Tierärztliche Hochschule Hannover
Untersuchungen zu den Effekten einer verkürzten Inkubationsdauer mit Glyzerin und der Zugabe des bovinen Seminalplasmaproteins A1/A2
(BSP-A1/A2) vor der Kryokonservierung auf die Qualität und Fertilität boviner Spermien
INAUGURAL – DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von Vendula Bernet
geb. Šimková
Planá (Tschechische Republik)
Hannover 2013
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Heinrich Bollwein Klinik für Rinder
Tierärztliche Hochschule Hannover
1. Gutachter: Prof. Dr. Heinrich Bollwein
2. Gutachter: Prof. Dr. Anne-Rose Günzel-Apel
Tag der mündlichen Prüfung: 22.11.2013
Die Arbeit wurde durch Mittel des Dr. Dr. h. c. Karl- Eibl Stiftung gefördert.
Meinen Eltern und mir
Inhaltsverzeichnis:
1. EINLEITUNG ... 1
2. LITERATURÜBERSICHT ... 3
2.1 Auswirkungen einer verkürzten Glyzerineinwirkungszeit auf die Qualität von Bullensperma ... 3
2.1.1 Bedeutung des Glyzerins bei der Kryokonservierung ... 3
2.1.1.1 Ursachen für Gefrierschäden ... 3
2.1.1.2 Kryoprotektive Effekte des Glyzerins ... 4
2.1.2 Nachteilige Effekte des Glyzerins ... 6
2.1.2.1 Osmotischer Stress ... 7
2.1.2.2 Biochemische Wirkung ... 10
2.2 Effekte der Zugabe von BSP-A1/A2 zum nativen Ejakulat ... 15
2.2.1 Bedeutung von Seminalplasma ... 15
2.2.1.1 Charakteristik, molekulare Struktur und Vorkommen der Fibronektin Typ II Proteine ... 15
2.2.1.2 Biologische Bedeutung von BSP-A1/A2 für die Befruchtung ... 17
2.2.2 Rolle von BSP während des Kryokonservierungsprozesses... 20
2.3 Zusammenhänge zwischen den spermatologischen Parametern und der Fertilität.. 22
3. MATERIAL UND METHODEN ... 26
3.1 Material ... 26
3.1.1 Versuchstiere und Samenproben ... 26
3.2 Versuchsaufbau ... 27 3.2.1 Auswirkungen einer verkürzten Glyzerineinwirkungszeit auf die Qualität
3.2.2 Effekte der Zugabe von BSP-A1/A2 zum nativen Ejakulat... 29
3.3 Methoden ... 30
3.3.1 Durchflusszytometer ... 30
3.3.2 Bestimmung der Integritäten der Plasmamembran und des Akrosoms, In- duzierbarkeit der Akrosomreaktion ... 31
3.3.3 Bestimmung des Mitochondrienmembranpotentials ... 32
3.3.4 Bestimmung der DNA Integrität ... 34
3.3.5 Bestimmung der Überlebensrate in hypoosmotischem Medium ... 36
3.3.6 Computergestützte Motilitätsanalyse ... 38
3.3.7 Morphologie ... 40
3.3.8 Seminalplasmagewinnung ……... 40
3.4 Statistik ... 40
4. ERGEBNISSE ... 42
4.1. Auswirkungen einer verkürzten Glyzerineinwirkungszeit auf die Qualität von Bullensperma ... 42
4.1.1 Durchflusszytometrische Untersuchungen und Motilitätsanalyse ... 42
4.1.2 Besamungsergebnisse ... 46
4.2. Effekte der Zugabe von BSP-A1/A2 zum nativen Ejakulat... 47
4.2.1 Vorversuchsergebnisse ... 47
4.2.2 Hauptversuchsergebnisse ... 50
4.2.2.1 Durchflusszytometrische Untersuchungen und Motilitätsanalyse ... 50
4.2.2.2 Besamungsergebnisse ... 56
5. DISKUSSION ………... 57
5.1. Auswirkungen einer verkürzten Glyzerineinwirkungszeit auf die Qualität von Bullensperma ………. 57
5.2. Effekte der Zugabe von BSP-A1/A2 zum nativen Ejakulat... 61
6. ZUSAMMENFASSUNG ... 66
7. SUMMARY ... 69
8. LITERATURVERZEICHNIS ... 72
9. ANHANG ... 90
9.1. Chemikalien, Medien und Fluorochrome ... 90
9.1.1 Tyrode-Medium ... 90
9.1.2 HBS-Medium (hepes buffered solution) ……….. 90
9.1.3 Herstellung von Fixierlösung (1% Formol-pNaCl Lösung) ... 91
9.1.4 TNE-Puffer ... 91
9.1.5 Säuredetergenzlösung pH 1,2... 91
9.1.6 Acridinorange ... 92
9.2 Sperm Vision ... 93
9.2.1 Motilitätsklassifizierung ... 93
9.3 Morphologische Klassifizierung ... 94
9.4 Isolierung von BSP-A1/A2... 94
9.5 Individuelle Besamungsergebnisse (NRR90) ... 98
9.6 Parameter der einzelnen Bullen im Versuch 2 ... 99
9.7 Abkürzungsverzeichnis ... 103
Erklärung ... 105
Danksagung ... 106
1. EINLEITUNG
Die künstliche Besamung ist eine der wichtigsten Techniken in der Rinderproduktion, wobei vorwiegend gefrierkonserviertes Sperma eingesetzt wird.
Trotz der Anwendung moderner Techniken zur Kryokonservierung liegt die Überlebensrate der Spermien nach dem Auftauen jedoch nur knapp über 50% (VISHWANATH u.
SHANNON 2000). Dies liegt daran, dass während der Kryokonservierung und des Auftauens verschiedene Stressfaktoren auf die Spermien einwirken. Neben den Temperaturver- änderungen und der Formation von Eiskristallen spielt der osmotische Stress durch die Zuga- be der Kryoprotektiva eine wichtige Rolle (WATSON 2000, MEDEIROS et al. 2002). Auch das Kryoprotektivum Glyzerin hat in den für den Gefrierprozess erforderlichen Konzentratio- nen schädliche Effekte auf die Spermien (FAHY 1986). Aufgrund der nachteiligen Effekte des Glyzerins wird beim Gefrierkonservierungsverfahren bisweilen eine zweistufige Verdün- nungsmethode eingesetzt. Hierbei wird Glyzerin nicht sofort bei der ersten Verdünnung des Spermas, sondern erst später zugegeben. Dadurch wird die Einwirkungszeit verkürzt und der osmotische Stress reduziert. Eine Einwirkzeit des Glyzerins von 30 Minuten auf die Spermien vor dem Einfrieren soll bereits einen ausreichenden Schutz bei der Kryokonservierung ge- währleisten (ROTHE et al. 2009).
Es sollte in der vorliegenden Arbeit getestet werden, ob durch eine verkürzte Inkubationsdau- er in glyzerinhaltigem Verdünner und eine modifizierte Glyzerinzugabe die Spermaqualität verbessert werden kann. Das kryokonservierte Sperma wurde anschließend in der Besamung eingesetzt.
Die bovinen Seminalplasmaproteine (BSP = Bovine Seminalplasma Proteine) gehören zu den am intensivsten untersuchten Proteinen des männlichen Genitaltraktes. Die BSP-A1/A2, BSP- A3 und BSP-30kDa, die jeweils zwei hintereinander verknüpfte Fibronektin- Typ-2 Domänen aufweisen, machen bis zu 60% des Gesamtproteingehaltes des Seminalplasmas aus (MANJUNATH u. SAIRAM 1987) und spielen eine entscheidende Rolle beim Befruchtungs- vorgang. So moduliert die Interaktion dieser Proteine mit der Spermienmembran die Memb- raneigenschaften und induziert dabei Signale, die zur Kapazitation führen. Des Weiteren sind die BSP an der Etablierung der Spermienreservoirs im weiblichen Genitaltrakt beteiligt (IGNOTZ et al. 2001).
Im Verlauf des Kryokonservierungsprozesses konnten positive Effekte dieser Proteine auf die Plasmamembran und die Motilität Spermien beobachtet werden (BARRIOS et al. 2005, LEAHY et al. 2009). Ferner gibt es Hinweise darauf, dass BSP-A1/A2 einen regulierenden Effekt auf die Kontrolle des Zellvolumens der reifenden Spermien hat (SAHIN et al. 2009).
Da eine signifikante Abnahme der BSP nach dem Auftauen beobachtet wurde, wird eine Ver- besserung der Kryokonservierbarkeit der Spermien durch die Zugabe von BSP zum Sperma vermutet (NAUC u. MANJUNATH 2000, JOBIM et al. 2004). Demgegenüber stehen Stu- dien, die bei einer längeren Inkubation von Spermien mit BSP eine Destabilisation der Plas- mamembran beobachtet haben (WAY et al. 2000, BERGERON et al. 2004).
Das Ziel des zweiten Versuchs war, den Effekt von BSP-A1/A2 hinsichtlich Kryokonservier- barkeit boviner Spermien zu testen sowie einen Einfluss auf die Fertilität zu überprüfen.
2. LITERATURÜBERSICHT
2.1 Auswirkungen einer verkürzten Glyzerineinwirkungszeit auf die Qualität von Bullensperma
2.1.1 Bedeutung des Glyzerins bei der Kryokonservierung
Zur erfolgreichen Gefrierkonservierung benötigen die meisten Zellarten die Anwesenheit ei- ner spezifischen Gefrierschutzsubstanz. Viele Komponenten wurden als Gefrierschutzmittel für männliche Samenzellen getestet, aber das Kryoprotektivum Glyzerin ist nach wie vor das Mittel der Wahl (SHERMAN 1964, WILMUT u. POLGE 1977, JEYENDRAN u. GRAHAM 1980, HOLT 2000a, AWAD 2011).
Um die Wirkungsweise des Glyzerins besser nachvollziehen zu können, erscheint es sinnvoll, zunächst auf die Entstehungsmechanismen gefrierbedingter Schäden einzugehen.
2.1.1.1 Ursachen für Gefrierschäden
Zu den Mechanismen, die für den Zelltod verantwortlich sind, gehören die Veränderungen im Wassergehalt und in der Elektrolytkonzentration während des Einfrierens und Auftauens der Zellen (MAZUR et al. 1972, WEITZE 1977).
MAZUR et al. (1972) stellten die Hypothese auf, dass abhängig von der Gefriergeschwindig- keit zwei Mechanismen für die Zellschäden verantwortlich sind. Im Falle einer langsamen Abkühlgeschwindigkeit kommt es infolge der Eisbildung zu einem Anstieg der Konzentration der gelösten Stoffe im extrazellulären Raum. Dies führt zur Dehydratation der Zellen, denn das Wasser strömt dem osmotischen Gradienten entsprechend in den extrazellulären Raum, um das Gleichgewicht wieder herzustellen. Die Konzentration der intrazellulären Lösungen steigt infolgedessen an, es kommt zu Änderungen im pH Wert sowie zu einer Sättigung und Präzipitation der Salze (MAZUR 1970). Dieser Vorgang wurde schon 1953 an humanen Erythrozyten beobachtet und als Lösungseffekt bezeichnet (LOVELOCK 1953a). Erfolgt die
lassen, so dass es zu einer intrazellulären Kristallisation kommt. Der mechanische Schaden durch Eiskristalle führt zur Ruptur der Plasmamembran und der Membranen intrazellulärer Organellen (MAZUR 1977).
Daneben spielt auch die Interaktion zwischen den extrazellulären Eiskristallen und den Zellen im Gefriergut möglicherweise eine Rolle bei der Zellschädigung während des Einfrierens.
Durch die Bildung der Eiskristalle entstehen Kanäle der ungefrorenen Wasserfraktion, in de- nen die Zellen verbleiben. MAZUR und RIGOPOULOS (1983) haben auf einen positiven Zusammenhang zwischen der Überlebensrate von Erythrozyten und dem Anteil des ungefro- renen Wassers hingewiesen. Eine weitere Abkühlung verursacht einen Größezuwachs der Kristalle, so dass es zu starken physikalischen Interaktionen zwischen Eiskristallen und Zellen kommen kann. Der progressive Anstieg der Elektrolytkonzentration in ungefrorenen Berei- chen führt zwar zu einer Zellschrumpfung; jedoch sind diese interzellulären Bereiche für das Überleben der Zellen von entscheidender Bedeutung (MAZUR u. RIGOPOULOS 1983, MAZUR u. COLE 1989). MERYMAN (1971b) postulierte aufgrund seiner Versuche, dass nicht die absolute Elektrolytkonzentration für Zellmembranschäden verantwortlich ist, son- dern das kritische minimale Zellvolumen. Dieses Volumen wird erreicht, wenn kein Wasser mehr aus den Zellen austreten kann. Anschließend baut sich eine osmotische Druckdifferenz auf, die eine Veränderung der Membranpermeabilität zur Folge hat.
2.1.1.2 Kryoprotektive Effekte des Glyzerins
Glyzerin (Glycerin, auch Glycerol) ist der Trivialname von Propantriol bzw. Propan-1,2,3- triol. Es handelt sich um einen dreiwertigen Alkohol. Seine chemische Formel lautet
OH CH CHOH OH
CH2 − − 2 , das Molekulargewicht beträgt 92,10 g/mol.
Glyzerin ist eine farb- und geruchslose, bei Raumtemperatur visköse und hygroskopische Flüssigkeit. Es ist mischbar mit Wasser und Ethanol, aber in Diethylether weniger löslich.
Seinen Namen verdankt es seinem süßlichen Geschmack (griechisch glykýs = süß) und seiner Viskosität (lateinisch cera = Wachs). Glyzerin ist nicht nur in den meist Elektrolyt- und Nichtelektrolyten löslich, sondern besitzt selbst Lösungsmittelcharakter. Für reines Glyzerin beträgt die Kristallisationsrate bei einer Temperatur von -43°C weniger als 10−4 mm pro Mi-
nute; diese Eigenschaft führt zu einer erhöhten Viskosität in Verbindung mit dem Tempera- turrückgang. Während des Gefrierens der wässrigen Glyzerinlösung kristallisiert reines Was- ser aus und die molare Konzentration des Glyzerins steigt an (BAUST 1973).
Die Entdeckung der Schutzwirkung des Glyzerins war ein wichtiger Durchbruch bei der Tief- gefrierung von Spermatozoen (POLGE et al. 1949). Eine Vielzahl von Studien, die sich mit der protektiven Wirkung von Glyzerin befasste, folgte. Laut LOVELOCK und POLGE (1954) basiert die protektive Wirkung des Glyzerins auf seinem „Salzpuffer-Effekt“. Dieser Effekt ist auf seine kolligativen (wasserbindenden) Eigenschaften zurückzuführen, die mit einer Reduktion der Salzkonzentration bei jeder gegebenen Temperatur einhergehen (LOVELOCK u. POLGE 1954). ROWE (1966) bestätigte diesen Mechanismus und stellte die Behauptung auf, dass der Gefrierschutz auf Membranniveau ablaufe. Die Gefrierschutzsub- stanz stabilisiert seiner Meinung nach durch direkte oder indirekte Interaktionen mit der Plasmamembran die Struktur des Wasser-Lipid-Proteinkomplexes und verhindert auf diese Weise eine Membrandenaturation. KAROW und WEBB (1965) bezeichneten das Glyzerin als Substanz, die intrazellulär vorhandenes Wasser in Gitterform strukturiert und dadurch zel- luläre Proteine schützt. Die Wasserstoffbindungsfähigkeit des Glyzerins unterbindet die Kris- tallisation, wobei die Bindungskapazität der Schutzsubstanz von der Anzahl und Stärke der Wasserstoffbrücken im Suspensionsmedium abhängt (ROWE 1966, MERYMAN 1971a, MERYMAN 1971b, DASHNAU et al. 2006). Eine lineare Anordnung von Wasserstoffbrü- cken im Medium und die Interaktion mit den Alkylgruppen des Glyzerins tragen zusätzlich zur kryoprotektiven Eigenschaft bei (DASHNAU et al. 2006). Die Menge des bei einer belie- bigen Temperatur vorliegenden ungefrorenen Wassers wird größer und somit die Elektrolyt- konzentration geringer. Die Retention der extrazellulären Wasserfraktion reduziert den osmo- tischen Gradienten zwischen extra- und intrazellulärem Raum und verhindert Zellvolumen- schäden, die durch Hyperosmolarität verursacht werden (BAUST 1973, STOREY 1997).
Weiterhin wird der Gefrierpunkt durch die Bildung von Wasserstoffbrücken in der glyzerin- haltigen Lösung herabgesetzt. Bei Einsetzen des Gefriervorganges steigt die Viskosität der Flüssigphase und die Verfügbarkeit des Wassers zur Eiskristallbildung wird verringert. Auch eine Reduktion des mechanischen Stresses durch die Modifikation von Form und Volumen der Eiskristalle wird dem Glyzerin zugesprochen (LOVELOCK 1953b, BAUST 1973,
WEITZE 1977). Im Medium verbleiben somit größere Kanäle mit Anteilen ungefrorenen Wassers, die den Zellen eine Möglichkeit zum Überleben schaffen (WATSON 1995).
Eine weitere Wirkung von Glyzerin besteht darin, dass das Erreichen des eutektischen Punk- tes verzögert wird. Durch die Unterdrückung der Dehydratation der Zellen verbleibt mehr Wasser im intrazellulären Raum, so dass keine Präzipitierung der Salze erfolgt und dadurch die Proteindenaturierung vermieden werden kann (WEITZE 1977, DASHNAU et al. 2006).
Die kryoprotektiven Substanzen werden anhand ihrer Penetrationsfähigkeit klassifiziert (KAROW u. WEBB 1965, ROWE 1966, MERYMAN 1971a). Die permeablen Kryoprotekti- va entfalten ihre Wirkung in der Zelle, während die nicht permeablen Kryoprotektiva sich auf das extrazelluläre Medium beschränken. Dem Glyzerin wird sowohl ein intra- als auch ein extrazellulärer Schutzeffekt zugeschrieben (SHERMAN 1963, MCGANN 1978, ALMLID u.
JOHNSON 1988).
Die Frage der optimalen Expositionsdauer des Glyzerins versuchten BERNDTSON und FOOTE (1972b) zu klären. Sie stellten fest, dass die Motilität boviner Spermatozoen nach zehnsekündiger Inkubation mit Glyzerin größer ist als bei längeren Expositionszeiten. Ausge- hend von diesem Ergebnis stellten die Autoren die Hypothese auf, dass entweder die Glyze- rinpenetration sehr schnell erfolgt oder ein extrazellulärer kryoprotektiver Mechanismus vor- liegt. Nach der Glyzerinzugabe werden Zellen dehydratisiert und damit für den Gefrierprozess vorbereitet, so dass auch bei schnellen Gefriergeschwindigkeiten eine intrazelluläre Eiskris- tallbildung und hohe Elektrolytkonzentrationen vermieden werden.
Eine Schutzfunktion für die Plasmamembran sprachen ALVAREZ und STOREY (1993) dem Glyzerin zu. Während des Einfriervorganges gebildete Mikrofissuren in der Plasmamembran würden eine Rupturgefahr in sich bergen, die durch das Lösen des Glyzerins abgepuffert wer- den könnte (ALVAREZ u. STOREY 1993).
2.1.2 Nachteilige Effekte des Glyzerins
Neben dem kryoprotektiven Effekt weist Glyzerin eine gewisse Toxizität auf. Diese beruht zum einen auf osmotisch bedingten Volumenänderungen und zum anderen auf direkten toxi- schen Effekten (ARMITAGE u. MAZUR 1984, FAHY 1984, KATKOV et al. 1998).
2.1.2.1 Osmotischer Stress
Das Hinzufügen und Entfernen der Kryoprotektiva stellt einen auslösenden Faktor für osmoti- sche Zellschäden dar. Die unterschiedliche Permeabilität von Wasser und Glyzerin durch die Zellmembran spielt die Hauptrolle von osmotisch bedingten Volumenänderungen. Während der Zugabe von Glyzerin zu einer Zellsuspension befinden sich die Zellen zunächst in einem hyperosmotischen Milieu. Folglich kommt es zu einem Austritt von Wasser aus den Zellen in den extrazellulären Raum, so dass die Zellen zunächst schrumpfen. Später stellt sich hinsicht- lich des Kryoprotektivums ein Konzentrationsgleichgewicht zwischen den intra- und extrazel- lulären Kompartimenten ein. Da das Wasser dem chemischen Gradienten folgt, schwellen die Zellen wieder an. Wenn die mit Glyzerin beladenen Spermien in isoosmotisches Medium überführt werden, vergrößern sie zunächst ihr Volumen durch Wasserübertritt und kehren dann langsam zur physiologischen Volumengröße zurück, wenn das Kryoprotektivum und Wasser die Samenzellen verlassen (HAMMERSTEDT et al. 1990, GILMORE et al. 1998, BALL u. VO 2001, GUTHRIE et al. 2002). Ein ähnlicher Vorgang tritt ein, wenn die Sper- mien (äquilibriert mit Glyzerin) den isoosmolalen Bedingungen (300 mOsm/kg) der Sekrete des weiblichen Genitaltraktes ausgesetzt werden (HAMMERSTEDT et al. 1990, HAMMERSTEDT u. GRAHAM 1992, GILMORE et al. 1997).
Das Ausmaß der osmotischen Volumenregulation hängt von mehreren Faktoren ab. Neben der Wasser- und Glyzerinpermeabilität der Zellmembran spielen die Temperatur, die Art des Kryoprotektivums und die Tierart eine Rolle (GAO et al. 1992, GILMORE et al. 1997, HOLT 2000b, BALL u. VO 2001). Um die Kinetik des Transports durch die Zellmembran zu verste- hen und damit das optimale Kryokonservierungsverfahren abzuleiten, wurden in mehreren Versuchen die Permeabilitätskoeffizienten für Wasser und Glyzerin ermittelt. Aquaporinkanä- le in der Spermienmembran erlauben nicht nur einen Wassertransport, sondern auch den Durchtritt des Kryoprotektivums (ISHIBASHI et al. 1997). Schon DREVIUS (1971) zeigte, dass der Wasserübertritt in Bullenspermatozoen 4x schneller abläuft als in bovinen Erythrozy- ten. GAO et al. (1992) bestätigten in ihren Untersuchungen die zellartbedingten Unterschiede und bewiesen zusätzlich die Temperaturabhängigkeit der Penetration. Je niedriger die Tempe- ratur war, desto langsamer durchtrat das Glyzerin die Spermienmembran. Die osmotische Äquilibrierung 1 M Glyzerins wurde bei Temperaturen von 30, 22, 8 bzw. 0°C nach 1, 1,3,
4,2 bzw. 6,7 Sekunden erreicht. Die positive Wirkung der höheren Temperatur basiert auf einer Reduktion des osmotischen Stresses aufgrund einer beschleunigten Permeabilität (ARMITAGE u. MAZUR 1984). GILMORE et al. (1997, 1998) testeten unterschiedliche Kryoprotektiva und kamen aufgrund ihrer Ergebnisse zu der Schlussfolgerung, dass die Schutzsubstanz mit der höchsten Permeabilität den geringsten osmotischen Schaden hervor- ruft. Das niedrigere Molargewicht des Ethylenglykols (62 g/mol) bedingt im Vergleich zum Glyzerin (92 g/mol) eine schnellere Penetration. Somit ist die höhere osmotische Toxizität des Glyzerins im Vergleich zu anderen alternativen Kryoprotektiva (DMSO, Propylenglykol, Ethylenglykol) durch sein höheres Molekulargewicht bedingt. Glyzerin diffundiert zwar lang- samer durch die Membran als Wasser, jedoch sind nach der Zugabe des permeablen Glyzerins zu der Zellsuspension die kinetischen Zellvolumenänderungen bei 5°C in 3-7 Minuten (BERNDTSON u. FOOTE 1972a) bzw. nach maximal 10 Minuten abgeschlossen (GUTHRIE et al. 2002). Auch dieses Ergebnis legt nahe, dass der Membranpermeabilitätskoeffizient für Bullenspermien relativ hoch ist (WATSON et al. 1992).
Die osmotische Toleranz unterscheidet sich zwischen den Tierarten. Während Mäuse- (WILLOUGHBY et al. 1996) und Humanspermien (GAO et al. 1995), gefolgt von Rinder- (GUTHRIE et al. 2002) und Pferdespermatozoen (BALL u. VO 2001), eine relativ hohe Tole- ranz gegenüber osmotischem Stress zeigen, reagieren die Samenzellen des Ebers empfindlich auf osmotische Änderungen (GILMORE et al. 1998). Die bovinen Spermien verhalten sich innerhalb eines Bereiches von 150-1200 mOsm/kg wie lineare Osmometer. Bei den Spermien dieser Tierart gelten 39% des gesamten Zellvolumens als osmotisch aktiv (GUTHRIE et al.
2002). Ähnliche Werte besitzen equine Spermien mit 30% aktivem Wasseranteil am Gesamt- volumen, wobei sich die Volumenveränderungen in einem Bereich von 150 bis 900 mOsm/kg linear verhalten (POMMER et al. 2002). Werden die speziesabhängigen Toleranzlimits über- schritten, erleiden die Samenzellen einen Verlust von Motilität und Vitalität (GILMORE et al.
1998, BALL u. VO 2001, GUTHRIE et al. 2002).
Um das Verhalten der Spermatozoen unter definierten osmotischen Bedingungen zu untersu- chen, wurden mehrere Studien durchgeführt. Die progressive Vorwärtsbewegung der Sper- mien gilt als sensitiver Parameter bezüglich der Veränderungen der Osmolalität. Werden die Samenzellen hyperosmolalen Bedingungen ausgesetzt, nimmt deren Motilität im Gegensatz
zur Membranintegrität deutlich ab (GAO et al. 1995, GILMORE et al. 1996, WILLOUGHBY et al. 1996, LIU u. FOOTE 1998, BALL u. VO 2001). Ein rascher Motilitätsabfall der bovi- nen Spermien wurde von LIU und FOOTE (1998) bei einer Osmolalität von mehr als 500 mOsm/kg beobachtet, wohingegen der Anteil der plasmamembranintakten Zellen bis zu einer Osmolarität von 1000 mOsm/kg beinahe unverändert blieb. Das Mitochondrienpotential erniedrigte sich nicht signifikant bei einem Anstieg der Osmolalität, wohingegen die Überfüh- rung in isotonische Lösung einen Abfall des Mitochondrienpotentials verursachte (WILLOUGHBY et al. 1996, BALL u. VO 2001).
Die Rückkehr in isoosmotisches Milieu führt aufgrund des Anschwellens der Spermatozoen zu deutlicheren funktionellen Schäden. Eine mechanische Ruptur der Zellmembran, die Schä- digung des Zytoskeletts unter vorausgegangenen hyperosmotischen Bedingungen sowie irre- versible Defekte der Membran, die die funktionelle Zelloberfläche verkleinern, sind mögliche Ursachen für osmotisch bedingte Schäden (GAO et al. 1995, GILMORE et al. 1996, BALL u.
VO 2001). Die Konzentration des Glyzerins zeigte zusätzlich einen signifikanten Effekt auf die Motilität der Samenzellen (GUTHRIE et al. 2002).
Um die osmotisch bedingten Schäden zu minimieren, wird bei der Samenkonservierung teil- weise ein mehrstufiges Verdünnungsverfahren angewendet, bei dem die Kryoprotektiva in der Regel nicht bei der ersten, sondern erst bei einer späteren Verdünnung zugegeben werden.
Die Spermienvitalität bei einer Endkonzentration von 5% Glyzerin im Verdünner wird nach ALMQUIST und WICKERSHAM (1962) durch tropfen- oder stufenweise Zugabe nicht sig- nifikant beeinflusst. FOOTE (1970) hat die Qualität und Fertilität von gefrierkonserviertem Bullensperma, das mittels verschiedener Ein- oder Mehrschrittzugaben von Glyzerin bei 5°C hergestellt worden war, in einem angelegten Besamungsversuch verglichen. Der prozentuelle Anteil von motilen Spermien nach dem Auftauen sowie die Fertilität zeigten keinen signifi- kanten Unterschied. Die Non-Return-Rate war bei Zugabe von Glyzerin in einem Schritt am höchsten. Das langsame Hinzufügen ist daher seiner Ansicht nach bei bovinen Spermien nicht erforderlich. SILVA et al. (2003) beurteilten die Spermienqualität nach ein- und mehrstufiger Verdünnung, wobei in letzterem Fall der glyzerinhaltige Verdünner (12% Glyzerin) in drei Schritten im Abstand von jeweils 5 Minuten zugegeben wurde. Die Glyzerinzugabe erfolgte nach der Abkühlung der verdünnten Samenprobe bei 4°C. Die Motilität des Spermas wurde mit Hilfe eines Thermoresistenztests nach dem Auftauen (Inkubation von 0 bis 120 Minuten
bei 37-39°C) und morphologisch beurteilt. Die Verfahren der ein- oder mehrstufigen Glyze- rinzugabe zeigten keinen signifikanten Unterschied auf die Spermienmotilität bzw. Morpho- logie nach dem Auftauen (SILVA et al. 2003).
2.1.2.2 Biochemische Wirkung
Schon frühere Nachforschungen haben gezeigt, dass der protektive Mechanismus nicht in direkter Beziehung mit kolligativen Eigenschaften der Gefriersubstanz steht. Die Summe der Gefrierschäden nach dem Auftauen korrelierte nicht mit dem gefrorenen Wasseranteil, son- dern mit der Konzentration des Kryoprotektivums, die während des Gefrierprozesses anstieg.
Eine toxische Wirkung des Glyzerins war auch unabhängig vom Effekt des Einfrierens fest- zustellen (FAHY 1984).
Die Toxizität von Glyzerin variiert innerhalb der Tierspezies und die optimale Konzentration stellt einen Kompromiss zwischen kryoprotektivem und zelltoxischem Effekt dar. Für die Kryokonservierung boviner Spermien wird das Glyzerin in Endkonzentrationen von durch- schnittlich 7% (zwischen 2,25% = 0,25M und 9% = 1M) in Citrat-Eidotter- oder Tris- Eidotter-Verdünner verwendet. Die optimale Konzentration ist von der Gefriergeschwindig- keit sowie von der Zusammensetzung des Verdünnermediums abhängig. Im Fall der hohen Einfriergeschwindigkeit (Temperaturabfall auf -130°C innerhalb 3,5 Minuten) sind Konzent- rationen von 5-7% Glyzerin zur Ereichung einer maximale Spermienmotilität notwendig, hin- gegen benötigt man bei einer niedrigeren Gefrierrate (Temperaturabfall auf -130°C innerhalb 27 Minuten) eine Glyzerinkonzentration zwischen 7-11% (RODRIGUEZ et al. 1975). Eine Glyzerinkonzentration von 6% in Tris-Eidotter (20%)-Verdünner im Kryokonservierungspro- zess ist für eine zufriedenstellende Überlebensrate der Bullenspermatozoen ausreichend (DE LEEUW et al. 1993).
Die Zellkompartimente reagieren unterschiedlich empfindlich auf die verschiedenen Glyze- rinkonzentrationen. Eine Glyzerinkonzentration zwischen 4 und 6% führt zwar zu einem Ma- ximum progressiv motiler Eberspermatozoen, wobei aber gegenüber niedrigeren Konzentrati-
onen der Anteil akrosomgeschädigter Zellen relativ hoch und die Fertilität relativ niedrig sind (WILMUT u. POLGE 1977). Die Akrosommembranintegrität wurde durch die steigende Gly- zerinkonzentrationen von Bullen- (1, 4, 7, 10 und 13%) (ROBBINS et al. 1976), Schafbock- (0, 2,5 und 7,5%) (WATSON u. MARTIN 1975) und Eberspermien (zwischen 0 und 4%) (FISER u. FAIRFULL 1990) nach dem Auftauen negativ beeinflusst.
HAMMERSTEDT und GRAHAM (1992) haben den Verlust der Befruchtungsfähigkeit von Geflügelsperma direkten toxischen Wirkungen des Glyzerins auf zellulärer und molekularer Ebene zugeschrieben. Das Kryoprotektivum durchtritt nicht nur die Zellmembran der Sper- mien und verändert die zytoplasmatische Viskosität, sondern kann, je nach der Ausgangkon- zentration, in der Lipiddoppelmembran kumulieren. Dieser Prozess beeinflusst möglicherwei- se die Zellmembraneigenschaften und direkt die Permeabilität. Die Interaktionen mit den membrangebundenen Glykoproteinen und Phospholipiden verursachen eine verringerte Flui- dität und Reorganisation der Membranstrukturen, stören Transsignalwege und können die Gametenfusion negativ beeinflussen (PARKS u. GRAHAM 1992).
Das Glyzerin greift außerdem durch seine Metabolisierung in die Bilanz von ATP-Synthese und -Verbrauch ein. Es kann unter ATP Verbrauch mittels Glyzerinkinase bzw. Phosphatase phosphoryliert oder dephosphoryliert werden und verursacht so ein Energiedefizit (HAMMERSTEDT et al. 1990). In einer Studie von GARNER et al. (1999) zeigten die Spermien in einem Verdünnermedium mit 7% Glyzerin gegenüber Spermien in Verdünner ohne Glyzerin eine Reduktion des Anteils an Spermien mit hohem Mitochondrienmembran- potential. Die nicht tiefgefrorenen Spermien waren vor der Beurteilung für 24 Stunden bei 5°C in eidotterhaltigen Verdünnern aufbewahrt worden. Das Mitochondrienmembranpotential war mit Hilfe des metachromatischen Farbstoffs JC-1 beurteilt worden. Im selben Versuch war ein glyzerinbedingter signifikanter Abfall des Anteils akrosomgeschädigter Spermien um 0,9% zu beobachten. Hingegen führte die Gegenwart von Glyzerin zur Beschleunigung der Akrosomreaktion und wurde als mögliche Ursache für herabgesetzte Konzeptionsrate festge- stellt (SLAVIK 1987).
Da auch die Temperatur des glyzerinhaltigen Verdünners eine entscheidende Rolle spielt, wurde der Samen mit glyzerinhaltigem Verdünner bei unterschiedlichen Temperaturen ver-
setzt. Entweder wurden die gewonnenen Samenproben mittels 1-Schritt-Verdünnung bei 30 bzw. 32°C mit einem glyzerinhaltigen Medium verdünnt oder zunächst ein glyzerinfreier Verdünner verwendet und nach der Abkühlung der Samenprobe wurde dann bei einer Tempe- ratur von 5°C bzw. 0°C die Gefrierschutzsubstanz hinzugegeben (2-Schritt-Verdünnung) (FOOTE 1970, COLAS 1975, FISER u. FAIRFULL 1989, PENA et al. 1998, MORRIER et al. 2002). Bezüglich des Temperatureffektes gibt es allerdings kontroverse Meinungen.
COLAS (1975) beobachtete einen signifikanten Motilitätsabfall nach dem Auftauen, falls das Sperma mittels 1-Schritt-Methode (30°C) statt mit der 2-Schritt-Verdünnung bei 4°C konser- viert wurde. Auch FISER und FAIRFULL (1989) verzeichneten einen signifikanten Motili- tätsverlust beim Hinzufügen des glyzerinhaltigen Verdünners bei 30°C im Vergleich zu 5°C.
Daher folgerten die Autoren, dass durch die Zugabe bei niedrigeren Temperaturen spermien- toxische Effekte des Glyzerins vermindert werden können. Allerdings hatte die Zugabe von Glyzerin bei 0°C im Vergleich zu 5°C nachteilige Folgen auf die Vitalität und Motilität der Spermien (ALMLID u. JOHNSON 1988). In der Studie von MORRIER et al. (2002), die die 1-Schritt-Verdünnung mit Triladyl® und 2-Schritt-Verdünnung mit Biladyl® (24-stündiger Äquilibrierungszeit bei 5°C) miteinander verglichen, zeigten die mit beiden Verfahren einge- frorenen Spermatozoen nach dem Auftauen keine Unterschiede hinsichtlich der Qualitätspa- rameter progressive Motilität, Plasmamembranintegrität und dem Anteil an akrosomreagier- ten Samenzellen. Die Evaluation der Spermienparameter erfolgte während der Inkubation in einem Medium, das den Genitaltrakt imitierte. Ähnliche Befunde wurden für bovine Sper- mien nach Zugabe des glyzerinhaltigen Verdünners bei 5, 10, 20 oder 30°C beobachtet (GRAHAM et al. 1958). Es ergaben sich keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich der Fertilität. Der Effekt der 1-Schritt- bzw. 2-Schritt-Verdünnung auf die Spermienmotilität nach dem Auftauen war geringer als derjenige der Bullen (FOOTE 1970). Auch verschiedene Vo- lumenverhältnisse zwischen verdünnter Samenprobe und dem glyzerinhaltigen Verdünner mit steigender Glyzerinkonzentration (14, 21, 28 und 35%) bei der 2-Schritt-Verdünnung hatten keine signifikanten Effekte auf die Motilität nach dem Auftauen. Entscheidend war die End- konzentration des Glyzerins (PICKETT u. BERNDTSON 1978).
Auch bei Rüden hatte die Glyzerinexposition von Sperma bei 37°C oder 4°C keine Unter- schiede in der Spermaqualität (progressive Motilität, Vitalität und akrosomintakter Spermien) zur Folge (PENA et al. 1998). Einige Autoren beobachteten sogar einen höheren Anteil an
progressiv motilen Spermien bei der Maus bzw. beim Hengst, wenn der glyzerinhaltige Ver- dünner bei 22°C statt 4°C zugegeben wurde (KATKOV et al. 1998, VIDAMENT et al. 2000).
Zwischen den Prozessen Verdünnen und Einfrieren wird das verdünnte Sperma einer Äquili- brierungsphase bei 4-5°C unterzogen. Bei der zweistufigen Verdünnung wird der glyzerinhal- tige Verdünner nach der Abkühlung zugegeben. Dieser Zeitabschnitt wird irrtümlicherweise als Glyzerinanpassungszeit bezeichnet, obwohl das Gefrierschutzmittel Glyzerin die Sper- mienmembran sehr schnell durchtritt und daher zu jedem Zeitpunkt zugemischt werden kann (BERNDTSON u. FOOTE 1972a, 1972b, ALMLID u. JOHNSON 1988, GAO et al. 1992, WATSON et al. 1992, DE LEEUW et al. 1993).
Die Expositionszeit des Samens mit Glyzerin kann die Überlebensrate nach dem Auftauen beeinflussen. Bei einer Kontaktzeit von 10-30 Sekunden zwischen Glyzerin und Spermien wurde eine maximale Überlebensrate nach dem Gefrierprozess beobachtet (WILMUT et al.
1972, BERNDTSON u. FOOTE 1972b). Bei Expositionszeiten zwischen 6 Minuten und 6 Stunden änderte sich dagegen der Anteil motiler Spermien nach dem Auftauen nicht (BERNDTSON und FOOTE 1972b). Daraus zogen die Autoren die Schlussfolgerung, dass innerhalb von 6 Minuten nach der Glyzerinzugabe die komplette Penetration erreicht wird.
Laut WILMUT et al. (1972) besteht ein reziproker Zusammenhang zwischen der Inkubations- zeit und der Konzentration des Kryoprotektivums.
KATKOV et al. (1998) verzeichneten eine zweifach höhere Überlebensrate der Spermatozoen bei einer Glyzerinkonzentration von 0,8 M, wenn die Exposition von 20 auf 1 bis 5 Minuten reduziert wurde. Auch ROTHE et al. (2009) beobachteten bei einer Verkürzung der Glyzerin- einwirkungszeit auf 30 Minuten bei 5°C direkt vor dem Einfrieren eine Verbesserung der Sa- menqualität nach dem Auftauen. Die Geschwindigkeit für die geglättete Bahn (VAP) und der Anteil progressiv motiler Spermien sowie die Mitochondrienaktivität wurden durch die Ver- kürzung der Glyzerineinwirkungszeit gesteigert. Die Kontrollgruppe wurde mit glyzerinhalti- gem Verdünner versetzt und 24 Stunden im Kühlraum äquilibriert. Die Analyse der eingefro- renen Spermatozoen wurde nach einer 30 und 120 minütigen Inkubation bei 38°C durchge- führt. Während der Inkubationsdauer nahmen die Unterschiede in der Geschwindigkeit für die geglättete Bahn und dem Anteil progressiv motiler Spermien im Vergleich zur Kontrollgrup- pe zu. Insgesamt 23 Ejakulate von 4 Bullen waren für diese Studie aufbereitet worden, wobei
3 Bullen einen höheren Anteil an morphologisch intakten Zellen durch die Verkürzung der Glyzerineinwirkungszeit zeigten. Allerdings waren die morphologischen Ergebnisse statis- tisch nicht signifikant. In weiteren Arbeiten wurden die Auswirkungen einer unterschiedli- chen Verweildauer der Spermien in den glyzerinhaltigen Verdünnern bei 5°C getestet.
GRAHAM et al. (1957) verglichen die Auswirkungen einer Variation der Äquilibrierungs- dauer (4, 8 und 12 Stunden) nach Zugabe des glyzerinhaltigen Verdünners bei 4°C auf die Fertilität des Spermas von 6 Bullen. Die höchsten NRR verzeichneten sie bei den Samenpro- ben nach 12-stündiger Äquilibrierungsphase. In anderen Studien, in denen der glyzerinhaltige Verdünner nach Abkühlung der Samenprobe zugegeben wurde, wirkten sich unterschiedliche Expositionslängen von 0,5 und 2 Stunden (WIGGIN u. ALMQUIST 1975, ALMLID u.
JOHNSON 1988) bzw. 2, 4, 6, 10 und 18 Stunden (ENNEN et al. 1976) nicht auf die Sper- mienmotilität nach dem Auftauen aus. Einige Autoren machten dagegen die Beobachtung, dass eine Äquilibrierungsphase mit Glyzerin von 18 Stunden im Vergleich zu 4, 6 bzw. 12 Stunden die Spermienmotilität nach der Kryokonservierung erhöhte (PICKETT u.
BERNDTSON 1978, FOOTE u. KAPROTH 2002). Eine 24-stündige Spermieninkubation in glyzerinhaltigem Verdünner bei 5°C ohne Kryokonservierung zeigte keine signifikanten Un- terschiede bezüglich der Plasmamembranintegrität (GARNER et al. 1999), Motilität und dem Anteil akrosomreagierter Spermien (MORRIER et al. 2002) gegenüber der Kontrollprobe ohne Glyzerinzusatz. Allerdings verzeichneten GARNER et al. (1999) bei 6 von 8 Bullen einen geringfügigen Anstieg der vitalen Spermien in Anwesenheit des Glyzerins. Diese Beo- bachtung führten sie auf individuelle Einflüsse der Tiere zurück. Die unterschiedliche Aus- stattung der Spermienmembran mit Membranporen, die für die Permeabilität von Wasser und Glyzerin verantwortlich sind, könnte die tierindividuellen Effekte erklären (CHAVEIRO et al.
2006).
2.2 Effekte der Zugabe von BSP-A1/A2 zum nativen Ejakulat
2.2.1 Bedeutung von Seminalplasma
Das Seminalplasma ist ein Sekret der akzessorischen Geschlechtsdrüsen und besteht aus or- ganischen und anorganischen Bestandteilen, die nach der Ejakulation den männlichen Geni- taltrakt verlassen. Während der Passage durch den Reproduktionstrakt durchlaufen die Sper- mien eine Reihe von Modifikationsprozessen, die vorwiegend ihre Zellmembran betreffen.
Vor allem Interaktionen mit verschiedenen Seminalplasmaproteinen sind von großer Bedeu- tung (TÖPFER-PETERSEN et al. 2005). Neben dem Verlust membrangebundener Proteine erfolgt auch die Integration neuer Proteinmoleküle, die unterschiedliche Funktionen ausüben können. Sie fungieren beispielweise als Rezeptoren für die Bindung an die Zona pellucida oder dienen dem Schutz der Spermienmembran und verhindern damit die vorzeitige Akro- somreaktion (EKHLASI-HUNDRIESER et al. 2007). Ihre Funktion steht in engem Zusam- menhang mit ihrem Bindungsverhalten an die Spermienmembran.
Proteine, die ubiquitär im männlichen Genitaltrakt von Säugertieren und dominant im Semi- nalplasma vorkommen, sind die Fibronektin Typ II (Fn2) Proteine.
2.2.1.1 Charakteristik, molekulare Struktur und Vorkommen der Fibronektin Typ II Proteine
Die Fibronektin Typ II Proteine zeichnen sich durch zwei bzw. vier tandemartig angeordnete Fn2 Typ Module mit unterschiedlichen N-terminalen Bereichen aus. Zu dieser Proteinklasse gehören BSP-A1/A2, BSP-A3 und BSP-30kDa (allgemein als BSP bezeichnet), die zwei kur- ze hintereinander angeordnete Fn2 Typ Domänen aufweisen. Dabei unterscheiden sich BSP-A1 und BSP-A2 nur im Grad der Glykosylierung. Sie weisen die gleiche Aminosäurese- quenz auf und werden auch unter dem Begriff PDC-109 (Protein with N-terminus aspartic acid, D, and carboxy terminus Cystein, having 109 amino acids) zusammengefasst (ESCH et al. 1983). BSP-A1 enthält ein Trisaccharid, BSP-A2 dagegen ein Disaccharid. Die Kohlen- hydrate werden mittels Hydroxylgruppe des Threonins gebunden (CALVETE et al. 1994, MANJUNATH u. THÉRIEN 2002). Die Molekularmassen von BSP-A1, -A2 und -A3 liegen
zwischen 15,5 und 16,5 kDa, diejenige von BSP-30 zwischen 28 und 30 kDa. Es handelt sich um saure Proteine mit einem isoelektrischen Punkt (pI) von 3,6-5,2 (DESNOYERS et al.
1994, MANJUNATH u. THÉRIEN 2002)
Der Gehalt an BSP im Seminalplasma des Rindes beträgt 30-50 mg/ml. Dies entspricht ca. 65% des Gesamtproteingehalts. Davon beträgt der Anteil des BSP-A1/A2 80%, die restli- che Menge bilden BSP-A3- und BSP-30 kDa (BERGERON u. MANJUNATH 2006). Die BSP werden in der Samenblasendrüse gebildet und binden während der Ejakulation über Fn2 Module an die Phospholipide der Spermienmembran.
Die Bindungsfähigkeit der bovinen Seminalplasmaproteine A1/A2 an Phospholipidvesikel und die Spermienmembran wurde in mehreren Studien nachgewiesen (DESNOYERS u.
MANJUNATH 1992, MÜLLER et al. 1998, GREUBE et al. 2001). Es wurde gezeigt, dass ein Proteinmolekül BSP-A1/A2 innerhalb von weniger als einer Sekunde ca. 10 Lipidmolekü- le binden kann (MÜLLER et al. 1998). Das gebundene BSP-A1/A2 erfährt eine Konformati- onsänderung und ist anschließend in der Lage, sich in den apolaren/ hydrophoben Teil der Lipiddoppelmembran einzufügen. Es kommt zur Immobilisierung der Membran und in der Folge zur Extraktion von Lipid-Proteinkomplexen, wobei die Fn2 Domänen für die selektive Bindung notwendig sind (MOREAU et al. 1998). Es werden vorwiegend Phosphatidylcholin (PC) und Cholesterin entfernt. Hohe Konzentrationen von BSP-A1/A2 können durch die Ex- traktion der Lipid-Proteinkomplexe zu einer wesentlichen Veränderung der Lipidzusammen- setzung der Membran führen.
Ein Modell für den Mechanismus der Lipid-Protein-Interaktion lieferten die röntgenkristal- lografischen Untersuchungen von WAH et al. (2002). Der BSP-A1/A2/PC-Komplex liegt als Dimer vor und die Bindung erfolgt über Phospholipid-Bindungstaschen der kurzen BSP- A1/A2. Jede Fn2 Domäne besteht aus zwei doppelsträngigen β-Faltblattabschnitten, die eine senkrechte Orientierung aufweisen und durch zwei Disulfidbrücken verbunden sind. Die Bin- dung von Phospholipiden wird über eine Kation-π-Interaktion zwischen der Aminogruppe des Cholins und Tryptophan sowie über Wasserstoffbrücken vermittelt (WAH et al. 2002).
Ähnliche Fn2 Proteine wurden bei weiteren Tierarten im Seminalplasma gefunden. Ihre Kon- zentration ist allerdings speziesabhängig. Im Seminalplasma des Hengstes wurden SP-1 und SP-2 identifiziert, die zwei Fn2 Domänen besitzen und in der Samenleiterampulle produziert
werden (EKHLASI-HUNDRIESER et al. 2005). Ein weiteres Protein (pB1) wurde im Semi- nalplasma des Schweins gefunden, aber in deutlich geringerer Menge als bei anderen Spezies (CALVETE et al. 1997). Weitere homologe Proteine mit zwei Fn2 Modulen wurden bei Zie- ge, Bison und Schafbock entdeckt (VILLEMURE et al. 2003, BOISVERT et al. 2004, BERGERON et al. 2005)
Die Vertreter der langen Proteine mit vier Fn2 Modulen sind sowohl beim Rind als auch bei Schwein und Pferd beschrieben worden. Der Hauptsyntheseort der langen Proteine liegt im Nebenhoden. Deshalb werden sie als ELSPBP1 (Epididymal sperm-binding protein 1) be- zeichnet. Ein Vergleich der Aminosäuresequenzen der ersten zwei Fn2 Module der langen und kurzen Proteine ergab das Vorliegen konservierter Aminosäuren, die in die Phospholipid- bindung einbezogen sind. Daraus lässt sich ableiten, dass die kurzen sowie die langen Protein- familien über einen vergleichbaren Mechanismus an die Spermienmembran binden können (EKHLASI-HUNDRIESER et al. 2005, 2007).
Das bovine ELSPBP1 beeinflusst die Volumenregulation der Spermien während der Neben- hodenreifung. Nach einer hypotonen Belastung kommt es bei Nebenhodenschwanzspermien zu einer Volumenvergrößerung, die durch Aktivierung von Ionenkanälen wieder abnimmt.
Dagegen sind Spermien aus dem Nebenhodenkopf nicht in der Lage das Zellvolumen nach der Schwellung zu reduzieren. Da die langen und kurzen Fn2 Proteine ähnliche strukturelle Eigenschaften besitzen, wurde in der Studie von SAHIN et al. (2009) das in großer Menge verfügbare BSP-A1/A2 eingesetzt. Nach der Zugabe von BSP-A1/A2 konnten Nebenhoden- kopfspermien ihr Zellvolumen verringern (SAHIN et al. 2009).
2.2.1.2 Biologische Bedeutung von BSP-A1/A2 für die Befruchtung
Nach der Ejakulation assoziieren BSP mit der Spermienmembran, wobei vorwiegend Choles- terin und Phospholipide entfernt werden. Obwohl eine direkte Interaktion mit Cholesterin nicht bewiesen wurde, scheint es, dass diese Proteine durch Mobilitätseinschränkung des Cholesterins in der Umgebung des PCs eine vorzeitige Kapazitation der Spermien verhindern können (MÜLLER et al. 2002). Die Fähigkeit der BSP, den Lipid-Efflux zu stimulieren, hängt entscheidend von der Proteinkonzentration und der Dauer der Inkubation ab
(MANJUNATH u. THÉRIEN 2002). Das BSP-A1/A2 übt mehrere biologische Funktionen im Hinblick auf den Befruchtungsvorgang, der durch eine hohe Komplexität gekennzeichnet ist, aus.
Die Ergebnisse immunzytochemischer Untersuchungen zeigten, dass das BSP-A1/A2 eine topographische Verteilung im Bereich des Äquatorialsegmentes, des Mittelstücks und des Akrosoms aufweist (SOUZA et al. 2008). Die Analyse der Fluoreszenzintensität ergab eine deutlich intensivere Immunreaktion des anti-BSP A1/A2 am Mittelstück verglichen mit ande- ren Spermatozoenbereichen (SOUZA et al. 2008). Diese Lokalization in der Nähe der Mito- chondrien lässt vermuten, dass BSP-A1/A2 die Spermienmotilität beeinflussen kann (MOURA et al. 2007b). Obwohl bis jetzt keine spezifischen Proteinrezeptoren am Mittelstück gefunden worden sind, haben SÁNCHEZ-LUENGO et al. (2004) bewiesen, dass BSP-A1/A2 die Motilität mit Hilfe der membrangebundenen Ca2+-ATPase konzentrationsabhängig stimu- liert. Die Ca2+-ATPase ist an der Regulation der intrazellulären Kalziumkonzentration betei- ligt. Eine spezifische Antagonisierung des Enzyms führte zur Verminderung der Spermien- motilität (BREITBART et al. 1985).
Für den Erwerb der Befruchtungskompetenz durchlaufen die Spermatozoen physiologische und biochemische Modifikationen der Membran, die man als Kapazitation bezeichnet. Es handelt sich um einen Prozess, der mit einem Cholesterinverlust, einem Anstieg des intrazel- lulären Kalziumspiegels und einer Phosphorylierung von Spermienproteinen einhergeht. Das bovine Seminalplasmaprotein A1/A2 zeichnet sich durch seine spezifische Bindung an Fakto- ren, die am Kapazitationsprozess beteiligt sind, aus. Zu diesen gehören Heparin, heparinähn- liche Glykosaminoglykane (GAG) und High-Density-Lipoproteine (HDL), die in der Follikel- und Oviduktflüssigkeit vorkommen (THÉRIEN et al. 2005). Die feste Bindung der Proteine an die Spermien wird über die Membranphospholipide vermittelt, wobei eine Fn2-Domäne involviert ist. Die andere Fn2-Domäne interagiert mit HDL und Heparinmolekülen und ist an der Lipidextraktion beteiligt, die mit einem Cholesterinefflux aus der Membran einhergeht (FAN et al. 2006). Da der Cholesterinverlust mit dem Kapazitationsvorgang verbunden ist, spielen somit HDL und Heparin eine Rolle bei der Aktivierung der Spermatozoen während der Kapazitation im weiblichen Genitaltrakt (THÉRIEN et al. 2001, MANJUNATH u.
THÉRIEN 2002). Obwohl diese Veränderungen essentiell für den Befruchtungsvorgang sind,
führen sie zur Destabilisation der Plasmamembran und verkürzen die Lebensdauer der Sper- matozoen (TÖPFER-PETERSEN et al. 2002).
Durch die Wechselwirkung zwischen Spermatozoen und Eileiterepithel wird die Lebensspan- ne der männlichen Gameten verlängert und die Kapazitation bis zum Zeitpunkt der Ovulation verzögert. Somit wird das Treffen der beiden Gameten zum richtigen Zeitraum gewährleistet (TÖPFER-PETERSEN et al. 2002). Für das Überleben der Spermatozoen ist der Kontakt zum Oviduktepithel erforderlich, der durch Kohlenhydratstrukturen als Bindungspartner vermittelt wird. Als Rezeptor für die fukosehaltigen Glykane des Oviduktes wurde das BSP-A1/A2 auf nicht kapazitierten Spermien identifiziert und damit die Beteiligung des Proteins an der Bil- dung des Spermienreservoirs belegt (GWATHMEY et al. 2003). Die Vollendung der Kapazi- tation führt zum Verlust dieses Proteins und damit zum Ablösen vom Oviduktepithel. Es kommt zur sogenannten Hyperaktivierung der Spermatozoen, die sich in Richtung der ovu- lierten Eizelle bewegen und anschließend an die Zona pellucida binden und die Akrosomreak- tion durchlaufen (TÖPFER-PETERSEN et al. 2002, SOUZA et al. 2008).
Ein direkter Zusammenhang zwischen spezifischen Seminalplasmaproteinen und der Fertilität wurde in mehreren Studien festgestellt (KILLIAN et al. 1993, MOURA et al. 2007a).
KILLIAN et al. (1993) haben mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese vier fertilitätsre- levante Proteine aus dem Seminalplasma isoliert. Zwei dieser Proteine (26 kDa, pI 6,2 und 55 kDa, pI 4,5) waren bei Bullen mit hoher Fertilität zu finden, zwei andere (16 kDa, pI 4,1 und pI 6,7) hingegen waren mit niedrigerer Fertilität assoziiert. Die Autoren postulierten ei- nen positiven Einfluss von heparinbindenden Proteinen auf die Fruchtbarkeit. In späteren Stu- dien wurden die Proteine mit positiver Korrelation zur Fertilität als Lipocalin-Typ Prostaglandin Synthetase (26 kDa, pI 6,2) und Osteopontin (55 kDa, pI 4,5) identifiziert (GERENA et al. 1998, MOURA et al. 2006). Bei dem von KILLIAN et al. (1993) beschrie- benen niedermolekularen Antifertilitätspeptid (16 kDa, pI 4,1 und pI 6,7) mit negativer Korre- lation handelte sich um das Spermadhäsin Z 13 und seine Isoformen (MOURA et al. 2006). In einer Studie, bei der die Fähigkeit der in vitro Penetration von zonafreien Oozyten untersucht wurde, zeigten epididymale Spermien eine höhere Penetrationsrate, wenn sie zuvor mit akzes- sorischem Sekret von hochfertilen Bullen behandelt wurden. Eine verstärkte Expression von BSP-A1/A2, BSP-A3, BSP-30kDa, Clusterin, Albumin, Osteopontin und Phospholipase A2
im akzessorischen Sekret induzierte die Kapazitation und erleichterte die Spermienpenetration (MOURA et al. 2007a).
2.2.2 Rolle von BSP während des Kryokonservierungsprozesses
Das Seminalplasma dient als Transportmedium für die Spermien, in dem sie in den weibli- chen Genitaltrakt gelangen. Es ist jedoch nicht geeignet, um die Überlebensfähigkeit in vitro zu gewährleisten (GARCIA u. GRAHAM 1987, WAY et al. 2000). Die BSP machen prozen- tual den größten Bestandteil der Seminalplasmaproteine aus und führen aufgrund der Choles- terin- und Phospholipidentfernung aus der Spermienmembran zu einer Verminderung der Resistenz gegenüber dem Kälteschock und der Tiefgefrierung (MANJUNATH et al. 2002).
Es ist bekannt, dass Spermien von Spezies, die wenig Cholesterin in der Membran aufweisen, empfindlicher auf Kälteschock reagieren als Spermien, die einen hohen Cholesterinanteil be- sitzen (DARIN-BENNETT u. WHITE 1977). Durch den bereits oben beschriebenen Mecha- nismus können die BSP eine Destabilisation der Plasmamembran verursachen und damit den Erfolg des Kryokonservierungsprozesses beeinflussen. Allerdings stellten COLÁS et al.
(2009) an Schafbockspermien, die einem Kälteschock ausgesetzt waren, einen protektiven Effekt von Seminalplasmaproteinen fest. Die Adsorption der Proteine an die Plasmamembran, die mit Hilfe der transmissiven Elektronenmikroskopie dargestellt wurde, führte zu einem geringeren Anteil an akrosom- und plasmamembrangeschädigten Spermatozoen. Daraus zo- gen die Autoren die Schlussfolgerung, dass die Seminalplasmaproteine die Kälteempfindlich- keit der Spermien reduzieren. In früheren Untersuchungen von BARRIOS et al. (2005) wur- den mit Hilfe von immunchemischen Methoden 2 Proteine isoliert, die für diesen Effekt ver- antwortlich sind. Vor allem das Protein P14 (kDa) beinhaltet Aminosäurensequenzen, die strukturelle Ähnlichkeit mit anderen Spezies zeigen, besonders mit bovinen PDC-109 Protein (BARRIOS et al. 2005).
Eidotter ist eine häufig angewandte Verdünnerkomponente im Rahmen der Gefrierkonservie- rung von Samenzellen. Die schützende Wirkung von Eigelb wird auf die darin enthaltene Low-Density Lipoprotein (LDL) Fraktion zurückgeführt (WATSON 1976, DE LEEUW et al.
1993). Obwohl mehrere Hypothesen über das protektive Prinzip existieren, ist bis heute nicht
eindeutig geklärt, welcher Mechanismus an dem schützenden Effekt beteiligt ist. Eine mögli- che Assoziation der LDL Fraktion mit der Spermienmembran wurde durch Studien in Frage gestellt (FOULKES 1977, MACDONALD u. FOULKES 1981). Eine andere Hypothese ba- siert auf der Vermutung, dass LDL einen Film auf der Spermienoberfläche bildet und somit durch den Kryokonservierungsprozess geschädigte Membranphospholipide ersetzen könnte (QUINN et al. 1980). Dass die LDL Komponente mit schädlichen Seminalplasmapeptiden (< 5 kDa) um die Spermienmembranbindung konkurriert, wurde als weiterer Schutzmecha- nismus postuliert (VISHWANATH et al. 1992). Da die bovinen Seminalplasmaproteine eine Phospholipidbindungsfähigkeit besitzen, wurden Studien zur Darstellung der Interaktion zwi- schen der LDL Komponente des Eigelbs und BSP durchgeführt. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Low-Density Lipoproteinfraktion mit den oben genannten Proteinen einen stabi- len Komplex bildet, der auch nach dem Kryokonservierungsprozess erhalten bleibt (NAUC u.
MANJUNATH 2000, MANJUNATH et al. 2002). Die Bindung erfolgt schnell (innerhalb einer Minute) und mit hoher Spezifität. LDL bindet im Verhältnis von 1:5 bis 1:7 an die BSP.
Da die Ejakulate in der Abhängigkeit von der Spermienkonzentration im Nativsamen 10fach und mehr verdünnt werden, assoziiert der größte Teil der bovinen Seminalplasmaproteine mit der Low-Density Lipoproteinfraktion (MANJUNATH et al. 2002). Samen, der mit eigelbhal- tigem Verdünner kryokonserviert worden ist, enthält bis zu 80% weniger membranassoziierte BSP als unverdünnter Nativsamen (BERGERON et al. 2004). Die Sequestration der BSP durch die LDL-Fraktion stellt nach BERGERON und MANJUNATH (2006) den Hauptme- chanismus der protektiven Eigenschaften des Eigelbs dar.
Die Unterschiede im Seminalplasmaproteinprofil von Besamungsbullen können nach JOBIM et al. (2004) zur Differenzierung zwischen Tieren mit guter und schlechter Kryokonservier- barkeit herangezogen werden. Letztgenannte Autoren teilten Bullen hinsichtlich der Kryokon- servierbarkeit ihres Spermas in zwei Gruppen ein. Eine Gruppe mit guter Einfrierfähigkeit war dadurch gekennzeichnet, dass in einem Zeitraum von 2 Jahren mindestens 90% der Eja- kulate nach dem Auftauen eine Spermaqualität aufwiesen, die für die Besamung geeignet war, wohingegen in der andere Gruppe weniger als 90% der Ejakulaten nach dem Wiederauftauen für den Einsatz in der Praxis als geeignet eingestuft wurden. Für die Beurteilung „besamungs- tauglich“ mussten die Spermien folgende Kriterien erfüllen: Motilität 30%, akrosomale Integ-
rität nach Stresstest 45% und Motilität 15%, Hauptdefekte 20%, Nebendefekte 25% und totale Spermiendefekte 30%. Von jedem Bullen wurde eine Seminalplasmaprobe mittels zweidi- mensionaler Gelelektrophorese untersucht und der Proteingehalt der Spots bestimmt. Bullen mit guter Einfrierbarkeit des Ejakulates wiesen einen höheren Gehalt an BSP-A1/A2, -A3 Protein, Clusterin und Spermadhäsin (aSPF) auf als Bullen mit schlechter Einfrierfähigkeit.
Bei letztgenannter Bullengruppe lag ein als Lipocalin-like-Prostaglandin-D-Synthase identifi- ziertes Protein in höherem Anteil vor. Das BSP-A1/A2 bietet aufgrund der hohen Konzentra- tion im Seminalplasma einen Schutz der Spermatozoen während des Kryokonservierungspro- zesses (JOBIM et al. 2004).
2.3 Zusammenhänge zwischen den spermatologischen Parametern und der Fertilität
Als Kriterium für die Befruchtungsleistung einzelner Bullen wird meist die Non-Return-Rate (NRR) herangezogen. Die NRR stellt den prozentualen Anteil von Rindern dar, die innerhalb eines bestimmten Zeitraums nach dem Belegen nicht wieder zur Besamung angemeldet wur- den. Allerdings hängt die NRR nicht nur von der Fertilität des Bullen, sondern auch von zahl- reichen anderen Einflussfaktoren, wie zum Beispiel der Fertilität der Kühe und dem Besa- mungsmanagement ab (JANSEN u. LAGERWEIJ 1987, KOOPS et al. 1995).
Die Beurteilung der Motilität ist die am weitesten verbreitete und meist die einzige Untersu- chungsmethode, mit der die Spermaqualität beurteilt wird. Die Untersuchungen hinsichtlich des Zusammenhangs zwischen Motilität und Fruchtbarkeit kamen in verschiedenen Studien zu unterschiedlichen Ergebnissen (AMANN 1989, BAILEY et al. 1994, BRAHMKSHTRI et al. 1999, JANUSKAUSKAS et al. 2001, 2003). In der Arbeit von BRAHMKSHTRI et al.
(1999) wurde an Samenproben von 10 Bullen lichtmikroskopisch die Motilität, mittels Eosin- Nigrosin-Färbung der Prozentsatz vitaler Spermien und mittels Giemsa-Färbung der Anteil akrosomintakter Spermien erfasst. Die Konzeptionsrate wurde als prozentualer Anteil trächti- ger Kühe, die mit Hilfe transrektaler Palpation festgestellt wurde, erfasst. Keiner der ermittel- ten Qualitätsparameter zeigte allerdings eine signifikante Korrelation zur Konzeptionsrate (r < 0,21; p > 0,05). Auch BAILEY et al. (1994) fanden keine signifikanten Zusammenhänge
zwischen der lichtmikroskopisch ermittelte Motilität und Vitalität der Samenzellen und der NRR 90 (r nicht angegeben; p > 0,05). Dagegen zeigten die Untersuchungen von JANUSKAUSKAS et al. (2001, 2003) einen Zusammenhang zwischen subjektiv geschätztem Anteil vorwärtsbeweglicher Spermien und der NRR 56 (r = 0,67; p < 0,01 bzw. r = 0,59;
p < 0,05). Mit der computergestützten Motilitätanalyse (Computer Assisted Sperm Analysis = CASA) steht ein objektiveres Verfahren zur Verfügung, das neben der Motilität auch Geschwindigkeits- und Distanzparameter angibt. AMANN (1989) untersuchte 20 tiefgefrore- ne bovine Samenproben mit dem CASA-Gerät CellSoft®, das innerhalb einer Sekunde die Motilität von Spermatozoen bestimmte und konnte dabei keinen signifikanten Zusammen- hang zur NRR 75 nachweisen (r = 0,34; p > 0,05). JANUSKAUSKAS et al. (2001, 2003) fanden mittelgradige Korrelationen zwischen der mit CASA ermittelten progressiven Motili- tät und der NRR 56 (r = 0,57; p < 0,05 bzw. r = 0,68; p < 0,01), andere Autoren (BUDWORTH et al. 1988, FARRELL et al. 1998) beobachteten dagegen nur geringe Zu- sammenhänge (r = 0,39; p< 0,05 bzw. r = 0,34; p< 0,05). Unter Einbeziehung der Parameter seitliche Kopfauslenkung (ALH), Kopfschlagfrequenz (BCF), Linearität der Spermienbewe- gung (LIN) und Geschwindigkeitsparameter Velocity average path (VAP) sowie Velocity straigh line (VSL) konnten FARELL et al. (1998) mittels multivariater Regressionsanalyse die NRR 59 genauer vorhersagen (0,68 ≤ r2 ≤ 0,98; p < 0,05). In einer anderen Studie (GILLAN et al. 2008) korrelierte die mit Hilfe der CASA bestimmte progressive Motilität der Spermien von 10 Bullen nicht signifikant mit der NRR 56 (r nicht angegeben; p > 0,05); es ergaben sich jedoch dafür mäßige Zusammenhänge zwischen dem Geschwindigkeitsparame- ter VSL und der NRR 56 (r = 0,48; p < 0,05).
Der Einsatz der durchflusszytometrischen Methoden ermöglicht es, aufgrund der Geschwin- digkeit der Analysen eine hohe Anzahl der Zellen innerhalb kürzester Zeit zu untersuchen (GRAHAM 2001, CHRISTENSEN et al. 2005, GILLAN et al. 2005). Ferner können mit Hil- fe verschiedenster Fluoreszenzfarbstoffe unterschiedliche Zellkompartimente der Spermien beurteilt werden. In Abhängigkeit vom eingesetzten Farbstoff erhält man spezifische Informa- tionen über den funktionalen Zustand der Samenzelle. Es lassen sich zum Beispiel die Integri- tät der Plasmamembran, der akrosomale Status, das Mitochondrienmembranpotential und die Integrität der Spermachromatinstruktur zu bestimmen. Die durchflusszytometrisch ermittelte
Plasmamembranintegrität des Spermas korrelierte in einer von CHRISTENSEN et al. (2005) durchgeführten Studie mit der NRR 56 (r = 0,50; p nicht angegeben), hingegen konnten BOLLWEIN und Mitarbeiter (2008) zwischen den Parametern Plasmamembranintegrität direkt nach dem Auftauen (r = 0,003; p >0,05) bzw. nach dreistündiger Inkubation (r = 0,017;
p > 0,05) keine signifikante Zusammenhänge finden. Die Induzierbarkeit der Akrosomreakti- on in vitro mit Hilfe des Calcium-Ionophors A23187 wurde ebenfalls als aussagefähiger Pa- rameter für die Vorhersage der Fertilität beschrieben (r = 0,60; p < 0,0015) (JANUSKAUSKAS et al. 2000). Der mittels Durchflusszytometrie bestimmte Parameter Mi- tochondrienmembranpotential korrelierte bei kryokonservierten Spermien nicht mit der NRR 56 (ERICSSON et al. 1993, BOLLWEIN et al. 2008). Der mit Hilfe des Spermachroma- tinstruktur Assays ermittelte prozentuale Anteil an DFI-Spermien in kryokonservierten Sa- menproben war negativ mit der NRR der Bullen (Korrelation zwischen dem DFI-Wert unmit- telbar nach dem Auftauen und NRR 56: r = -0,53; p < 0,05, JANUSKAUSKAS et al. 2001 assoziiert; die Korrelation zwischen dem DFI-Wert nach dreistündiger Inkubation bei 37°C und der NRR 56 war etwas höher: r = -0,575; p < 0,05, BOLLWEIN et al. 2008).
Auch die Beurteilung der Morphologie scheint in gewissem Ausmaß für die Prognose der Fertilität der Bullen geeignet zu sein. SÖDERQUIST et al. (1991) stellten fest, dass der Anteil der abnormal geformtem Spermienköpfe negativ mit der NRR 56 zusammenhängt (r = -0,38;
p < 0,05). Des Weiterem fanden GILLAN et al. (2008) eine gute negative Korrelation zwi- schen dem Anteil morphologisch veränderter Spermien und der NRR 56 (r =-0,762; p < 0,01).
Vergleichbare Ergebnisse hatten auch CORREA et al. (1997) erhalten. In ihrer Studie hing die NRR 90 vom prozentualen Anteil der morphologisch intakten Spermatozoen ab (r = 0,59;
p < 0,01).
Zur Fertilitätsprognose wird auch der Hypoosmotische Schwelltest (HOST) angewendet (JEYENDRAN et al. 1984). Das Prinzip dieses Tests beruht darauf, dass nur eine intakte funktionsfähige Plasmamembran in der Lage ist, ein osmotisches Gefälle auszugleichen. Die hypotone Belastung verursacht eine Schwellung, die durch Aufrollen und Anschwellen des Spermienschwanzes erkennbar ist (DREVIUS 1972). Einen Zusammenhang zwischen HOST und Plasmamembranintegrität bzw. Motilität von Bullensperma stellten CORREA und
ZAVOS (1994) fest (r = 0,81; p < 0,05 bzw. r = 0,73; p <0,05). REVELL und MRODE (1994) fanden eine Korrelation zwischen dem Anteil plasmamembranintakter Spermien nach Anwendung des HOST und der NRR 49 (r = 0,37; p nicht angegeben). Vergleichbare Ergeb- nisse (r = 0,57; p < 0,01) wurden in Untersuchungen von CORREA et al. (1997) beobachtet.
Andere Autoren konnten dagegen keine signifikanten Korrelationen zwischen den mit HOST ermittelten Parametern und dem Befruchtungsvermögen feststellen (ROTA et al. 2000, MEARA et al. 2008).
3. MATERIAL UND METHODEN
3.1 Material
3.1.1 Versuchstiere und Samenproben
Zur Gewinnung des Versuchsspermas standen 18 Bullen der Rasse Deutsches Fleckvieh des Besamungsvereins Neustadt a. d. Aisch (BVN) zur Verfügung. Das Alter lag zwischen vier und neun Jahren (Mittelwert 6,43 ± 1,58 Jahre). Für den ersten Versuchsabschnitt (3.2.1) wurden von 15 Bullen jeweils 3 bis 5 Ejakulate (insgesamt 57 Ejakulate) und im zweiten Ver- suchsabschnitt (3.2.2) von 6 Bullen jeweils 4 bis 5 Ejakulate (insgesamt 28 Ejakulate) heran- gezogen. Alle Tiere zeigten während der gesamten Versuchsdauer ein ungestörtes Allgemein- befinden.
Die Samengewinnung erfolgte zwei- bis dreimal wöchentlich mit Hilfe der künstlichen Scheide Modell „Neustadt/Aisch“ (Fa. Müller, Nürnberg, Deutschland) im Sprungraum der Besamungsstation. Für den Aufsprung standen Unterstellbullen oder ein Phantom zur Verfü- gung. Die Ejakulate wurden in Kunststoffröhrchen (REF 11023/0018, Fa. Minitüb, Tiefen- bach, Deutschland) aufgefangen und unmittelbar danach in ein auf 32°C eingestelltes Kugel- bad (REF 12055/5000, Fa. Minitüb, Tiefenbach, Deutschland) verbracht.
Im Anschluss an die Samengewinnung erfolgte eine visuelle Beurteilung, wobei auf Farbe, Konsistenz und Beimengungen geachtet wurde. Die subjektive Schätzung des Anteils vor- wärtsbeweglicher Spermien im nativen Ejakulat wurde durch erfahrenes Laborpersonal mit Hilfe eines Mikroskops, das mit einer Thermoplatte ausgestattet war (Typ Eclipse 50i, Fa.
Nikon, Hamburg, Deutschland), ermittelt. Nur die Ejakulate, die mindestens 70% vorwärts- bewegliche Spermien aufwiesen, wurden für die Kryokonservierung weiterverarbeitet. Unter der Verwendung einer Laborwaage (Typ 527, Fa. Kern, Balingen-Frommern, Deutschland) fand die Bestimmung des Ejakulatvolumens statt. Die Spermienkonzentration wurde mit ei- nem Photometer (SMD 5, Fa. Minitüb, Tiefenbach, Deutschland) bestimmt, nachdem die Sa- menprobe mit 0,9%iger NaCl-Lösung im Verhältnis 1:100 verdünnt worden war. Die laborei-
gene Software „BullenDoku“ (Datenbank Microsoft Access) errechnete die erforderliche Verdünnermenge für den Erhalt einer Spermienkonzentration von 60 x 106 /ml. Für die Ver- dünnung der nativen Ejakulate wurde Triladyl® (Minitüb, Tiefenbach, Deutschland) bzw.
Biladyl® (Minitüb, Tiefenbach, Deutschland) herangezogen, wobei der Verdünnungsprozess in zwei Schritten erfolgte. Zunächst wurde das Ejakulat im Split-Sample Verfahren geteilt und mit 20 ml Triladyl® (konstante Verdünnermenge) bzw. Biladyl®, die auf 32°C temperiert waren, vorverdünnt und anschließend in ein 23°C warmes Wasserbad umgesetzt. Zwanzig Minuten nach der Samengewinnung fand die Endverdünnung mit der restlichen errechneten Verdünnermenge statt und dann wurde der verdünnte Samen zur Äquilibrierung in einen Kühlraum verbracht. Nach einer 24-stündigen Äqulibrierungszeit bei 4°C erfolgte das Abfül- len in Pailletten (Typ Mini Paillette 0,25ml, Fa. IMV, L`Aigle, Frankreich) und das gleichzei- tige Bedrucken der Besamungsportionen mit einem integrierten Tintenstrahldrucker (Typ JET 2 SE, Fa. Leibinger, Tuttlingen, Deutschland) in einem auf 4°C temperierten Kühlkabinett (Typ 14335/0401, Fa. Minitüb, Tiefenbach, Deutschland). Danach wurden die Pailletten auf Rampen aufgelegt und visuell kontrolliert. Das Einfrieren der Besamungsportionen erfolgte in Stickstoffdampf bei -95°C für 9 Minuten (NIFA Technologies, Leeuwarden, Niederlande). Im Anschluss wurden die Pailletten in flüssigen Stickstoff überführt und in einem Container bei -196°C gelagert.
3.2 Versuchsaufbau
3.2.1 Auswirkungen einer verkürzten Glyzerineinwirkungszeit auf die Qualität von Bullensperma
Von 15 Bullen wurden jeweils 3 bis 5 Ejakulate verwendet, so dass insgesamt 57 Ejakulate zur Verfügung standen. Im Versuch wurde überprüft, welchen Einfluss eine verkürzte Glyze- rineinwirkungszeit sowie eine Glyzerinzugabe kurz vor der Konfektionierung auf die Sper- mienqualität hat. Die nativen Ejakulate wurden im Split-Sample Verfahren vorbereitet, wobei die Versuchs-Charge nur mit der glyzerinfreien Verdünnerkomponente Biladyl® (Fraktion A)
verdünnt wurde. Die vorausberechnete Glyzerinmenge (6,4%) wurde von der Verdünnermen- ge abgezogen. Für den Kontrollansatz wurde der glyzerinhaltige Verdünner Triladyl® ver- wendet. Das verdünnte Sperma wurde in den Kühlraum verbracht und einer Äquilibrie- rungsphase von 24 Stunden unterzogen. Die verbleibende Glyzerinmenge wurde im Verhält- nis 1:1 mit Biladyl® (Fraktion A) vermischt und anschließend auf 4°C abgekühlt. Die Glyze- rinzugabe erfolgte vor dem Abfüllen bei der Kühlraumtemperatur (4°C) nach den Angaben von ROTHE et al. (2009). Unter leichten Schwenk- und Drehbewegungen wurde das Glyze- ringemisch tropfenweise zugesetzt. Die verschlossene Verdünnerflasche verblieb für 10 Mi- nuten bei 4°C stehen. Im Anschluss wurde der Samen in die Pailletten abgefüllt und eingefro- ren.
Für die spermatologischen Untersuchungen wurden zu folgenden Zeiten Proben entnommen:
• 3 Stunden nach der Verdünnung
• nach Ablauf der Äquilibrierungszeit
• 10 Minuten nach der Glyzerinzugabe zu Biladyl®
• frühestens 24 Stunden nach dem Einfrieren der Samenproben
An dem flüssigkonservierten Samen wurden die Integritäten der Plasmamembran, des Akro- soms, das Mitochondrienmembranpotential und die Spermienmorphologie bestimmt. Die Messung der Motilität erfolgte jeweils nach einer 30-minütigen Inkubation bei 37°C.
Die Laboruntersuchungen der gefrierkonservierten Samenproben erfolgten an jeweils 4 Pail- letten, die nach dem Auftauen gepoolt worden waren. Die Plasma- und Akrosommembranin- tegrität, das Mitochondrienmembranpotential, die Induzierbarkeit der Akrosomreaktion mit- tels Calcium-Ionophor sowie die Motilität, Morphologie und die Überlebensrate unter hypo- osmotischen Bedingungen wurden bestimmt. Zur Untersuchung der DNA Integrität wurde je eine Paillette pro Charge herangezogen. Die Analyse erfolgte unmittelbar und drei Stunden nach der Inkubation bei 37°C.
Für die Ermittlung des Besamungserfolges wurde die Non-Return-Rate 90 Tage nach der Be- samung im Zeitraum von Mai 2010 bis Mai 2011 verwendet.
