Zona occludens-Protein 1 (TJP1)

Die Kommunikation zwischen Zellen findet über sogenannte Zellverbindungsmoleküle statt. Zu diesen Zellverbindungen gehören die Tight junctions (TJ), welche zwei Hauptfunktionen in Epithelzellen haben. Zum einen bilden die TJ durch die gürtelartige Umhüllung von Zellen und den Kontakt mit den TJ der Nachbarzellen eine parazelluläre Barriere, durch welche der transepitheliale Austausch von Molekülen reguliert wird, zum anderen trennen die TJ innerhalb der Zellmembran von Epithelzellen die apikale von der basolateralen Seite (SHETH et al.

1997, STEVENSON u. KEON 1998). Die TJ sind ein Multiproteinkomplex, bestehend aus integralen Membranproteinen, welche die interzellulären Verbindungen herstellen, und zytoplasmatischen Plaque-Proteinen, wie dem Zona occludens-Protein 1 (TJP1/ZO-1), welche die TJ mit dem Aktinzytoskelett verbinden (STEVENSON u. KEON 1998, MILLER et al. 2003). Das TJP1 war das erste Protein, welches in diesem Multiproteinkomplex entdeckt wurde. Es handelt sich um ein Phosphoprotein, welches in der Zellmembran lokalisiert ist und eine speziesspezifische molekulare Masse von 210 bis 225 kDa aufweist (STEVENSON et al. 1986).

Es gibt zwei Isoformen des TJP1, welche sich in einer 80 Aminosäure großen Terminale, genannt α, unterscheiden und durch alternatives Slicen der mRNA-Vorstufe entstehen (WILLOTT et al. 1992, BALDA u. ANDERSON 1993). Die eine als ZO-1α+ bezeichnete Isoform wird in allen herkömmlichen Epithelzellen gefunden, während die andere Isoform, ZO-1α-, nur in spezialisierten Epithelzellen, wie den Sertolizellen, zu finden ist (SHETH et al. 1997).

In Embryonen werden beide Isoformen des TJP1 exprimiert. Zwar kann auch schon im Oozyten-Stadium und in der frühembryonalen Entwicklung von Mäuseembryonen TJP1 nachgewiesen werden, die entscheidende Expression beginnt jedoch mit der Kompaktierung des Embryos. Die zuvor deutlich voneinander getrennt liegenden Zellen fangen an, Verbindungen aufzubauen, wodurch die Differenzierung in TE und ICM beginnt. Bei Mäuseembryonen findet die Kompaktierung ab dem 8-Zell-Stadium statt (VESTWEBER et al. 1987). Die Menge des exprimierten TJP1 steigt ab dem

Morula-Stadium stark an, was mit der Aktivierung des embryonalen Genoms in Verbindung gebracht werden kann. Dabei wurde ermittelt, dass sich die Expression zwischen in vitro und in vivo generierten Mäuseembryonen nicht voneinander unterscheidet. Allerdings konnte festgestellt werden, dass bovine Embryonen, welche eine kurze Kompaktierungsphase und somit eine schnelle Entwicklung zur Blastozyste aufwiesen signifikant weniger TJP1 exprimierten als Embryonen, die sich langsamer entwickelten und somit mehr Zeit für die Kompaktierung hatten (MILLER et al. 2003).

Sowohl in murinen als auch in porcinen Embryonen konnte die ZO-1α- -Isoform schon in frühembryonalen Stadien, ab dem 2-Zell-Stadium, ermittelt werden, während die ZO-1α+ -Isoform erst ab dem Zeitpunkt der embryonalen Genomaktivierung detektiert wurde (SHETH et al. 1997). Dabei stieg die detektierbare Menge bei den porcinen Embryonen ab dem Morula-Stadium deutlich an (XU et al. 2012).

Bei bovinen Embryonen konnte TJP1 zunächst nur im Blastozystenstadium detektiert werden (SHEHU et al. 1996). BARCROFT et al. gelang 1998 der TJP1-Proteinnachweis durch Immunfluoreszenz bereits im Morula-Stadium. Die Lokalisation war beim Rind auf die Zellen des TE beschränkt und stieg bei der Entwicklung zur Blastozyste stark an (BARCROFT et al. 1998). Ein deutlicher Anstieg in der Menge des TJP1-Transkripts war auch bei dem Vergleich von Tag 7- und Tag 8 Blastozysten zu erkennen (WRENZYCKI et al. 2003). Bei der Kryokonservierung boviner Blastozysten konnte ermittelt werden, dass Blastozysten, welche durch Vitrifikation oder konventionelle Kryokonservierung eingefroren wurden signifikant weniger TJP1 exprimierten als solche, die nicht kryokonserviert wurden (STINSHOFF et al. 2011).

2.7.3. Interferon  (IFNT2)

Interferon (IFNT2) oder auch bovines-Trophoblastenprotein-1 genannt gehört zur Familie der Typ-I Interferone. Es wird von bovinen Embryonen gebildet und dient als primäres Signal zur maternalen Erkennung der Trächtigkeit (BAZER 1992,

JOHNSON et al. 2006). Die Ausschüttung des Proteins erreicht in der Zeitspanne zwischen Tag 15 und 24 der Trächtigkeit ein Maximum (BARTOL et al. 1985). In dieser Zeitspanne erfolgt normalerweise die pulsatile Ausschüttung von PGF2α durch das Endometrium und eine dadurch bedingte Luteolyse des zyklischen Gelbkörpers. Durch die Ausschüttung des IFNT2 wird die luteolytische Wirkung des PGF2α gehemmt, was zum Erhalt der Trächtigkeit führt (FARIN et al. 1990). Die Ausschüttung des IFNT2 erfolgt dabei ausschließlich aus den Zellen des TE, in den Zellen der ICM konnte IFNT2 nicht nachgewiesen werden (FARIN et al. 1990, WRENZYCKI et al. 2003). Der Nachweis ist daher abhängig von einem funktionierenden TE und kann bei bovinen Embryonen ab dem Blastozystenstadium erfolgen (HERNANDEZ-LEDEZMA et al. 1993, WRENZYCKI et al. 1998).

Die Menge des vorhandenen IFNT2-Proteins hängt von verschiedenen Faktoren ab.

Dabei steigt die embryonale Bildung ab dem Stadium der expandierten Blastozyste zunächst an und erreicht an Tag 15-24 der Trächtigkeit, also zum Zeitpunkt der Implantation bei bovinen Embryonen, einen Höchstwert (BARTOL et al. 1985). Auch bei in vitro produzierten Embryonen steigt die IFNT2-Bildung ab dem Stadium der expandierten Blastozyste an. Die Menge des exprimierten IFNT2 ist bei IVP-Embryonen im Gegensatz zu in vivo generierten höher (WRENZYCKI et al.

2001, LONERGAN et al. 2003). Auch verschiedene Kultursysteme haben einen Einfluss auf die Höhe der Expression. So konnten WRENZYCKI et al. 1999 nachweisen, dass Embryonen, die in Anwesenheit von Serum kultiviert wurden, eine höhere IFNT2-Expression aufwiesen als solche, die in Medien mit PVA-Zusatz kultiviert wurden. Diese Ergebnisse wurden 2003 durch RIZOS et al. bestätigt. Sie konnten ebenfalls nachweisen, dass Embryonen aus Kultursystemen mit einem Zusatz von FCS höhere IFNT2-Expression zeigten als solche aus Kulturen ohne Serumzusatz.

KUBISCH et al. konnten 1998 eine negative Korrelation zwischen der frühen Expression von IFNT2 und der Entwicklungskompetenz von IVP-Embryonen feststellen. Ebenso konnten sie 2004 nachweisen, dass die Trächtigkeitsraten nach Transfer von Embryonen, welche ein niedrigeres IFNT2-Level auswiesen, besser waren, als die von Embryonen, die früh IFNT2 ausbildeten (KUBISCH et al. 2004).

Dies wurde durch GUTIÉRREZ-ADÁN et al. 2004 bestätigt. Sie konnten in IVP-Embryonen schon an Tag 3 eine geringe Expression von IFNT2 und damit eine anormale Transkription nachweisen. Des Weiteren ermittelten sie bei sich langsam entwickelnden und damit qualitativ schlechteren Embryonen eine höhere Expression von IFNT2.

Einen Einfluss von Kryokonservierungsmethoden auf die Menge der IFNT2-Expression konnte nur bei der konventionellen Kryokonservierung festgestellt werden. Die konventionell kryokonservierten Embryonen wiesen nach dem Auftauen eine signifikant höhere Expression IFNT2 auf. Die Expression bei vitrifizierten im Vergleich zu nicht kryokonservierten Embryonen war dagegen nicht unterschiedlich (STINSHOFF et al. 2011). Im Gegensatz dazu konnten YAO et al. 2009 beim Vergleich zwischen konventionell kryokonservierten und in vivo generierten Embryonen keine Unterschiede in der IFNT2-Expression feststellen.

2.7.4. Hitzeschockprotein 70 (HSPA1A)

Bei den Hitzeschockproteinen handelt es sich um eine Gruppe von Proteinen, die aufgrund ihrer molekularen Masse in verschiedene Familien eingeteilt werden (LINDQUIST u. CRAIG 1988). Eine dieser Familien ist die Familie der HSP70-Proteine, welche heute auch als HSPA1A-Proteine bezeichnet werden. Diese Proteine haben eine hohe Affinität zu Adenosintriphosphat (ATP) und kommen in allen Säugetierzellen vor. Sie wurden erstmals 1962 durch RITOSSA entdeckt und dienen unter anderem zum Schutz der Zelle vor Hitzestress und als Chaperone bei der Faltung von Proteinen. Als Chaperone übernehmen die Hitzeschockproteine weitere Aufgaben, wie die Zersetzung instabiler Proteine, den Im- und Export von Proteinen, die Auflösung von Proteinkomplexen oder die Neufaltung falsch gefalteter Proteine (NOVER u. SCHARF 1997, GARRIDO et al. 2001). Das HSPA1A-Protein besteht aus zwei wichtigen Domänen, dem N-Terminal, welcher für die Bindung von ATP zuständig ist, und dem C-Terminal, welcher zur Protein-Interaktion dient. In Säugetierzellen gibt es zwei vorkommende Arten des HSPA1A. Die eine Art wird ständig exprimiert und dient dazu, die Zelle bei der Proteinfaltung zu unterstützen,

die andere Form wird durch Stressfaktoren induziert (GARRIDO et al. 2001). Solche Stressfaktoren können beispielsweise Temperaturveränderungen und die Auswirkung von Ethanol oder Schwermetallen auf die Zelle sein (LINDQUIST u.

CRAIG 1988). Das HSPA1A dient dazu die zellulären Strukturen vor solchen Stressoren zu schützen (DUNCAN u. HERSHEY 1989).

Es ist bekannt, dass Hitzestress eine Auswirkung auf die Trächtigkeit von Säugetieren haben kann. So wird durch hohe Temperaturen in der Phase ab der ersten Teilung der Embryonen die embryonale Sterblichkeit erhöht. Auch bei in vitro produzierten Embryonen, welche einem Hitzestress ausgesetzt waren, ist die embryonale Entwicklung reduziert (EDWARDS u. HANSEN. 1997). Dabei ist die Auswirkung eines solchen Hitzestresses im 2-Zell-Stadium ausgeprägter als im Stadium der Morula (EALY et al. 1995). Allerdings konnte bei Embryonen, welche in einem frühen Stadium einem moderaten Hitzestresses ausgesetzt waren, in späteren Stadien eine größere Thermotoleranz induziert werden (EDWARDS et al. 1995).

In Mäuseembryonen wurde das HSPA1A-Transkript ab dem 2-Zellstadium nachgewiesen. Die Expression beginnt hier mit der Aktivierung des embryonalen Genoms (CHRISTIANS et al. 1995). In bovinen Oozyten und Embryonen konnte HSPA1A in allen Stadien bis zur geschlüpften Blastozyste nachgewiesen werden. Es kann hier als ein Indikator für den Nachweis suboptimaler Kulturbedingungen dienen (WRENZYCKI et al. 1998). So wurden beispielsweise beim Zusatz von Serum zu den Kulturmedien signifikant mehr HSPA1A-Transkripte nachgewiesen als bei einer Kultur mit PVA-Supplementation (WRENZYCKI et al. 1999). Ebenso wurde bei Morulae und Blastozysten aus einer TCM-Kultur mehr HSPA1A nachgewiesen als bei denen aus einer SOF-Kultur oder bei in vivo generierten Embryonen. Auch der Zusatz von FBS zum Maturationsmedium bewirkt einen Anstieg in der HSPA1A-Expression im Vergleich zu Maturationsmedien mit BSA oder PVP (WARZYCH et al. 2007). Der Vergleich in vitro produzierter Embryonen mit in vivo generierten ergab, dass sowohl bei der Maus als auch beim Rind die HSPA1A-Expression bei IVP-Embryonen deutlich höher war (CHRISTIANS et al.

1995, WRENZYCKI et al. 2001, SMITH et al. 2009). Auch die Kryokonservierung von Embryonen scheint Auswirkungen auf die HSPA1A-Expression zu haben. So zeigten

konventionell kryokonservierte, genauso wie vitrifizierte Embryonen, im Vergleich zu nicht kryokonservierten IVP-Embryonen eine Reduzierung der relativen Transkriptmenge (STINSHOFF et al. 2011). PARK et al. stellten im Gegensatz dazu eine Erhöhung der Transkriptmenge vitrifizierter Embryonen nach dem Auftauen fest und auch KUZMANY et al. konnten eine Steigerung der HSPA1A-Expression nach der Vitrifikation im Vergleich zu nicht vitrifizierten Embryonen ermitteln (PARK et al.

2006, KUZMANY et al. 2011). SIQUEIRA FILHO et al. konnten dagegen 2011 keine Veränderungen in der HSPA1A-Expression bei vitrifizierten im Gegensatz zu nicht kryokonservierten bovinen Blastozysten ermitteln.

2.7.5. Desmocollin 2 (DSC2)

Desmosome gehören zu den kalziumabhängigen Membranproteinen aus der Superfamilie der Cadherine und bilden einen Teil der Zell-Zell-Verbindungsapparate, welche in so gut wie allen Epithelzellen vorkommen (FLEMING et al. 1991, COLLINS et al. 1995). Desmosome bestehen aus transmembranären Glykoproteinen, wie dem Desmoglein oder dem Desmocollin, welche im Interzellularraum eine Verbindung zur Nachbarzelle aufbauen, und einem zytoplasmatischen Plaque-Protein, wie Plakoglobin oder Desmoplakin, welche die Aufgabe haben, die Verankerung der Zytofilamente in der Plasmamembran zu bilden (SCHWARZ et al. 1990). Beim Rind kommen drei Typen des Desmocollins vor, das Desmocollin 1, 2 und 3. Jedes Desmocollin besitzt außerdem zwei Isoformen, welche sich in der Größe der zytoplasmatischen Domäne unterschieden. Die b-Isoform besitzt im Gegensatz zur a-Isoform ein zusätzliches, 46 Basenpaare (bp) langes Exon (COLLINS et al. 1991, LEGAN et al. 1994).

Bei Mäuseembryonen kann DSC2 in der Oozyte und in frühembryonalen Stadien bis zum nicht-kompaktierten 8-Zeller detektiert werden. In der Phase der Kompaktierung im 8-Zell-Stadium wird DSC2 nicht exprimiert. Der Nachweis gelingt erst wieder ab dem 16-Zell-Stadium und steigt in der weiteren Entwicklung zur Blastozyste und geschlüpften Blastozyste an (COLLINS et al. 1995). Lokalisiert ist das DSC2 hauptsächlich in den Zellen des TE. Hier ist es beteiligt an der Blastocoel-Bildung

und der Stabilisierung des TE im Verlauf der Expansion der Blastozysten (FLEMING et al. 1991).

Bei bovinen Embryonen konnten beide Isoformen des DSC2 und des DSC3 ab dem 2-4 Zell-Stadium bis zum Stadium der geschlüpften Blastozyste nachgewiesen werden, DSC1 wurde dagegen nicht exprimiert (WRENZYCKI et al. 1998).

Die Menge des exprimierten Transkripts hängt von verschiedenen Faktoren ab. So konnte beispielsweise in bovinen Blastozysten, welche an Tag 7 expandierten, signifikant weniger DSC2 nachgewiesen werden als in solchen, die erst an Tag 8 expandierten. Des Weiteren wurde im TE boviner Blastozysten signifikant mehr DSC2 nachgewiesen als in der ICM (WRENZYCKI et al. 2003). Auch die Zusammensetzung der Kulturmedien für die IVP hat einen Einfluss auf die Expression von DSC2. So exprimieren Blastozysten aus einer Kultur mit PVA-Zusatz signifikant mehr DSC2 als Blastozysten aus einer Kultur mit Serum. Wird dem Kulturmedium IGF-1 (Insulin-like Growth Faktor 1) zugesetzt, erhöht dies die Expression von DSC2 in bovinen Blastozysten im Vergleich zu solchen, denen kein IGF-1 zugeführt wurde (BLOCK et al. 2008).

Bei dem Vergleich von in vitro produzierten Embryonen mit solchen, die in vivo generiert wurden, konnte ein deutlicher Unterschied in der DSC2-Expression nachgewiesen werden. Embryonen aus einer IVP bildeten weniger DSC2 als die in vivo generierten. Dies kann ein Indikator für eine bessere Qualität der in vivo produzierten Embryonen sein (WRENZYCKI et al. 2001, KNIJN et al. 2002). Auch die Kryokonservierung beeinflusst die Bildung von DSC2, so konnte bei vitrifizierten Embryonen nach dem Auftauen signifikant weniger DSC2 ermittelt werden als bei Embryonen, die nicht kryokonserviert wurden (STINSHOFF et al. 2011).