozystenraten führen, welche an die Raten von Medien mit BSA-Zusatz herankommen (ABEYDEERA et al. 2000; MIZUSHIMA u. FUKUI 2001) und damit eine gute Alternative zu den undefinierten Medien darstellen (SUTTON et al. 2003).
Nach Abschluss der Reifung erfolgt unmittelbar die IVF, die ca. 6-24 Stunden dauert.
Um eine erfolgreiche Fertilisierung zu ermöglichen, müssen die Spermien vor der Koinkubation mit den Eizellen kapazitiert sein, da sie sonst die Zona pellucida nicht penetrieren können (CHANG 1984, BRACKETT et al. 1993). Die Kapazitation und auch die Akrosomenreaktion sind physiologische Vorgänge, welche zur Befruchtung der Eizellen nötig sind. In vivo wird die Kapazitation durch Glukosaminoglykane wie zum Beispiel Heparin im weiblichen Genitaltrakt induziert (BRACKETT et al. 1993, PARRISH et al. 1986), die Akrosomenreaktion wird durch eine Permeabilitätsänderung der Spermienmembran für Kalzium-Ionen ausgelöst (BRACKETT et al. 1993). In vitro werden diese Vorgänge, bei der Aufbereitung der Spermiensuspension und bei der Koinkubation der Spermien mit den Oozyten, durch den Zusatz von Heparin zu den Kulturmedien induziert (PARRISH et al. 1988). Des Weiteren wird in vitro durch die Dichtegradientenzentrifugation mit Silikaten, wie zum Beispiel den kommerziell erhältlichen Spermfilter®, PureSperm®, BoviPure® oder CryoBioSystem die Anreicherung motiler Spermien in der dichten Fraktion der Suspension ermöglicht, wodurch diese von den nicht motilen Spermien separiert und besser aussortiert werden können (PARRISH et al. 1995). Insgesamt können bei der IVF Fertilisationsraten von durchschnittlich 80% erreicht werden (KRISHER et al.
1999, RIZOS et al. 2003).
Nach der Koinkubation von Eizellen und Spermien findet die IVC statt. Dazu werden die vermeintlichen Zygoten für etwa 6-8 Tage in ein Kulturmedium überführt. Auch bei diesem Schritt hat die Wahl des Kulturmediums und der Kulturbedingungen, wie zum Beispiel die Sauerstoffkonzentration, entscheidenden Einfluss auf die Entwicklungsraten der Embryonen. Zu Beginn wurden häufig, ähnlich wie in der IVM, komplexe Medien mit undefinierten Serumzusätzen wie FCS oder BSA eingesetzt.
Ein Beispiel für ein solch komplexes Medium ist das TCM199 (EYESTONE u. FIRST 1989). Neben der schon erwähnten schwierigen Vergleichbarkeit beim Einsatz solcher Medien gibt es ein weiteres Problem, dass das TCM199 ursprünglich für Zellkulturen entwickelt wurde und daher nicht auf die speziellen Bedürfnisse von Embryonen abgestimmt ist (WRENZYCKI 2007). Zur Verbesserung der genannten Probleme wurden zunächst definierte Makromoleküle wie PVA eingesetzt, um die Ergebnisse vergleichbarer zu machen. Des Weiteren wurde bereits 1972 ein chemisch definiertes Medium, das synthetic oviduct fluid (SOF), speziell für die Kultur von Embryonen entwickelt, welches sich zunächst allerdings nicht durchsetzen konnte (TERVIT et al. 1972). Heutzutage wird das SOF und andere chemisch definierte Medien, wie das hamster embryo culture medium (HECM), standardmäßig zur IVP von Embryonen eingesetzt (SCHINI u. BAVISTER 1988, SUTHAR u. SHAH 2009). Beim Einsatz solcher Medien wird meist eine Sauerstoffkonzentration von 5%
in der Atmosphäre benötigt, um gute Blastozystenraten erreichen zu können (VANROOSE et al. 2001). Diese Sauerstoffkonzentration entspricht in etwa den In-vivo-Bedingungen von Embryonen im maternalen Reproduktionstrakt (FISCHER u. BAVISTER 1993, CORRÊA et al. 2008). Durch die Absenkung der Sauerstoffkonzentration können höhere Überlebensraten bei der IVP erreicht werden (CORRÊA et al. 2008).
Trotz vieler Verbesserungen der Kulturbedingungen in den letzten Jahren sind die in vitro produzierten Embryonen qualitativ den in vivo generierten unterlegen, so erreichen in der Regel 25-40% der in die IVP eingebrachten Oozyten das Stadium der Blastozyste (KRISHER et al. 1999, RIZOS et al. 2003). Eine Übersicht der gesamten IVP ist schematisch in Abbildung 1 dargestellt.
Der Einsatz verschiedener Kulturmedien hat nicht nur Auswirkungen auf die Entwicklungsrate zum Blastozystenstadium, es konnte ebenfalls festgestellt werden, dass verschiedene Kulturbedingungen einen Einfluss auf die Kryokonservierbarkeit boviner Embryonen haben. So wurde beispielsweise gezeigt, dass der Zusatz von Hyaluronsäure in einer Konzentration von 1 mg/ml zum SOF-Kulturmedium die Reexpansionsrate und in einer Konzentration von 0,5 mg/ml die Schlupfrate vitrifizierter Blastozysten nach dem Auftauen steigern kann (BLOCK et al. 2009).
Auch Phenazinethosulphat in einer Konzentration von 0,3 µM steigert die Überlebensrate vitrifizierter und konventionell kryokonservierter boviner Blastozysten.
Dieser Effekt ist darauf zurückzuführen, dass Phenazinethosulphat den zytoplasmatischen Lipidgehalt der Embryonen senkt (BARCELÓ-FIMBRES u.
SEIDEL 2007). Sehr häufig konnte nachgewiesen werden, dass FCS als Medienzusatz bei der IVC die Einfrierbarkeit boviner Blastozysten reduziert. So erreichten GÓMEZ et al. (2008) bei bovinen Blastozysten, welche in Medien mit BSA oder Verozellzusatz kultiviert wurden, nach dem Auftauen höhere Überlebensraten
Unreife Eizellen Spermien
In-vitro-Fertilisation 6-24 Stunden
In-vitro-Kultur 6-8 Tage
Blastozysten In-vitro-Maturation
18-27 Stunden In-vitro-Kapazitation
Abbildung 1: Schematische Darstellung der IVP (modifiziert nach NIEMANN u. MEINECKE 1993)
als bei solchen, die in Medien mit FCS kultiviert wurden. Auch HOSHI zeigte (2003), dass der Einsatz von serumfreien Medien im Vergleich zu Medien mit FCS zu wesentlich höheren Schlupfraten nach dem Auftauen führte. Ein Zusatz von FCS zu einem Charles Rosenkrans Medium mit Aminosäurenzusatz (CR1aa) ergab im Vergleich zu Medien ohne Serumzusatz zwar gleich gute Blastozystenraten, die Schlupfraten nach dem Auftauen waren jedoch in den Gruppen mit Serumzusatz geringer als bei denen ohne Serumzusatz (MUCCI et al. 2006). Die Tatsache, dass der Zusatz verschiedener Seren zum Kulturmedium die Kryotoleranz beeinflusst, ist darauf zurückzuführen, dass nach dem Einsatz von Serum im Zytoplasma der Zellen vermehrt Lipideinschlüsse beobachtet werden (HOSHI 2003). Solche Einschlüsse konnten schon ab dem 8-Zell-Stadium nachgewiesen werden (ABE et al. 1999) und es wurde in mehreren Arbeiten bestätigt, dass dadurch die Kryotoleranz boviner Blastozysten signifikant reduziert wird (MOHR u. TROUNSON 1981, LEIBO u.
LOSKUTOFF 1993). Bekräftigt werden diese Ergebnisse außerdem durch Versuche, in denen vor dem Einfrieren Lipidtröpfchen manuell aus dem Zytoplasma der Zellen entfernt wurden, wodurch die Überlebensrate der bovinen Blastozysten nach dem Auftauen gesteigert werden konnte (DIEZ et al. 2001, LEIBO et al. 1995). Im Gegensatz dazu konnte bei porzinen Embryonen die Zugabe von fetalem Rinderserum (fetal bovine serum, FBS) an Tag 4 der Kultur die Kryotoleranz und Überlebensraten nach Vitrifikation steigern. Dies ist darauf zurückzuführen, dass der Zusatz von FBS zu einer Verbesserung der Teilungsfähigkeit von porcinen embryonalen Zellen führt (MEN et al. 2005).
Auch Medienzusätze, welche nach dem Auftauen vitrifizierter Embryonen dem Kulturmedium beigefügt wurden, konnten die Überlebensraten boviner Blastozysten steigern. So zeigten RIZOS et al. (2001), dass die Kultur boviner Blastozysten in SOF mit Granulosazellen einen positiven Effekt auf die Überlebensrate hatte. Auch der Zusatz von ß-Mercaptoethanol nach dem Auftauen bewirkte eine Verbesserung der Schlupfraten und der Gesamtzellzahl boviner Blastozysten (NEDAMBALE et al.
2006).
2.2. Physikalische Vorgänge beim Einfrieren von Zellen
Das Einfrieren von biologischem Material ermöglicht dessen Lagerung über viele Jahre ohne Verlust der Vitalität, da alle biologischen Prozesse bei Temperaturen von -130°C und darunter zum Stillstand kommen. Die einzige mögliche Schädigung scheint die Bildung freier Radikale durch terrestrische Strahlung zu sein, welche jedoch so gering ist, dass Zellen theoretisch über 2000-4000 Jahre in flüssigem Stickstoff gelagert werden können bis es zu einer Schädigung kommt (MAZUR 1984). Biologisches Material, welches einem Einfrierprozess ausgesetzt ist, durchläuft verschiedene Veränderungen der externen und internen Bedingungen, wie z.B. Temperaturunterschiede, Veränderungen im Wassergehalt und in der Konzentration gelöster Stoffe (MAZUR u. SCHMIDT 1968). Die dabei entstehenden chemischen und physikalischen Prozesse können zu Schäden an den Zellen führen (MAZUR 1984). In Abb. 2 sind diese Prozesse schematisch dargestellt. Bis zu einer Temperatur von etwa -5°C bleibt das Wasser innerhalb und außerhalb der Zellen in einem flüssigen Zustand. Dies wird durch den Prozess des sogenannten
„supercoolings“ und durch die gelösten, den Gefrierpunkt erniedrigenden Stoffe in den Medien hervorgerufen. Bei einer Temperatur von -5°C bis -15°C beginnt das extrazelluläre Wasser zu kristallisieren. Dies geschieht entweder spontan oder wird, wie beim „Seeding“, manuell hervorgerufen (siehe Kapitel 2.3.1.). Durch den Schutz der Zellmembran bleibt das Wasser innerhalb der Zelle zunächst flüssig, was dazu führt, dass in der Zelle ein höheres chemisches Potential entsteht und Wasser anfängt, aus der Zelle zu diffundieren, um dieses Potential auszugleichen. Das ausgetretene Wasser kristallisiert ebenfalls im Extrazellularraum, die Zelle dehydriert und die gelösten Stoffe konzentrieren sich im flüssigen Medium innerhalb der Zelle, bis ein chemisches Gleichgewicht zwischen intra- und extrazellulären Flüssigkeiten herrscht. Die Geschwindigkeit des Einfrierprozesses bedingt dabei das Ausmaß der Dehydratation der Zellen. Wie in Abb. 2 ersichtlich, kann das intrazelluläre Wasser nur bei ausreichend kleinen Kühlraten aus der Zelle diffundieren. Sind die Kühlraten zu hoch, hat die Zelle nicht ausreichend Zeit zu dehydrieren und es entstehen schädliche, intrazelluläre Eiskristalle. Bei extrem hohen Kühlraten sind die Eiskristalle
in der Zelle zwar sehr klein, wodurch die Zelle beim Einfrieren nur wenig geschädigt wird, allerdings sind diese kleinen Eiskristalle extrem instabil und können sich beim Auftauen zu größeren Eiskristallen zusammenlagern, welche wiederum zu Zellmembranschäden führen können. Dieses Phänomen wird als Rekristallisation bezeichnet (MAZUR et al. 1972).
-2° C
-5°C
< -10°C
Langsames Einfrieren
Schnelles Einfrieren
Sehr schnelles Einfrieren
H2O
H2O
Abbildung 2: Schematische Darstellung physikalischer Prozesse beim Einfrieren von Zellen (mod. nach Mazur 1977)
Durch die Bildung intrazellulärer Eiskristalle können verschiedene Zellschäden entstehen, beim der Kryokonservierung von Embryonen wurden beispielsweise Veränderungen der Zona pellucida, der Zellmembran, der Mikrofilamentstruktur, der Zellorganellen oder der Zell-Zell-Verbindungen beobachtet (VAJTA 2000, DOBRINSKY 2002). Doch nicht nur die Eiskristallbildung schädigt die Zellen beim Einfrieren. MAZUR et al. postulierten 1972 zwei entscheidende Faktoren für die Zellschädigung beim Kryokonservieren. Der eine Faktor ist die erwähnte Eiskristallbildung, die von der Einfriergeschwindigkeit abhängt, der andere Faktor ist die Konzentrierung gelöster Stoffe, sowohl intra- als auch extrazellulär, welcher toxische Effekte hervorrufen kann. Ein optimales Einfrieren ist nur dann möglich, wenn beide Faktoren auf ein Minimum begrenzt werden.
Bei der Vitrifikation entstehen durch extrem hohe Kühl- und Auftauraten sowie durch den Zusatz von Kryoprotektiva in höheren Konzentrationen als bei der konventionellen Kryokonservierung keine intrazellulären Eiskristalle. Dies kommt dadurch zustande, dass mittels der hochkonzentrierten Kryoprotektiva die Zellen schon vor dem Abkühlprozess dehydriert werden. Die intrazelluläre Flüssigkeit wird somit visköser und kann so beim Abkühlen direkt vom flüssigen in einen glasähnlichen Zustand übergehen (RALL u. FAHY 1985). Die Schädigung durch Eiskristallbildung entfällt demnach bei der Vitrifikation, allerdings können durch die hohen Konzentrationen an Kryoprotektiva toxische Effekte entstehen. Es wird daher versucht durch den Einsatz von Gemischen aus penetrierenden und nicht-penetrierenden Kryoprotektiva und durch die Reduzierung der Äquilibrierungszeit die toxischen Effekte auf ein Minimum zu reduzieren.
2.3. Kryokonservierungsverfahren
Unter dem Begriff Kryokonservierung wird die Überführung flüssiger Substanzen oder Zellen in eine feste, gefrorene Phase mit dem Ziel der vollständigen Erhaltung der Ausgangseigenschaften des Materials verstanden (SCHEIWE u. RAU 1981). Die erste erfolgreiche Kryokonservierung und anschließende Übertragung von Embryonen fand 1971 bei der Maus statt (WHITTINGHAM 1971), 1973 folgte das
erste aus einem kryokonservierten Embryo geborene Kalb (WILMUT u. ROWSON 1973). Beim Menschen fand die erste Übertragung kryokonservierter Embryonen in den späten 1970ern statt (EDWARDS et al 1980), von der ersten Schwangerschaft wurde 1983 in Australien berichtet (TROUNSON u. MOHR 1983). Heute ist das Einfrieren von Embryonen ein in der Biotechnologie routinemäßig angewandtes Verfahren und findet immer größere Bedeutung im Rahmen des Embryonentransfers. So wurden 2010 beispielsweise in der bovinen Reproduktionsmedizin der überwiegende Teil der in vivo gewonnenen Embryonen vor dem Transfer auf ein Empfängertier kryokonserviert (STROUD 2010). Auch bei den in vitro generierten Embryonen gewinnt die Kryokonservierung immer mehr an Bedeutung. Mit ihrer Hilfe können Embryonen über Jahre gelagert, international verschickt und somit auf viele verschiedene Empfängertiere übertragen werden (RALL 1992). Es werden zwei hauptsächlich genutzte Gefrierverfahren, die konventionellen Kryokonservierung und die Vitrifikation, unterschieden. Der bedeutendste Unterschied liegt hierbei in der Einfriergeschwindigkeit. Während bei der konventionellen Kryokonservierung die Embryonen durch langsame Kühlraten in Einfrierautomaten heruntergekühlt werden, können die Embryonen bei den Vitrifikationsmethoden direkt in den flüssigen Stickstoff verbracht werden.
2.3.1. Konventionelle Kryokonservierung
Die konventionelle Kryokonservierung stellt das ursprünglich bei Embryonen eingesetzte Verfahren dar. Es wurde bei Forschungen zu den Effekten von Einfrier- und Auftauraten auf die Überlebensfähigkeit von Säugetierzellen entwickelt (MAZUR et al. 1972). Bei der konventionellen Kryokonservierung wird noch einmal zwischen langsamen und schnellen Gefrierverfahren unterschieden.
Bei den langsamen Gefrierverfahren werden die Embryonen bis zu einer bestimmten Temperatur langsam heruntergekühlt und bei dieser Temperatur für eine gewisse Zeit gelagert bevor, sie wieder aufgetaut werden. WHITTINGHAM benutzte ein solches Verfahren erstmalig 1971 für die Kryokonservierung von Mäuseembryonen, dabei lagen die Kühlraten bei ca. 1°C/s und die Embryonen wurden in einem
Medienvolumen von 0,25 ml in einem Glas- oder Plastikröhrchen eingefroren. Die Embryonen wurden für 30 Minuten auf Trockeneis bei -79°C in einem isolierten Gefäß gelagert, bevor sie wieder aufgetaut wurden. Als Kryoprotektivum kam hier PVP zum Einsatz (WHITTINGHAM 1971). Später wurden Einfrierautomaten verwendet, durch welche die Kühlraten individuell angepasst und eingestellt werden konnten.
Bei den schnellen Gefrierverfahren werden die Embryonen in diesen Gefrierautomaten ebenfalls zunächst schrittweise heruntergekühlt. Bei einer Temperatur von ca. -6°C wird das sogenannte „Seeding“ durchgeführt. Dabei wird manuell eine Kristallisation des extrazellulären Mediums hervorgerufen, wodurch schädliche Effekte auf den Embryo durch Unterkühlung vermieden werden sollen (LEIBO 1984). Daraufhin erfolgt die weitere langsame Kühlung auf ca. -20 - -40°C.
Anschließend werden die Embryonen, im Gegensatz zu den langsamen Gefrierverfahren, direkt in flüssigen Stickstoff überführt und können dort sehr lange gelagert werden.
Im Allgemeinen können bei der konventionellen Kryokonservierung die folgenden Schritte unterschieden werden (NIEMANN 1991):
Äquilibrierung des Embryos im Kryoprotektivum
Einführen des Embryos in das Trägersystem
Einführen des Trägersystems in den Einfrierautomaten und Herunterkühlen
Seeding
Erneutes Herunterkühlen
Überführung in flüssigen Stickstoff
Auftauen
Ausverdünnen des Mediums
Die Äquilibrierung im Kryoprotektivum erfolgte in mehreren Schritten, allerdings zeigte NIEMANN (1985), dass eine erfolgreiche Kryokonservierung auch mit nur einem Äquilibrierungsschritt in 1,4 M Glyzerin möglich ist. Heute werden bovine Embryonen bei der konventionellen Kryokonservierung standardmäßig in einem
Äquilibrierungsschritt in Ethylenglycol (EG) eingefroren. Eine große Verbesserung der Einfriertechnik wurde durch die Verwendung von Plastikstraws mit einem Volumen von 250 µl erreicht. Dadurch konnten die Embryonen zum einen besser in den Stickstoffcontainern gelagert werden, zum anderen war es nun möglich, eine Verdünnungslösung direkt mit in den Straw aufzuziehen, wodurch das Ausdünnen der Kryoprotektiva nach dem Auftauen vereinfacht werden konnte (MASSIP 2001).
Auf diese Weise gelang es LEIBO 1984 ein sogenanntes „One-step-Verfahren“ zu etablieren, bei dem das Kryoprotektivum durch Schütteln des Straws nach dem Auftauen direkt ausverdünnt wurde. Die Embryonen können dadurch, ohne dass eine weitere Manipulation im Labor nötig ist, unmittelbar auf Empfängertiere übertragen werden (LEIBO 1984).
2.3.2. Vitrifikation
Seit der Entwicklung und dem standardmäßigen Einsatz von Kryokonservierungstechniken bei Embryonen wurden immer neue, verbesserte Methoden entwickelt. Die Entwicklung der Vitrifikation gilt als eine zunehmend nennenswerte Alternative zur konventionellen Kryokonservierung (DOBRINSKY 2002). Die Vitrifikation ist ein physikalischer Prozess, bei dem ein flüssiges Medium durch extrem schnelle Kühlraten ohne die Bildung von Eiskristallen in einen amorphen, glasartigen Zustand übergeht (LUYET u. HODAPP 1938). Dadurch können Schäden durch die Bildung intrazellulärer Eiskristalle verringert werden. Ein weiterer Vorteil ist eine Zeitersparnis, die dadurch entsteht, dass die Zellen nicht mehr durch Einfrierautomaten schrittweise heruntergekühlt werden müssen, sondern nach einer Äquilibrierungszeit im Einfriermedium direkt in flüssigen Stickstoff überführt werden können. Des Weiteren entfallen die Kosten für die Anschaffung von Einfrierautomaten, welche zur konventionellen Kryokonservierung benötigt werden (RALL 1987, VAN WAGTENDONK-DE LEEUW et al. 1997). Die erste erfolgreiche Vitrifikation fand 1985 durch RALL und FAHY bei Mäuseembryonen statt. Die Embryonen wurden in einem Schritt in sehr hochkonzentrierten Lösungen äquilibriert, wobei Medien benutzt wurden, denen sowohl penetrierende als auch
nicht-penetrierende Kryoprotektiva zugesetzt waren. Durch VAN-WAGTENDONK-DE LEEUW et al. wurde 1997 zum ersten Mal eine große, vergleichende Versuchsreihe mit vitrifizierten und konventionell kryokonservierten bovinen Blastozysten veröffentlicht. Sie zeigten unter anderem, dass die Vitrifikation eine Methode ist, die auch unter praxisähnlichen Bedingungen keine Reduzierung der Trächtigkeitsraten im Vergleich zu konventionell kryokonservierten Embryonen hervorrief (VAN WAGTENDONK-DE LEEUW et al. 1997).
Laut ARAV et al. wird eine erfolgreiche Vitrifikation durch drei Hauptfaktoren beeinflusst. Diese sind eine genügend hohe Viskosität des Einfriermediums durch hohe Konzentrationen an Kryoprotektiva, das Erreichen möglichst hoher und gleichbleibender Kühl- und Auftauraten und ein möglichst kleines Probenvolumen.
Durch eine genügend hohe Viskosität des Mediums wird verhindert, dass beim Einfrieren der Embryonen in flüssigem Stickstoff Eiskristalle entstehen, welche die Zellmembran und die Zellorganellen schädigen können. Allerdings wird durch die Verwendung von hohen Konzentrationen an Kryoprotektiva die Gefahr der Zellschädigung durch toxische Effekte erhöht. Um diese zu minimieren, werden häufig Gemische aus mehreren Kryoprotektiva verwendet, wodurch die Konzentration der einzelnen Komponenten niedrig gehalten werden kann, die Fähigkeit zur Vitrifikation aber erhalten bleibt. Sowohl die Nutzung möglichst kleiner Probenvolumina als auch möglichst hoher Kühlraten bei der Vitrifikation dienen dazu, das Probenmaterial schnell in einen glasähnlichen Zustand zu überführen (ARAV et al. 2002). Beide Faktoren werden hauptsächlich durch die Wahl des Trägersystems beeinflusst. Dabei zeigt die Verwendung von offenen Trägersystemen wesentlich höhere Kühlraten, da das Probenmaterial in direktem Kontakt mit dem flüssigen Stickstoff steht. Einen limitierenden Faktor für die Kühlraten stellt die Bildung einer isolierenden Dampfschicht um das Probenmaterial dar, wodurch bei offenen Verfahren maximale Kühlraten von ca. 20.000°C/min erreicht werden können (VAJTA et al. 1998). Allerdings konnte durch die Verwendung von Stickstoff, der sich am Übergang vom flüssigen zum festen Aggregatzustand befand und damit eine Temperatur von -210°C aufwies, die Kühlraten auf ca. 53.000°C/min gesteigert werden (YAVIN et al. 2009). Ein weiterer Faktor, der die Qualität vitrifizierter
Embryonen beeinflusst, ist eine schrittweise Äquilibrierung in immer höher konzentrierten Medien vor dem eigentlichen Einfrierprozess. So konnte gezeigt werden, dass Blastozysten, die in vier oder mehr Schritten einer ansteigenden Konzentration an Kryoprotektiva ausgesetzt waren bessere Reexpansionsraten zeigten als solche, die nur zwei Äquilibrierungsschritte durchliefen oder direkt in das Vitrifikationsmedium überführt wurden (KUWAYAMA et al. 1992).
Vergleiche zwischen den Überlebensraten und der Qualität vitrifizierter und konventionell kryokonservierter boviner IVP-Embryonen ergaben, dass die Vitrifikation als Konservierungsmethode gleich gut oder besser geeignet zu sein scheint (MAHMOUDZADEH et al. 1995, KAIDI et al. 2001, DOBRINSKY 2002, VIEIRA et al. 2007, STINSHOFF et al. 2011). Beispielsweise unterschieden sich die Ergebnisse bezüglich der Trächtigkeitsraten beim Übertragen vitrifizierter oder konventionell Kryokonservierter boviner Embryonen nicht voneinander (VAN WAGTENDONK-DE LEEUW et al. 1997). Die Vitrifikation stellt demnach eine praxistaugliche, einfache und effektive Methode für die Kryokonservierung präimplantatorischer Embryonen bei Nutztieren dar.
2.4. Kryoprotektiva
Kryoprotektiva werden in zwei Gruppen eingeteilt: Die penetrierenden Kryoprotektiva, welche in der Lage sind, Zellmembranen zu überwinden und in hohen Konzentrationen Zellen vor Gefrierschäden bei langsamen Kühlraten zu schützen und die nicht-penetrierenden Kryoprotektiva, welche in wesentlich niedrigeren Konzentrationen eingesetzt werden können, jedoch schnellere Einfrierraten benötigen, um einen schützenden Effekt zu haben (MERYMAN 1971). Die erste erfolgreiche Kryokonservierung von Mäuseembryonen erfolgte in einem Gemisch aus phosphate buffered saline (PBS) mit Natriumchlorid (NaCl), BSA, Glukose und Penicillin G, dem PVP als Kryoprotektivum zugesetzt war (WHITTINGHAM 1971).
Als Basismedium für die Kryokonservierung wird meist PBS mit einem Zusatz von BSA oder FCS verwendet (NIEMANN 1991). Diesem Grundmedium werden ein oder mehrere Kryoprotektiva zugesetzt. Bei der Vitrifikation werden meist Gemische aus
penetrierenden und nicht-penetrierenden Kryoprotektiva verwendet, um die Konzentration und damit die Toxizität der Einzelsubstanzen zu verringern.
2.4.1. Penetrierende Kryoprotektiva
Die penetrierenden Kryoprotektiva zeichnen sich dadurch aus, dass sie die Zellmembran überwinden und somit im Inneren der Zelle ihre protektive Wirkung entfalten können. MERYMAN postulierte 1971, dass penetrierende Kryoprotektiva dabei zwei entscheidende Eigenschaften haben müssen. Zum einen müssen sie allgemein in der Lage sein, die Zellmembran zu überwinden, zum anderen dürfen sie in den für die Kryokonservierung benötigten Konzentrationen nicht zelltoxisch sein (MERYMAN 1971). Beim Zusatz von penetrierenden Kryoprotektiva schrumpfen die Zellen zunächst durch Dehydratation. Dies liegt nicht nur an der hyperosmolaren extrazellulären Lösung, sondern auch daran, dass die Zellmembran für Wasser permeabler ist als für die Kryoprotektiva (SCHNEIDER u. MAZUR 1984). Ist ein Gleichgewicht zwischen dem Ausströmen von Wasser und dem Einströmen des Kryoprotektivums erreicht, fängt die Zelle wieder an zu reexpandieren. Eine erfolgreiche Äquilibrierung ist erreicht, wenn die Zelle wieder ihre normale Größe erreicht hat (SCHNEIDER u. MAZUR 1984). Welches penetrierende Kryoprotektivum für eine bestimmte Spezies oder ein bestimmtes Einfrierverfahren am besten geeignet ist, hängt von vielen Faktoren ab. So ist beispielsweise die Zeit, die für eine genügende Äquilibrierung benötigt wird abhängig von Faktoren wie der Spezies, dem embryonalen Entwicklungsstadium, seinem Oberflächen-/Volumen-Verhältnis und der Umgebungstemperatur (LEIBO 1989). Wie schnell ein Kryoprotektivum die Zellmembran überwinden kann, hängt von seiner Permeabilitätskonstante und von der Umgebungstemperatur ab und ist daher für jeden Stoff individuell (SCHNEIDER u. MAZUR 1984). In Versuchen mit Mäuseembryonen wurde festgestellt, dass die Permeabilitätskonstante eines Stoffes mit der Temperatur und mit dem fortgeschrittenen Entwicklungsstadium des Embryos ansteigt, von der Konzentration des Kryoprotektivums jedoch unabhängig ist (SCHNEIDER u. MAZUR 1984). Für die
konventionelle Kryokonservierung und die Vitrifikation von Embryonen werden verschiedene penetrierende Kryoprotektiva eingesetzt.
2.4.1.1. Glyzerin
Glyzerin oder auch Propan-1,2,3-triol ist ein dreiwertiger Alkohol, der eine sowohl farb- als auch geruchslose Substanz darstellt (Abb. 3). Es wurde 1949 zum ersten Mal zur Vitrifikation von Geflügelsperma benutzt (POLGE et al. 1949).
Abbildung 3: Strukturformel Glyzerin
Glyzerin wurde bis in die 90er Jahre häufig als alleiniges Kryoprotektivum bei der konventionellen Kryokonservierung von Rinderembryonen eingesetzt. Es zeichnet sich durch eine langsame Penetrationszeit aus, gilt in hohen Konzentrationen jedoch auch als eine geringfügig toxische Substanz (MERYMAN 1971). Die für die konventionelle Kryokonservierung eingesetzte Konzentration liegt in der Regel zwischen 1 M und 2 M. LEHN-JENSEN verglich 1986 verschiedene Konzentrationen an Glyzerin beim Einfrieren boviner Blastozysten und konnte feststellen, dass eine Konzentration von 0,5 M signifikant schlechtere Überlebensraten erbrachte als Konzentrationen von 1 M oder 1,5 M. (LEHN-JENSEN 1986). Dieses wurde durch KENNEDY et al. (1983) bestätigt, welche bovine Blastozysten in 1 M oder 1,4 M Glyzerin-Lösung einfroren und keine signifikanten Unterschiede erkannten.
NIEMANN verglich 1985 den Einsatz des sogenannten „One-step-Verfahrens“ mit nur einem Äquilibrierungsschritt unter Anwendung von 1,4 M Glyzerin mit der damals üblichen, schrittweisen Äquilibrierung bis zu einer Konzentration von 1,0 M bei bovinen Blastozysten. Er zeigte dabei, dass das „One-step-Verfahren“ zu guten Überlebensraten nach dem Auftauen und zu guten Trächtigkeitsraten führte
(NIEMANN 1985). Bei der Vitrifikation werden, im Gegensatz zur konventionellen Kryokonservierung, meist wesentlich höhere Konzentrationen Glyzerin eingesetzt, um die Fähigkeit, einen glasähnlichen Zustand zu bilden, zu erreichen. Dabei gibt es sowohl die Möglichkeit Glyzerin als alleiniges Kryoprotektivum einzusetzen, als auch es mit anderen Kryoprotektiva zu mischen und so die Einzelkonzentrationen zu senken. Der Vergleich zwischen bovinen Blastozysten, die entweder in 6,5 M Glyzerin oder in einem Gemisch aus 25% Glyzerin und 25% Propylenglycol vitrifiziert wurden, ergab, dass die Überlebensraten zwar gleich gut, die Trächtigkeitsraten jedoch bei der Vitrifikation in 6,5 M Glyzerin höher waren (Tab. 2; VAN WAGTENDONK-DE LEEUW et al. 1995). Der Vergleich zwischen einer Vitrifikationsmethode in 6,5 M Glyzerin und konventioneller Kryokonservierung in 1,5 M Glyzerin ergab keine signifikanten Unterschiede (Tab. 2; VAN WAGTENDONK-DE LEEUW et al. 1997). DONNAY et al. verglichen 1998 zwei Vitrifikationsmethoden, in denen Glyzerin und Ethylenglycol zum Einsatz kamen. So waren die Reexpansions- und Schlupfraten von bovinen Blastozysten nach der Vitrifikation in einem Medium aus 25% Glyzerin und 25% Ethylenglycol deutlich besser als bei der Vitrifikation mit 10% Glyzerin und 40% Ethylenglykol (Tab. 2, DONNAY et al. 1998).
Tabelle 2: Vergleich der Einfrierverfahren und Einfriermedien hinsichtlich Überlebens- (ÜR) und Trächtigkeitsraten (TR, EG = Ethylenglycol, n.u. = nicht untersucht)
Autor Methode Medien ÜR (%) TR (%)
VAN-WAGTENDONK-DE LEEUW et al. (1995)
Vitrifikation 6,5 M Glyzerin 44% 43%
Vitrifikation 25% Glyzerin
25% EG 51% 24%
VAN-WAGTENDONK-DE LEEUW et al. (1997)
Vitrifikation 6,5 M Glyzerin n.u. 44,5%
Konventionelle
Kryokonservierung 1,5 M Glyzerin n.u. 45,1%
DONNAY et al. (1998)
Vitrifikation 25% Glyzerin
25% EG 67% n.u.
Vitrifikation 10% Glyzerin
40% EG 5% n.u.
2.4.1.2. Ethylenglycol
Ethylenglycol (EG; Abb. 4) oder auch Ethan-1,2-diol hat im Vergleich zu den anderen aufgeführten penetrierenden Kryoprotektiva ein sehr geringes Molekulargewicht und kann daher schneller durch die Zellmembran diffundieren. Es gilt auch in hohen Konzentrationen und bei direkter Äquilibrierung im konzentrierten Medium als ein Kryoprotektivum mit geringer Toxizität (MAMOUDZADEH et al. 1993).
Abbildung 4: Strukturformel Ethylenglycol
Seine kryoprotektive Wirkung wurde zuerst durch MIYAMOTO und ISHIBASHI (1977) bei der konventionellen Kryokonservierung von Mäuse- und Rattenembryonen untersucht. Sie benutzten EG als alleiniges Kryoprotektivum in relativ niedrigen Konzentrationen von 1,2 M zur Kryokonservierung von Mäuseembryonen im 8-Zell-Stadium und erreichten damit nach dem Auftauen und der weiteren Kultur Blastozystenraten von 76-85% (MIYAMOTO u. ISHIBASHI 1977). Beim Rind wurden Konzentrationen von 1,5 M EG ebenfalls als sehr effektiv getestet. VOELKEL und HU verglichen 1992 die Wirkung von 1,5 M EG, Dimethylsulfoxid (DMSO), Glyzerin und Propylenglycol (PG) bei der konventionellen Kryokonservierung boviner Embryonen. Hier zeigt sich deutlich, dass durch EG die besten Überlebensraten erzielt werden konnten (Tab 3;VOELKEL u. HU 1992).
Tabelle 3: Entwicklungsraten boviner Embryonen nach konventionellem Kryokonservieren mit verschiedenen Kryoprotektiva (VOELKEL u. HU 1992)
Kryoprotektivum Konzentration Entwicklungsraten
Ethylenglykol 1,5 M 70%
Glyzerin 1,5 M 30%
Propylenglykol 1,5 M 11%
Dimethylsulfoxid 1,5 M 25%
KASAI et al. zeigten 1990 durch Toxizitätstest mit verschiedenen Kryoprotektiva, dass EG auch in hohen Konzentrationen als alleiniges Kryoprotektivum eingesetzt werden kann. Dabei wurden beim Einsatz von 30% und 40% EG gute Blastozystenraten ermittelt. Wie in Tabelle 4 ersichtlich, konnten auch beim Einsatz von 30% Glyzerin gute Raten erzielt werden, die Raten bei der Verwendung von PG waren im Vergleich dazu schlecht (Tab. 4; KASAI et al. 1990).
Tabelle 4: Blastozystenraten nach Vitrifikation von Mäusemorulae in Medien mit verschiedenen Konzentrationen an Kryoprotektiva (n.u. = nicht untersucht)
Konzentration 30% 40% 50%
Kryoprotektivum Blastozystenrate (%)
Ethylenglykol 98% 84% 0%
Glyzerin 88% 3% n.u.
Propylenglykol 16% 0% n.u.
Auch SOMMERFELD und NIEMANN konnten 1999 zeigen, dass Ethylenglycol erfolgreich in hohen Konzentrationen zur konventionellen Kryokonservierung und zur Vitrifikation von in vitro produzierten Rinderembryonen eingesetzt werden kann. So zeigten sich bei der konventionellen Kryokonservierung die besten Schlupfraten bei 3,6 M EG (81%), bei der Vitrifikation konnten mit einer schrittweisen Äquilibrierung in
3,6 M EG und 7,2 M EG Schlupfraten von 42% erreicht werden (SOMMERFELD u.
NIEMANN 1999). In vorherigen Toxizitätstest wurden sogar Schlupfraten von 93%
bei bovinen Blastozysten erreicht. Bei diesen Toxizitätstests wurden die Blastozysten zwar nur dem Medium ausgesetzt und nicht vitrifiziert, es konnte allerdings deutlich gezeigt werden, dass EG auch in hohen Konzentrationen nur gering zelltoxisch wirkt (SOMMERFELD 1997). Gute Überlebensraten konnten nicht nur durch den alleinigen Einsatz von EG bei der Vitrifikation, sondern auch in Verbindung mit anderen, nicht-penetrierenden Kryoprotektiva erreicht werden. Dies wurde zuerst durch KASAI et al. 1990 gezeigt, welche bei der Vitrifikation von Mäusemorulae durch 40% EG in Verbindung mit Ficoll und Saccharose Entwicklungsraten zur Blastozyste von 97-98% dokumentierten (KASAI et al. 1990). TACHIKAWA et al.
benutzten 1993 die Kombination verschiedener penetrierender Kryoprotektiva mit Ficoll und Saccharose auch zur Vitrifikation boviner Blastozysten. Dabei zeigten sich ähnliche Ergebnisse wie bei den Mäuseembryonen, wobei EG und Glyzerin in dieser Kombination am besten geeignet waren und die Entwicklungsraten bei PG am schlechtesten ausfielen (TACHIKAWA et al. 1993; Tab. 8). Die Kombination aus EG, Ficoll und Saccharose (EFS) schien demnach auch für die Vitrifikation boviner Blastozysten sehr gut geeignet zu sein, was durch mehrere Autoren bestätigt werden konnte. MAMOUDZADEH et al. zeigten 1995, dass die Entwicklungraten durch eine schrittweise Äquilibrierung noch gesteigert werden konnten. Sie benutzten für den ersten Äquilibrierungsschritt 20% EFS, für den zweiten Schritt 40% EFS und erreichten damit bei der Vitrifikation von expandierten Blastozysten Schlupfraten von 89% nach dem Auftauen (MAMOUDZADEH et al. 1995). MARTINEZ et al. verglichen 1998 den Einsatz einer zweischrittigen EFS-Methode (2EFS) mit einer dreischrittigen (3EFS) und einer Kombination aus EG und Glyzerin. Dabei ergaben sich bei der dreischrittigen Methode bessere Schlupfraten als bei der zweischrittigen (Tab. 5), allerdings waren die Entwicklungsraten bei der Kombination von EG mit Glyzerin ebenfalls gut und es wurden sogar höhere Trächtigkeitsraten als bei der EFS-Methode erzielt.
Tabelle 5: Schlupf- und Trächtigkeitsraten boviner in vitro produzierter Embryonen bei verschiedenen Einfriermethoden (MARTINEZ et al. 1998)
Kryoprotektiva Schlupfraten Trächtigkeitsraten 2EFS 35,7% Nicht getestet
3EFS 57,7% 35,2%
EG + Glyzerin 59,6% 43,7%
Neben dem Einsatz von EG in Verbindung mit Ficoll und Saccharose gab es noch andere Versuche, EG mit verschiedenen nicht-penetrierenden Kryoprotektiva zu kombinieren. SAHA et al. (1996) benutzten beispielsweise erfolgreich eine Kombination aus EG mit Trehalose und PVP und erreichten damit bessere Schlupfraten als bei alleinigem Einsatz von EG oder einer Kombination aus EG mit Trehalose (Tabelle 6).
Tabelle 6: Schlupfraten in vitro produzierter boviner Embryonen bei der Verwendung verschiedener Kryoprotektiva (SAHA et al. 1996, EG = Ethylenglycol, PVP = Polyvinylpyrrolidon)
Kryoprotektiva Schlupfraten
40% EG 19,6%
40% EG + 11,3% Trehalose 42,5%
40% EG + 11,3% Trehalose + 20% PVP 68,2%
Eine Vitrifikation mit EG scheint demnach in der Kombination mit anderen penetrierenden und nicht-penetrierenden Kryoprotektiva am effektivsten zu sein.
2.4.1.3. Dimethylsulfoxid
Dimethylsulfoxid (Abb. 5) ist eine farblose Substanz mit analgetischen und antiphlogistischen Eigenschaften, die sehr schnell durch die Haut und durch
Zellmembranen diffundieren kann und wird daher in der Medizin häufig allein oder als Trägersubstanz bei dermalen Applikationen genutzt.
Abbildung 5: Strukturformel Dimethylsulfoxid
Als Kryoprotektivum wurde DMSO zum ersten Mal bei humanen und bovinen Erythrozyten sowie bei Bullensperma eingesetzt (LOVELOCK u. BISHOP 1959).
Dabei ergab sich im Vergleich zu Glyzerin eine wesentlich schnellere Permeabilitätszeit. Das Medium mit DMSO konnte seine kryoprotektive Wirkung auf bovine Erythrozyten bereits nach 30 Sekunden entfalten, wogegen Glyzerin in diesen Versuchen keine ausreichend kryoprotektive Wirkung zeigte (LOVELOCK u. BISHOP 1959). Eine schnelle und vollständige Penetration ist laut MERYMAN entscheidend für die erfolgreiche Schutzwirkung von DMSO bei der Kryokonservierung (MERYMAN 1971, MERYMAN et al. 1977). Trotz seiner exzellenten kryoprotektiven Eigenschaften zeigt sich, dass DMSO, wenn es in hohen Konzentrationen und bei einer langen Äquilibrierungszeit eingesetzt wird, zytotoxisch wirken kann. MALININ konnte verschiedene Zellschäden an Nierenzellen, welche für zehn Minuten einer 7,5%igen DMSO-Lösung ausgesetzt waren, nachweisen (MALININ 1973). Bei Mäuseoozyten verursachte die Äquilibrierung in DMSO Veränderungen in der Mikrofilamentstruktur und gesteigerte Chromosomendegenerationen (VINCENT et al.
1990, BOUQUET et al. 1995). Trotz der toxischen Eigenschaften wird DMSO häufig in Verbindung mit anderen Kryoprotektiva zur Kryokonservierung von Embryonen verwendet.
Zur konventionellen Kryokonservierung von bovinen Embryonen wurde DMSO bereits 1978 eingesetzt. WILLADSEN et al. verwendeten in ihren Versuchen eine schrittweise Äquilibrierung in 0,5 M, 1 M und 1,5 M DMSO-Lösung und erreichten
damit Trächtigkeitsraten von bis zu 67% (WILLADSEN et al. 1978). Die Konzentration von 1,5 M DMSO lieferte für die konventionelle Kryokonservierung sehr gute Ergebnisse. Auch TROUNSON et al. benutzten eine solche Konzentration zur Konservierung boviner Blastozysten und erreichten Entwicklungsraten von 50-56% und Trächtigkeitsraten von 39-45% (TROUNSON et al. 1978). BILTON verglich den Einsatz einer 1,5 M DMSO-Lösung mit einer 1 M Glyzerin-Lösung zur konventionellen Kryokonservierung boviner Blastozysten und konnte dabei keine signifikanten Unterschiede in den Entwicklungs- und Trächtigkeitsraten erkennen (BILTON 1980).
Zur Vitrifikation von Embryonen ist DMSO aufgrund seiner ausgeprägten Fähigkeit zur Bildung eines glasähnlichen Zustandes sehr gut geeignet (FRIEDLER et al.
1988, VALDEZ et al. 1992). Meist kommt es dabei in Verbindung mit anderen Kryoprotektiva zum Einsatz. Seine guten kryoprotektiven Eigenschaften wurden schon bei der ersten erfolgreichen Vitrifikation von Mäuseembryonen in Verbindung mit EG und Glycerin genutzt (RALL u. FAHY 1985). ISHIMORI et al. verwendeten 1993 ebenfalls eine Kombination aus DMSO und EG, dabei wurde eine zweistufige Äquilibrierung, zunächst in 12,5% DMSO mit 12,5% EG und danach in 25% DMSO mit 25% EG, benutzt. Da beide Kryoprotektiva eine sehr schnelle Penetrationszeit aufweisen, benötigen sie relativ kurze Äquilibrierungszeiten, um ihre protektive Wirkung zu entfalten. ISHIMORI et al. (1993) verglichen in diesem Zusammenhang Zeitspannen im ersten Medium von ein, zwei und fünf Minuten und konnten nachweisen, dass die Entwicklungsraten bei kurzen Äquilibrierungszeiten signifikant höher ausfielen (Tab. 7).
Tabelle 7: Ergebnisse der Entwicklungsraten boviner Blastozysten bei verschiedenen
Äquilibrierungszeiten im 1. Medium (12,5% DMSO + 12,5% EG) und 30 s im 2. Medium (25% DMSO + 25% EG; ISHIMORI et al. 1993)
Zeit im 1. Medium Zeit im 2. Medium Entwicklungsraten
Versuch 1 1 min 30 s 85%
Versuch 2 2 min 30 s 73%
Versuch 3 5 min 30 s 20%
VIEIRA et al. verwendeten 2007 ebenfalls die Kombination aus DMSO und EG und verglichen dieses Vitrifikationsmedium mit einem Medium aus EG, Saccharose und PVA. Bei beiden Verfahren konnten vergleichbar gute Reexpansionsraten nach dem Auftauen von 94,8% für die Methode mit DMSO und 84,5% für die Methode ohne DMSO erreicht werden, die Schlupfraten waren bei der Methode mit DMSO jedoch signifikant besser (75,8% im Vergleich zu 55,2%). Die Trächtigkeitsraten unterschieden sich in diesen Versuchen nicht (VIEIRA et al. 2007).
Trotz solch guter Ergebnisse wird der Einsatz von DMSO als Kryoprotektivum zur Vitrifikation immer wieder kontrovers diskutiert. Aufgrund der toxischen Wirkung kommt DMSO bei der Vitrifikation fast ausschließlich als Gemisch mit anderen Kryoprotektiva zum Einsatz. Außerdem wurden für die Vitrifikation DMSO-freie Medien entwickelt, um auf den Einsatz von DMSO als Kryoprotektivum verzichten zu können. STACHECKI et al. entwickelten eine einfache Vitrifikationsmethode unter Verwendung von Glyzerin und EG und erreichten Überlebensraten von 96,1% bei bovinen expandierten und bovinen geschlüpften Blastozysten. Einen direkten Vergleich mit einem DMSO-haltigen Medium gab es allerdings nicht (STACHECKI et al. 2008). Vergleiche zwischen Vitrifikationsmedien mit und ohne DMSO, wie sie beispielsweise durch VIEIRA et al. bei bovinen Blastozysten durchgeführt wurden, sind auch im Bereich der humanen Reproduktionsmedizin zu finden. So verglichen ISACHENKO et al. (2005) Maturationsraten humaner Oozyten, welche zuvor durch DMSO in Kombination mit EG oder nur durch EG vitrifiziert wurden und erreichten bei der Vitrifikation mit DMSO signifikant höhere Reifungsraten. KARTBERG et al.
benutzten 2008 ein Vitrifikationsmedium mit DMSO, PG und EG im Vergleich zur Vitrifikation in PG und EG bei humanen Embryonen sowie Mäuseembryonen und konnten keine Unterschiede in den Entwicklungsraten feststellen (KARTBERG et al.
2008).
2.4.1.4. Propylenglycol
Propylenglycol (PG, Abb. 6) oder auch 1,2-Propandiol ist wie EG ein zweiwertiger Alkohol, der, wie alle penetrierenden Kryoprotektiva, stark hygroskopische Eigenschaften aufweist.
Abbildung 6: Strukturformel Propylenglycol
Die Toxizität von PG gilt im Vergleich zu EG als gering, die Fähigkeit, einen glasähnlichen Zustand zu bilden, ist bei PG allerdings noch höher als bei DMSO oder Glyzerin (RENARD u. BABINET 1984). BOUTRON u. KAUFMANN untersuchten 1979 die Stabilität wässriger Lösungen verschiedener Kryoprotektiva, wenn sie bei niedrigen Temperaturen in eine komplett amorphe Phase übergehen. Dabei zeigte sich, dass die PG-Lösung im Gegensatz zu DMSO- und EG-Lösungen eine wesentlich größere Stabilität aufwies. Es wurde vermutet, dass ein Zusammenhang zwischen der Stabilität und den kryoprotektiven Eigenschaften der Substanzen besteht, so dass PG demnach eine gute Schutzwirkung aufweisen müsste. Die Versuche wurden allerdings mit rein wässrigen Lösungen durchgeführt, welche nicht, wie zum Beispiel die heutzutage benutzten Vitrifikationslösungen, Proteinzusätze wie BSA oder FCS aufwiesen (BOUTRON u. KAUFMANN 1979).
Zur konventionellen Kryokonservierung von Mäuseembryonen scheint PG als alleiniges Kryoprotektivum gut geeignet zu sein. So erreichten RENARD u. BABINET (1984) bei einer Verwendung von 1,5 M PG Blastozystenraten von 88,1. Auch beim Rind konnten gute Ergebnisse bei der konventionellen Kryokonservierung von Blastozysten erzielt werden. Bei der Verwendung von 1,6 M PG-Lösung wurden Überlebensraten von 72-89% und Trächtigkeitsraten von bis zu 61% erreicht
(SUZUKI et al. 1990). Andere Autoren hingegen erzielten weit schlechtere Ergebnisse bei bovinen Embryonen. VOELKEL u. HU verglichen 1992 1,5 M Lösungen verschiedener Kryoprotektiva bei der konventionellen Kryokonservierung von bovinen Blastozysten und erreichten bei der Verwendung von PG Entwicklungsraten von nur 11% (Tab. 3; VOELKEL u. HU 1992). DOCHI et al.
ermittelten 1998 Trächtigkeitsraten nach dem Direkttransfer konventionell kryokonservierter, in vivo generierter boviner Morulae und Blastozysten. Sie verglichen zwei verschiedene Einfriermethoden unter Verwendung von 1,6 M PG oder 1,8 M EG und zeigten ebenfalls, dass die Trächtigkeitsraten unter Nutzung von PG niedriger waren. Sie lagen bei 36% im Vergleich zu 44,7% bei der Verwendung von EG (DOCHI et al. 1998).
Trotz der guten glasbildenden Eigenschaften und der Tatsache, dass die Stabilität von PG-Lösungen im amorphen Zustand sehr gut ist (BOUTRON u. KAUFMANN 1979), wurden bei der Verwendung von PG in Vitrifikationslösungen sowohl für die Maus als auch für das Rind eher schlechte Überlebensraten ermittelt. KASAI verglich 1990 den Einsatz 30-50%iger Lösungen verschiedener penetrierender Kryoprotektiva bei der Vitrifikation von Maus-Morulae. Wie in Tab. 4 ersichtlich, konnten bei der Verwendung von 30%iger PG-Lösung Blastozystenraten von nur 16% erreicht werden. Beim Einsatz einer 40%igen PG-Lösung wurden keine überlebenden Blastozysten mehr ermittelt, was dazu führte, dass die Verwendung einer 50%igen PG-Lösung nicht mehr untersucht wurde (KASAI et al 1990). Bei bovinen Blastozysten ermittelten TACHIKAWA et al. ebenfalls wesentlich schlechtere Entwicklungsraten bei der Verwendung von PG im Vergleich zu EG und Glyzerin. Sie benutzten ein Gemisch aus 40 % des jeweiligen penetrierenden Kryoprotektivums in Kombination mit 30% Ficoll und 0,5 M Saccharose und bewerteten die Reexpansions- und Schlupfraten nach dem Auftauen. Des Weiteren wurden in diesem Versuch Äquilibrierungszeiten von zwei, fünf und zehn Minuten verglichen, die Ergebnisse sind in Tab. 8 dargestellt (TACHKAWA et al. 1993).
Tabelle 8: Reexpansions- (ReexR) und Schlupfraten (SR) boviner Blastozysten nach Vitrifikation durch verschiedene penetrierende Kryoprotektiva (EG, Glyzerin und PG) in Kombination mit Ficoll und
Saccharose (TACHIKAWA et al. 1993)
Äquilibrierungszeiten 2 min. 5 min. 10 min.
Kryoprotektiva ReexR SR ReexR SR ReexR SR EG + Ficoll + Saccharose 90% 73% 14% 4% 0% 0%
Glyzerin + Ficoll + Saccharose 94% 81% 68% 52% 37% 17%
PG + Ficoll + Saccharose 31% 24% 0% 0% 0% 0%
Es zeigt sich, dass, auch in Kombination mit nicht-penetrierenden Kryoprotektiva, PG als Schutzmittel für die Vitrifikation boviner Blastozysten eher ungeeignet zu sein scheint.
2.4.2. Nicht-penetrierende Kryoprotektiva
Nicht-penetrierende Kryoprotektiva zeichnen sich dadurch aus, dass sie ihre protektive Wirkung im Extrazellularraum entfalten, da sie aufgrund ihrer Molekulargröße die Zellmembran nicht frei überwinden können. Für die Kryokonservierung lebender Zellen werden unter anderem Zucker und verschiedene Makromoleküle wie PVP, PVA oder Ficoll verwendet. Sie können ihre Schutzwirkung schon in geringen Konzentrationen erreichen und gelten damit als weniger toxisch als penetrierende Kryoprotektiva (NIEMANN 1991). Ihre Wirkung beruht auf einer Erhöhung der extrazellulären Osmolarität, wodurch die Zellen eine geringere Zeitspanne benötigen, um den für den Einfriervorgang erforderlichen Dehydrierungsgrad zu erreichen. Dies hat den positiven Effekt, dass die Zellen den toxischen Medien weniger lange ausgesetzt sein müssen (LIEBERMANN u.
TUCKER 2002). Nicht-penetrierende Kryoprotektiva werden daher in der Regel bei hohen Einfrierraten eingesetzt, um eine schnelle Dehydrierung zu erreichen (MERYMAN 1971). Des Weiteren kommen sie in der Auftauphase zum Einsatz. Hier verhindern sie ein zu schnelles Anschwellen durch die Diffusion von Wasser in die
Zelle und ermöglichen eine gute Ausschleusung der penetrierenden Kryoprotektiva aus den Zellen (NIEMANN 1991).
2.4.2.1. Zucker
Bei den für die Kryokonservierung verwendeten Zucker handelt es sich hauptsächlich um Disaccharide wie Saccharose und Trehalose (Abb. 7), welche mit einem Molekulargewicht von >340 g/mol Zellmembranen nicht überwinden können. Sie werden am häufigsten in Auftaumedien verwendet.
Abbildung 7: Strukturformeln von Saccharose (links) und Trehalose (rechts)
Werden Zellen aufgetaut, enthalten sie meist sehr hohe Konzentrationen penetrierender Kryoprotektiva, welche schnell aus der Zelle entfernt werden müssen, da sie durch die steigenden Temperaturen an Toxizität gewinnen (NIEMANN 1991).
Bei der Verwendung einer isotonen PBS-Lösung kommt es durch die Hyperosmolarität des Intrazellularraumes zu einem schnellen Einstrom von Wasser, da Wasser einfacher in die Zelle penetrieren kann als die Kryoprotektiva heraus kommen. Um ein extremes Anschwellen der Zellen zu verhindern, werden dem Auftaumedium Zucker hinzugefügt, welche als osmotischer Puffer dienen und dadurch die Überlebensraten der Zellen steigern können (NIEMANN 1991, MCWILLIAMS et al. 1995). Bei der konventionellen Kryokonservierung werden solche Auftaumedien häufig direkt beim Einfrieren in den Straw mit aufgezogen.
Dadurch können die Medien beim Auftauen schon im Straw vermischt und die
