mRNA-Analyse

Die Untersuchung der entwicklungsrelevanten Gentranskripte mittels RT-qPCR erfolgte an geschlüpften Blastozysten aus den beiden Vitrifikationversuchen (V1, V2) sowie aus den drei Kontrollgruppen (K, KV1, KV2). Die Blastozysten wurden zuvor unter mikroskopischer Kontrolle dreimalig durch PVA-Waschtropfen pipettiert und in möglichst wenig PVA-Medium bei -80°C in silikonisierten Eppendorf-Cups eingefrorenen. Die zu untersuchenden entwicklungsrelevanten Gentranskripte waren SLC2A1, TJP1, IFNT2, HSPA1A, DSC2 und PTGS2. In Tabelle 25 sind die verwendeten Primersequenzen für die PCR aufgelistet.

Tabelle 25: Primersequenzen der verwendeten Primer

Transkript Sequenz (5‘-3‘) Amplifikatgröße (bp) Startposition des Primers Accession Number

SCL2A1 Dynabeads-Suspension aus dem verwendeten Dynabeads® mRNA DIRECT™ Micro Kit (Fa. Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland) vorbereitet werden. Die Dynabeads-Suspension wurde zunächst auf einem Vortexer homogenisiert, jeweils

10 µl pro zu untersuchender Probe entnommen und in ein Eppendorf-Gefäß überführt. Um die Dynabeads von der Flüssigkeit zu separieren, kamen die Eppendorf-Gefäße auf einen Magnetic Particle Concentrator (MPC). Durch die magnetische Wirkung wurden die Dynabeads an den Rand des Eppendorf-Gefäßes gezogen, wodurch der Puffer-Überstand einfacher abgenommen werden konnte. Es erfolgte eine Resuspension der Dynabeads durch 10 µl Lysis/Binding Puffer pro zu untersuchender Probe und eine erneute Abnahme des Überstandes auf dem MPC.

Nach einem weiteren Waschschritt mit Lysis/Binding Puffer waren die Dynabeads für die Isolierung der mRNA vorbereitet.

3.8.3.2. Isolierung der mRNA aus den geschlüpften Blastozysten

Zu jeder Probe wurden zunächst 150 µl des im Kit enthaltenen Lysis/Binding-Puffers sowie 1 µl Kaninchen-Globin-mRNA in einer Konzentration von 1pg/ µl zugegeben.

Die Kaninchen-Globin-mRNA diente als externer Standard. Anschließend wurden die Proben für 10 Sekunden gevortext, kurz zentrifugiert und für 10 Minuten zum Inkubieren bei Raumtemperatur stehen gelassen. Darauf folgte die Zugabe von 10 µl der vorbereiteten Dynabeads-Suspension pro Probe und eine erneute Inkubation für fünf Minuten in einem Thermoblock bei 20°C unter leichter Bewegung. In dieser Zeit fand die Bindung der Dynabeads an den PolyA-Schwanz der mRNA statt. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden die Proben erneut in den MPC verbracht und der Überstand entfernt. Es folgten mehrere Waschschritte. Zunächst wurden die Proben durch Zugabe von 100 µl Washing Buffer A resuspendiert, der Überstand erneut im MPC abgenommen und dreimalig mit jeweils 100 µl Washing Buffer B resuspendiert.

Nach dem letzen Waschschritt wurde der Überstand erneut abgenommen, die Proben mit 11 µl H₂O (Ampuwa, Fresenius) versetzt und zur Lösung der mRNA von den Dynabeads für drei Minuten in einen Thermomixer (Fa. Eppendorf, Hamburg) bei 65°C verbracht. Anschließend wurde der MPC auf Eis gestellt. Der Überstand enthielt die isolierte mRNA, die direkt für die Reverse Transkription weiter verwendet wurde.

3.8.3.3. Reverse Transkription

Die Reverse Transkription der mRNA zu cDNA fand in fünf Ansätzen statt (Tab. 26):

Die Probe mit der geschlüpften Blastozyste (Probe), eine Positivkontrolle für Globin (Globin-Standard), eine Negativ-Kontrolle der Probe ohne den Zusatz einer Reversen Transkriptase und eines RNAse Inhibitors (Negativ-Probe), eine Negativ-Kontrolle des Standards ebenfalls ohne den Zusatz einer Reversen Transkriptase und eines RNAse Inhibitors (Negativ-Standard) sowie eine Medien-Kontrolle in der anstatt eines mRNA-Zusatzes nur steriles Wasser beigefügt wurde. Diese diente dazu eine Kontamination der Medien auszuschließen.

Tabelle 26: Ansätze für dir Reverse Transkription (Endvolumen der Ansätze 20 µl)

Zusatz Konzentration Endkonzentration Probe Globin-Standard Negativ-Standard Negativ-Probe Medien-Kontrolle

MgCl₂ 50 mM 5 mM 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl PCR-Puffer 10x 1x 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl dNTPs 10 mM 1 mM 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl Hexamer Primer 50 mM 2,5 µM 1 µl 1 µl 1 µl 1 µl 1 µl RNAse Inhibitor 20 IE/µl 20 U 1 µl 1 µl - - 1 µl MuLV RT 50 IE/µl 50 U 1 µl 1 µl - - 1 µl

mRNA Globin 1 pg/µl - 1 µl 1 µl - -

mRNA Probe 10,7 µl - - 0,3 µl -

H2O ad 20 µl

Bei der Herstellung der verschiedenen Ansätze wurden die Proben durchgängig auf Eis gelagert. Die Reverse Transkription fand in einem PCR-Cycler (Fa. Biometra, Göttingen) statt, dabei durchliefen die Proben das unten aufgeführte 75minütige Programm, währenddessen die mRNA in cDNA umgeschrieben wurde.

 10 Minuten bei 25°C

 60 Minuten bei 42°C

 5 Minuten bei 99°C

Im Anschluss an die Reverse Transkription wurden die Proben direkt auf Eis gelagert und der PCR zugeführt. Der Transport und die Lagerung der Proben zwischen den einzelnen Schritten fanden ebenfalls immer auf Eis statt.

3.8.3.4. Polymerase-Kettenreaktion

Für die Quantifizierung der Intensität der Expression entwicklungsrelevanter Gentranskripte ging die zuvor erhaltene cDNA in die real time PCR (qPCR) ein. Die bei der PCR verwendeten Embryonenäquivalente variierten je nach untersuchtem Gen. Sie sind in Tabelle 27 ersichtlich. Die PCR wurde im doppelten Ansatz durchgeführt.

Tabelle 27: Eingesetzte Embryonenäquivalente der zu untersuchenden Gentranskripte

Gen Embryonenäquivalent (einfacher Ansatz)

Embryonenäquivalent (doppelter Ansatz) Globin

(Embryo) 0,05 0,1

SLC2A1 0,1 0,2

TJP1 0,025 0,05

IFNT2 0,05 0,1

HSPA1A 0,05 0,1

DSC2 0,025 0,05

PTGS2 0,0125 0,025

Die real time PCR wurde mit einem Endvolumen von 20 μl durchgeführt. Die Ansätze für die PCR sind in Tabelle 28 ersichtlich. Der kommerziell erhältliche

„Mesa Green qPCR MasterMix Plus for SYBR Assay w/ fluorescin“ (MasterMix PCR, Fa. Eurogentec, Köln) enthielt: Desoxyribonukleosidtriphosphate (dNTPs), Meteor Taq Polymerase, MgCl2, SYBR Green I, Stabilisatoren und Fluoreszin. Für die Untersuchung jedes Gens wurden mindestens 5 Wiederholungen durchgeführt.

Tabelle 28: Ansätze für die Real-Time PCR

Medium Medium Endkonzentration Einfacher Ansatz

MasterMix PCR 1,0 10 μl

Primer forward 0,2 μM 0,4 μl

Primer reward 0,2 μM 0,4 μl

cDNA 0,25-2 μl

H2O ad 20 μl

Die Proben wurden nach ihrer Bearbeitung direkt der qPCR zugeführt. Dabei startete das Programm zunächst mit einer zehnminütigen Denaturierungsphase bei 95°C.

Darauf folgten 43 Zyklen in denen die cDNA vervielfacht wurde. Das Programm durchlief dabei in jedem Zyklus die folgenden Schritte:

 15 Sekunden bei 95°C (Trennung der doppelsträngigen DNA)

 30 Sekunden bei 60°C (Anlagerung der Primer)

 30 Sekunden bei 70°C (Amplifikation)

Die Quantifizierung der erhaltenen cDNA fand über eine kontinuierliche Messung der Fluoreszenz statt. Dabei wurde die Fluoreszenz des Farbstoff-DNA-Komplexes aus dem enthaltenen SYBR-green-Fluorenzenz-Farbstoff und der doppelsträngigen DNA gemessen. Die Verifikation der PCR-Fragmente erfolgte durch eine Schmelzkurve mit schrittweiser Erhöhung der Temperatur um 0,5°C alle 10 Sekunden beginnend bei 55°C mit einer Endtemperatur von 95°C.