Die Qualität vitrifizierter Embryonen nach dem Auftauen lässt sich durch zahlreiche verschiedene Parameter messen. VAN WAGTENDONK-DE LEEUW et al. erklärten 1997, dass neue Konservierungsmethoden für Embryonen in drei Versuchsphasen, in denen diese Parameter untersucht werden, etabliert werden müssen.
In der ersten Versuchsphase wird zunächst die In-vitro-Überlebensfähigkeit beurteilt.
Dies erfolgt anhand der Beurteilung morphologischer Kriterien, wie der Reexpansions- und Schlupfrate nach dem Auftauen und durch die Analyse von Zellfärbungen zur Beurteilung der Gesamtzellzahl oder der Lebend-Tot-Zellratio. Des Weiteren kann die Qualität auf molekularer Ebene untersucht werden. Dazu gehört beispielsweise die Beurteilung der Ultrastruktur der Embryonen oder die Analyse entwicklungsrelevanter Gentranskripte durch eine Reverse Transkriptase quantitative PCR (RT-qPCR).
In der zweiten Phase einer Versuchsreihe wird die In-vivo-Überlebensfähigkeit überprüft. Die Ermittlung von Trächtigkeitsraten und die Untersuchung der geborenen Kälber gilt als das geeignetste Verfahren, um die Qualität von Embryonen beurteilen zu können (Proof of Principle). Häufig sind solche Untersuchungen aber aus zeitlichen und wirtschaftlichen Gründen nicht möglich.
In der dritten Versuchsphase folgt eine Studie, in der die Methode unter praxisnahen Bedingungen getestet und bewertet wird (VAN WAGTENDONK-DE LEEUW et al.
1997).
Die einfachste und am häufigsten eingesetzte Methode zur morphologischen Qualitätsbeurteilung vitrifizierter Embryonen ist die Messung der Reexpansions- und Schlupfraten nach dem Auftauen. Die Raten innerhalb verschiedener Versuchsreihen zu vergleichen ist jedoch schwierig, da sie von vielen verschiedenen Parametern, wie dem Kulturmedium, dem Alter und der Entwicklungsphase der vitrifizierten Embryonen abhängig sind. In Tabelle 12 sind die Reexpansions- und Schlupfraten verschiedener Versuche aufgelistet.
Tabelle 12: Übersicht über Reexpansions- und Schlupfraten boviner Embryonen nach Vitrifikation (*Schlupfrate bezogen auf die Anzahl reexpandierter Embryonen)
Autor Medien Reexpansionsrate Schlupfrate
SAHA et al. (1996)
EG 52,9% 19,6%
EG + Trehalose 75,0% 42,5%
EG + Trehalose +
PVP 84,1% 68,2%
SOMMERFELD u.
NIEMANN (1999)
EG - 41,8-51,4%
Ohne Vitrifikation - 89,9%
NEDAMBALE et al.
(2004b) Glyzerin 44-83% 30-63%
PARK et al. (2006) EFS 77,0-88,2% 52,9-68,2%
ohne Vitrifikation - 83,8%
MUCCI et al. (2006) EG + DMSO 52,1% 43%
GÓMEZ et al. (2009) EG + DMSO 16,2-50,4% 8,3-35,0%
SHIRAZY et al. (2009) Glyzerin + EG 22,2-69,9% 17,1-61,1%*
STACHECKI et al. (2008) Glyzerin + EG 93,6% -
LEROY et al. (2010) EG + DMSO 64,3% 35,7%
INABA et al. (2011) EG + DMSO 100% 95,5%
Glyzerin + EG 100% 97,3%
STINSHOFF et al. (2011) EG + DMSO 81,1% 63,2%
SIQUEIRA-FILHO et al.
(2011) EG + DMSO 79-90% 63-76%
Eine weitere morphologische Beurteilungsmöglichkeit ist die Ermittlung der Gesamtzellzahl boviner Embryonen. Bei einem Vergleich zwischen in vivo generierten Embryonen, welche bis Tag neun nach der Ovulation durch die Spülung superovulierter Spendertiere gewonnen wurden, und in vitro produzierten Embryonen, konnte bei den in vivo generierten Embryonen eine signifikant höhere
Gesamtzellzahl ab dem achten Tag nach der Ovulation ermittelt werden. In diesem Entwicklungsstadium wurde eine mittlere Zellzahl von 305,7 ± 29,9 Zellen pro Embryo bei den in vivo generierten Embryonen und 169,4 ± 20,0 Zellen pro Embryo bei den in vitro produzierten gemessen (USHIJIMA et al. 2008). Der Vergleich der Gesamtzellzahl und der Lebend-Tot-Zellratio wird auch zur Ermittlung der Qualität vitrifizierter boviner Embryonen verwendet. Dazu können verschiedene Zellfärbemethoden verwendet werden. STACHECKI et al. verwendeten 2008 für die Färbung boviner Blastozysten nach dem Auftauen mit Propidiumiodid und Hoechst 33342 eine invasive Färbemethode, die den Tod der Embryonen zur Folge hat, und ermittelten durch diese Methode die Anzahl lebender Zellen pro Embryo. Sie konnten eine mittlere Überlebensrate von 93,6% der Zellen nach der Vitrifikation erreichen.
Auch MUCCI et al. (2006) verwendeten eine solche Färbemethode, dabei verglichen sie die mittlere Gesamtzellzahl in vitro produzierter Embryonen aus verschiedenen Kultursystemen und nach Vitrifikation im Blastozystenstadium. Die Gesamtzellzahl der nicht vitrifizierten Blastozysten aus verschiedenen Kultursystemen schwankte zwischen 124,7 ± 4,9 und 142,1 ± 4,7 Zellen. Die Gesamtzellzahl der vitrifizierten Blastozysten war mit 96,6 ± 2,4 Zellen signifikant niedriger als die der nicht kryokonservierten Embryonen. Auch die Verwendung von Ethidium homodimer und Hoechst 33342 stellt eine invasive Lebend-Tot-Färbung dar. STINSHOFF et al.
ermittelten mit Hilfe dieser Methode 2011 die Gesamtzellzahl und die Lebend-Tot-Zellratio boviner Blastozysten, konnten aber keine signifikanten Unterschiede feststellen. In Tabelle 13 sind die Ergebnisse von Zellfärbemethoden verschiedener Autoren vergleichend aufgeführt.
Tabelle 13: Durchschnittliche Zellzahl boviner Blastozysten sowie Lebend-Tot-Zellratio nach Vitrifikation oder ohne Kryokonservierung (n.u. = nicht untersucht, - = keine Vitrifikation)
Autoren Vitrifikationsmedien Zellzahl nach Vitrifikation Lebend-Tot-Zellratio nach Vitrifikation Zellzahl ohne Vitrifikation Lebend-Tot-Zellratio ohne Vitrifikation
SOMMERFELD
u. NIEMANN (1999) EG 130,5 ± 2,9 21,0 n.u. n.u.
MUCCI
et al. (2006) EG + DMSO 96,6 ± 2,4 n.u. 124,7-142,1 n.u.
GÓMEZ
et al. (2009) EG + DMSO 127,2 ± 7,6 n.u. 162,5 ± 5,5 n.u.
SHIRAZY
et al. (2009) Glyzerin + EG 55,8-101,6 3,0-6,6 93,4-128,3 22-22,5 LEROY
et al. (2010) - n.u. n.u. 146,9 ± 34,2 n.u.
STINSHOFF
et al. (2011) EG + DMSO 121,3 ± 21,2 15,3 130,2 ± 25,5 17,9 SUDANO
et al. (2012) - n.u. n.u. 140,1 ± 2,9 n.u.
Die Übertragung von Embryonen auf Empfängertiere und die Ermittlung der Trächtigkeitsraten sowie die Untersuchung der Kälber nach der Geburt ist eine weitere Möglichkeit, die Qualität vitrifizierter Embryonen zu ermitteln. Beim Vergleich von Trächtigkeitsraten zwischen verschiedenen Versuchsgruppen können starke Unterschiede gefunden werden. AL-KATANANI et al. verglichen 2002 die Trächtigkeitsraten nach Transfer von vitrifizierten bovinen Embryonen mit denen nicht kryokonservierter IVP-Embryonen. Dabei war die Rate bei den vitrifizierten Embryonen mit 6,5% signifikant niedriger als die der frisch übertragenen (19,0%). Bei einer großen, praxisnahen Versuchsreihe wurden 1997 insgesamt 728 kryokonservierte bovine Embryonen auf Empfängertiere übertragen, von denen 393 in Glyzerin vitrifiziert und 335 konventionell kryokonserviert wurden. Dabei konnten
Trächtigkeitsraten von 44,5% bei den vitrifizierten und von 45,1% bei den konventionell kryokonservierten bovinen Embryonen ermittelt werden (VAN WAGTENDONCK-DE LEEUW et al. 1997). INABA et al. entwickelten 2011 eine Methode zum Direkttransfer vitrifizierter boviner Embryonen und erreichten damit Trächtigkeitsraten von bis zu 40%. Die Trächtigkeitsraten dieser Versuche und anderer Versuchsreihen sind vergleichend in Tabelle 14 zusammengefasst.
Tabelle 14: Trächtigkeitsraten kryokonservierter und nicht-kryokonservierter boviner in vitro produzierter Embryonen unterschiedlicher Herkunft (d=Tag)
Autor Methode (Medium) Herkunft der
Embryonen Trächtigkeitsraten
(1996) Vitrifikation (EG + PVP
+ Trehalose) IVP 60% (lebende
Vitrifikation (Glyzerin) In vivo Produktion 44,5% (d90) Konventionelle
Kryokonservierung
(Glyzerin) In vivo Produktion 45,1% (d90)
MARTINEZ et al. Keine Vitrifikation IVP 42,8 (d30)
35,7 (d60) Keine Vitrifikation IVP 40% (d60-70)
30,9% (lebende Kälber)