Die penetrierenden Kryoprotektiva zeichnen sich dadurch aus, dass sie die Zellmembran überwinden und somit im Inneren der Zelle ihre protektive Wirkung entfalten können. MERYMAN postulierte 1971, dass penetrierende Kryoprotektiva dabei zwei entscheidende Eigenschaften haben müssen. Zum einen müssen sie allgemein in der Lage sein, die Zellmembran zu überwinden, zum anderen dürfen sie in den für die Kryokonservierung benötigten Konzentrationen nicht zelltoxisch sein (MERYMAN 1971). Beim Zusatz von penetrierenden Kryoprotektiva schrumpfen die Zellen zunächst durch Dehydratation. Dies liegt nicht nur an der hyperosmolaren extrazellulären Lösung, sondern auch daran, dass die Zellmembran für Wasser permeabler ist als für die Kryoprotektiva (SCHNEIDER u. MAZUR 1984). Ist ein Gleichgewicht zwischen dem Ausströmen von Wasser und dem Einströmen des Kryoprotektivums erreicht, fängt die Zelle wieder an zu reexpandieren. Eine erfolgreiche Äquilibrierung ist erreicht, wenn die Zelle wieder ihre normale Größe erreicht hat (SCHNEIDER u. MAZUR 1984). Welches penetrierende Kryoprotektivum für eine bestimmte Spezies oder ein bestimmtes Einfrierverfahren am besten geeignet ist, hängt von vielen Faktoren ab. So ist beispielsweise die Zeit, die für eine genügende Äquilibrierung benötigt wird abhängig von Faktoren wie der Spezies, dem embryonalen Entwicklungsstadium, seinem Oberflächen-/Volumen-Verhältnis und der Umgebungstemperatur (LEIBO 1989). Wie schnell ein Kryoprotektivum die Zellmembran überwinden kann, hängt von seiner Permeabilitätskonstante und von der Umgebungstemperatur ab und ist daher für jeden Stoff individuell (SCHNEIDER u. MAZUR 1984). In Versuchen mit Mäuseembryonen wurde festgestellt, dass die Permeabilitätskonstante eines Stoffes mit der Temperatur und mit dem fortgeschrittenen Entwicklungsstadium des Embryos ansteigt, von der Konzentration des Kryoprotektivums jedoch unabhängig ist (SCHNEIDER u. MAZUR 1984). Für die
konventionelle Kryokonservierung und die Vitrifikation von Embryonen werden verschiedene penetrierende Kryoprotektiva eingesetzt.
2.4.1.1. Glyzerin
Glyzerin oder auch Propan-1,2,3-triol ist ein dreiwertiger Alkohol, der eine sowohl farb- als auch geruchslose Substanz darstellt (Abb. 3). Es wurde 1949 zum ersten Mal zur Vitrifikation von Geflügelsperma benutzt (POLGE et al. 1949).
Abbildung 3: Strukturformel Glyzerin
Glyzerin wurde bis in die 90er Jahre häufig als alleiniges Kryoprotektivum bei der konventionellen Kryokonservierung von Rinderembryonen eingesetzt. Es zeichnet sich durch eine langsame Penetrationszeit aus, gilt in hohen Konzentrationen jedoch auch als eine geringfügig toxische Substanz (MERYMAN 1971). Die für die konventionelle Kryokonservierung eingesetzte Konzentration liegt in der Regel zwischen 1 M und 2 M. LEHN-JENSEN verglich 1986 verschiedene Konzentrationen an Glyzerin beim Einfrieren boviner Blastozysten und konnte feststellen, dass eine Konzentration von 0,5 M signifikant schlechtere Überlebensraten erbrachte als Konzentrationen von 1 M oder 1,5 M. (LEHN-JENSEN 1986). Dieses wurde durch KENNEDY et al. (1983) bestätigt, welche bovine Blastozysten in 1 M oder 1,4 M Glyzerin-Lösung einfroren und keine signifikanten Unterschiede erkannten.
NIEMANN verglich 1985 den Einsatz des sogenannten „One-step-Verfahrens“ mit nur einem Äquilibrierungsschritt unter Anwendung von 1,4 M Glyzerin mit der damals üblichen, schrittweisen Äquilibrierung bis zu einer Konzentration von 1,0 M bei bovinen Blastozysten. Er zeigte dabei, dass das „One-step-Verfahren“ zu guten Überlebensraten nach dem Auftauen und zu guten Trächtigkeitsraten führte
(NIEMANN 1985). Bei der Vitrifikation werden, im Gegensatz zur konventionellen Kryokonservierung, meist wesentlich höhere Konzentrationen Glyzerin eingesetzt, um die Fähigkeit, einen glasähnlichen Zustand zu bilden, zu erreichen. Dabei gibt es sowohl die Möglichkeit Glyzerin als alleiniges Kryoprotektivum einzusetzen, als auch es mit anderen Kryoprotektiva zu mischen und so die Einzelkonzentrationen zu senken. Der Vergleich zwischen bovinen Blastozysten, die entweder in 6,5 M Glyzerin oder in einem Gemisch aus 25% Glyzerin und 25% Propylenglycol vitrifiziert wurden, ergab, dass die Überlebensraten zwar gleich gut, die Trächtigkeitsraten jedoch bei der Vitrifikation in 6,5 M Glyzerin höher waren (Tab. 2; VAN WAGTENDONK-DE LEEUW et al. 1995). Der Vergleich zwischen einer Vitrifikationsmethode in 6,5 M Glyzerin und konventioneller Kryokonservierung in 1,5 M Glyzerin ergab keine signifikanten Unterschiede (Tab. 2; VAN WAGTENDONK-DE LEEUW et al. 1997). DONNAY et al. verglichen 1998 zwei Vitrifikationsmethoden, in denen Glyzerin und Ethylenglycol zum Einsatz kamen. So waren die Reexpansions- und Schlupfraten von bovinen Blastozysten nach der Vitrifikation in einem Medium aus 25% Glyzerin und 25% Ethylenglycol deutlich besser als bei der Vitrifikation mit 10% Glyzerin und 40% Ethylenglykol (Tab. 2, DONNAY et al. 1998).
Tabelle 2: Vergleich der Einfrierverfahren und Einfriermedien hinsichtlich Überlebens- (ÜR) und Trächtigkeitsraten (TR, EG = Ethylenglycol, n.u. = nicht untersucht)
Autor Methode Medien ÜR (%) TR (%)
Kryokonservierung 1,5 M Glyzerin n.u. 45,1%
DONNAY et al. (1998)
Vitrifikation 25% Glyzerin
25% EG 67% n.u.
Vitrifikation 10% Glyzerin
40% EG 5% n.u.
2.4.1.2. Ethylenglycol
Ethylenglycol (EG; Abb. 4) oder auch Ethan-1,2-diol hat im Vergleich zu den anderen aufgeführten penetrierenden Kryoprotektiva ein sehr geringes Molekulargewicht und kann daher schneller durch die Zellmembran diffundieren. Es gilt auch in hohen Konzentrationen und bei direkter Äquilibrierung im konzentrierten Medium als ein Kryoprotektivum mit geringer Toxizität (MAMOUDZADEH et al. 1993).
Abbildung 4: Strukturformel Ethylenglycol
Seine kryoprotektive Wirkung wurde zuerst durch MIYAMOTO und ISHIBASHI (1977) bei der konventionellen Kryokonservierung von Mäuse- und Rattenembryonen untersucht. Sie benutzten EG als alleiniges Kryoprotektivum in relativ niedrigen Konzentrationen von 1,2 M zur Kryokonservierung von Mäuseembryonen im 8-Zell-Stadium und erreichten damit nach dem Auftauen und der weiteren Kultur Blastozystenraten von 76-85% (MIYAMOTO u. ISHIBASHI 1977). Beim Rind wurden Konzentrationen von 1,5 M EG ebenfalls als sehr effektiv getestet. VOELKEL und HU verglichen 1992 die Wirkung von 1,5 M EG, Dimethylsulfoxid (DMSO), Glyzerin und Propylenglycol (PG) bei der konventionellen Kryokonservierung boviner Embryonen. Hier zeigt sich deutlich, dass durch EG die besten Überlebensraten erzielt werden konnten (Tab 3;VOELKEL u. HU 1992).
Tabelle 3: Entwicklungsraten boviner Embryonen nach konventionellem Kryokonservieren mit verschiedenen Kryoprotektiva (VOELKEL u. HU 1992)
Kryoprotektivum Konzentration Entwicklungsraten
Ethylenglykol 1,5 M 70%
Glyzerin 1,5 M 30%
Propylenglykol 1,5 M 11%
Dimethylsulfoxid 1,5 M 25%
KASAI et al. zeigten 1990 durch Toxizitätstest mit verschiedenen Kryoprotektiva, dass EG auch in hohen Konzentrationen als alleiniges Kryoprotektivum eingesetzt werden kann. Dabei wurden beim Einsatz von 30% und 40% EG gute Blastozystenraten ermittelt. Wie in Tabelle 4 ersichtlich, konnten auch beim Einsatz von 30% Glyzerin gute Raten erzielt werden, die Raten bei der Verwendung von PG waren im Vergleich dazu schlecht (Tab. 4; KASAI et al. 1990).
Tabelle 4: Blastozystenraten nach Vitrifikation von Mäusemorulae in Medien mit verschiedenen Konzentrationen an Kryoprotektiva (n.u. = nicht untersucht)
Konzentration 30% 40% 50%
Kryoprotektivum Blastozystenrate (%)
Ethylenglykol 98% 84% 0%
Glyzerin 88% 3% n.u.
Propylenglykol 16% 0% n.u.
Auch SOMMERFELD und NIEMANN konnten 1999 zeigen, dass Ethylenglycol erfolgreich in hohen Konzentrationen zur konventionellen Kryokonservierung und zur Vitrifikation von in vitro produzierten Rinderembryonen eingesetzt werden kann. So zeigten sich bei der konventionellen Kryokonservierung die besten Schlupfraten bei 3,6 M EG (81%), bei der Vitrifikation konnten mit einer schrittweisen Äquilibrierung in
3,6 M EG und 7,2 M EG Schlupfraten von 42% erreicht werden (SOMMERFELD u.
NIEMANN 1999). In vorherigen Toxizitätstest wurden sogar Schlupfraten von 93%
bei bovinen Blastozysten erreicht. Bei diesen Toxizitätstests wurden die Blastozysten zwar nur dem Medium ausgesetzt und nicht vitrifiziert, es konnte allerdings deutlich gezeigt werden, dass EG auch in hohen Konzentrationen nur gering zelltoxisch wirkt (SOMMERFELD 1997). Gute Überlebensraten konnten nicht nur durch den alleinigen Einsatz von EG bei der Vitrifikation, sondern auch in Verbindung mit anderen, nicht-penetrierenden Kryoprotektiva erreicht werden. Dies wurde zuerst durch KASAI et al. 1990 gezeigt, welche bei der Vitrifikation von Mäusemorulae durch 40% EG in Verbindung mit Ficoll und Saccharose Entwicklungsraten zur Blastozyste von 97-98% dokumentierten (KASAI et al. 1990). TACHIKAWA et al.
benutzten 1993 die Kombination verschiedener penetrierender Kryoprotektiva mit Ficoll und Saccharose auch zur Vitrifikation boviner Blastozysten. Dabei zeigten sich ähnliche Ergebnisse wie bei den Mäuseembryonen, wobei EG und Glyzerin in dieser Kombination am besten geeignet waren und die Entwicklungsraten bei PG am schlechtesten ausfielen (TACHIKAWA et al. 1993; Tab. 8). Die Kombination aus EG, Ficoll und Saccharose (EFS) schien demnach auch für die Vitrifikation boviner Blastozysten sehr gut geeignet zu sein, was durch mehrere Autoren bestätigt werden konnte. MAMOUDZADEH et al. zeigten 1995, dass die Entwicklungraten durch eine schrittweise Äquilibrierung noch gesteigert werden konnten. Sie benutzten für den ersten Äquilibrierungsschritt 20% EFS, für den zweiten Schritt 40% EFS und erreichten damit bei der Vitrifikation von expandierten Blastozysten Schlupfraten von 89% nach dem Auftauen (MAMOUDZADEH et al. 1995). MARTINEZ et al. verglichen 1998 den Einsatz einer zweischrittigen EFS-Methode (2EFS) mit einer dreischrittigen (3EFS) und einer Kombination aus EG und Glyzerin. Dabei ergaben sich bei der dreischrittigen Methode bessere Schlupfraten als bei der zweischrittigen (Tab. 5), allerdings waren die Entwicklungsraten bei der Kombination von EG mit Glyzerin ebenfalls gut und es wurden sogar höhere Trächtigkeitsraten als bei der EFS-Methode erzielt.
Tabelle 5: Schlupf- und Trächtigkeitsraten boviner in vitro produzierter Embryonen bei verschiedenen Einfriermethoden (MARTINEZ et al. 1998)
Kryoprotektiva Schlupfraten Trächtigkeitsraten 2EFS 35,7% Nicht getestet
3EFS 57,7% 35,2%
EG + Glyzerin 59,6% 43,7%
Neben dem Einsatz von EG in Verbindung mit Ficoll und Saccharose gab es noch andere Versuche, EG mit verschiedenen nicht-penetrierenden Kryoprotektiva zu kombinieren. SAHA et al. (1996) benutzten beispielsweise erfolgreich eine Kombination aus EG mit Trehalose und PVP und erreichten damit bessere Schlupfraten als bei alleinigem Einsatz von EG oder einer Kombination aus EG mit Trehalose (Tabelle 6).
Tabelle 6: Schlupfraten in vitro produzierter boviner Embryonen bei der Verwendung verschiedener Kryoprotektiva (SAHA et al. 1996, EG = Ethylenglycol, PVP = Polyvinylpyrrolidon)
Kryoprotektiva Schlupfraten
40% EG 19,6%
40% EG + 11,3% Trehalose 42,5%
40% EG + 11,3% Trehalose + 20% PVP 68,2%
Eine Vitrifikation mit EG scheint demnach in der Kombination mit anderen penetrierenden und nicht-penetrierenden Kryoprotektiva am effektivsten zu sein.
2.4.1.3. Dimethylsulfoxid
Dimethylsulfoxid (Abb. 5) ist eine farblose Substanz mit analgetischen und antiphlogistischen Eigenschaften, die sehr schnell durch die Haut und durch
Zellmembranen diffundieren kann und wird daher in der Medizin häufig allein oder als Trägersubstanz bei dermalen Applikationen genutzt.
Abbildung 5: Strukturformel Dimethylsulfoxid
Als Kryoprotektivum wurde DMSO zum ersten Mal bei humanen und bovinen Erythrozyten sowie bei Bullensperma eingesetzt (LOVELOCK u. BISHOP 1959).
Dabei ergab sich im Vergleich zu Glyzerin eine wesentlich schnellere Permeabilitätszeit. Das Medium mit DMSO konnte seine kryoprotektive Wirkung auf bovine Erythrozyten bereits nach 30 Sekunden entfalten, wogegen Glyzerin in diesen Versuchen keine ausreichend kryoprotektive Wirkung zeigte (LOVELOCK u. BISHOP 1959). Eine schnelle und vollständige Penetration ist laut MERYMAN entscheidend für die erfolgreiche Schutzwirkung von DMSO bei der Kryokonservierung (MERYMAN 1971, MERYMAN et al. 1977). Trotz seiner exzellenten kryoprotektiven Eigenschaften zeigt sich, dass DMSO, wenn es in hohen Konzentrationen und bei einer langen Äquilibrierungszeit eingesetzt wird, zytotoxisch wirken kann. MALININ konnte verschiedene Zellschäden an Nierenzellen, welche für zehn Minuten einer 7,5%igen DMSO-Lösung ausgesetzt waren, nachweisen (MALININ 1973). Bei Mäuseoozyten verursachte die Äquilibrierung in DMSO Veränderungen in der Mikrofilamentstruktur und gesteigerte Chromosomendegenerationen (VINCENT et al.
1990, BOUQUET et al. 1995). Trotz der toxischen Eigenschaften wird DMSO häufig in Verbindung mit anderen Kryoprotektiva zur Kryokonservierung von Embryonen verwendet.
Zur konventionellen Kryokonservierung von bovinen Embryonen wurde DMSO bereits 1978 eingesetzt. WILLADSEN et al. verwendeten in ihren Versuchen eine schrittweise Äquilibrierung in 0,5 M, 1 M und 1,5 M DMSO-Lösung und erreichten
damit Trächtigkeitsraten von bis zu 67% (WILLADSEN et al. 1978). Die Konzentration von 1,5 M DMSO lieferte für die konventionelle Kryokonservierung sehr gute Ergebnisse. Auch TROUNSON et al. benutzten eine solche Konzentration zur Konservierung boviner Blastozysten und erreichten Entwicklungsraten von 50-56% und Trächtigkeitsraten von 39-45% (TROUNSON et al. 1978). BILTON verglich den Einsatz einer 1,5 M DMSO-Lösung mit einer 1 M Glyzerin-Lösung zur konventionellen Kryokonservierung boviner Blastozysten und konnte dabei keine signifikanten Unterschiede in den Entwicklungs- und Trächtigkeitsraten erkennen (BILTON 1980).
Zur Vitrifikation von Embryonen ist DMSO aufgrund seiner ausgeprägten Fähigkeit zur Bildung eines glasähnlichen Zustandes sehr gut geeignet (FRIEDLER et al.
1988, VALDEZ et al. 1992). Meist kommt es dabei in Verbindung mit anderen Kryoprotektiva zum Einsatz. Seine guten kryoprotektiven Eigenschaften wurden schon bei der ersten erfolgreichen Vitrifikation von Mäuseembryonen in Verbindung mit EG und Glycerin genutzt (RALL u. FAHY 1985). ISHIMORI et al. verwendeten 1993 ebenfalls eine Kombination aus DMSO und EG, dabei wurde eine zweistufige Äquilibrierung, zunächst in 12,5% DMSO mit 12,5% EG und danach in 25% DMSO mit 25% EG, benutzt. Da beide Kryoprotektiva eine sehr schnelle Penetrationszeit aufweisen, benötigen sie relativ kurze Äquilibrierungszeiten, um ihre protektive Wirkung zu entfalten. ISHIMORI et al. (1993) verglichen in diesem Zusammenhang Zeitspannen im ersten Medium von ein, zwei und fünf Minuten und konnten nachweisen, dass die Entwicklungsraten bei kurzen Äquilibrierungszeiten signifikant höher ausfielen (Tab. 7).
Tabelle 7: Ergebnisse der Entwicklungsraten boviner Blastozysten bei verschiedenen
Äquilibrierungszeiten im 1. Medium (12,5% DMSO + 12,5% EG) und 30 s im 2. Medium (25% DMSO + 25% EG; ISHIMORI et al. 1993)
Zeit im 1. Medium Zeit im 2. Medium Entwicklungsraten
Versuch 1 1 min 30 s 85%
Versuch 2 2 min 30 s 73%
Versuch 3 5 min 30 s 20%
VIEIRA et al. verwendeten 2007 ebenfalls die Kombination aus DMSO und EG und verglichen dieses Vitrifikationsmedium mit einem Medium aus EG, Saccharose und PVA. Bei beiden Verfahren konnten vergleichbar gute Reexpansionsraten nach dem Auftauen von 94,8% für die Methode mit DMSO und 84,5% für die Methode ohne DMSO erreicht werden, die Schlupfraten waren bei der Methode mit DMSO jedoch signifikant besser (75,8% im Vergleich zu 55,2%). Die Trächtigkeitsraten unterschieden sich in diesen Versuchen nicht (VIEIRA et al. 2007).
Trotz solch guter Ergebnisse wird der Einsatz von DMSO als Kryoprotektivum zur Vitrifikation immer wieder kontrovers diskutiert. Aufgrund der toxischen Wirkung kommt DMSO bei der Vitrifikation fast ausschließlich als Gemisch mit anderen Kryoprotektiva zum Einsatz. Außerdem wurden für die Vitrifikation DMSO-freie Medien entwickelt, um auf den Einsatz von DMSO als Kryoprotektivum verzichten zu können. STACHECKI et al. entwickelten eine einfache Vitrifikationsmethode unter Verwendung von Glyzerin und EG und erreichten Überlebensraten von 96,1% bei bovinen expandierten und bovinen geschlüpften Blastozysten. Einen direkten Vergleich mit einem DMSO-haltigen Medium gab es allerdings nicht (STACHECKI et al. 2008). Vergleiche zwischen Vitrifikationsmedien mit und ohne DMSO, wie sie beispielsweise durch VIEIRA et al. bei bovinen Blastozysten durchgeführt wurden, sind auch im Bereich der humanen Reproduktionsmedizin zu finden. So verglichen ISACHENKO et al. (2005) Maturationsraten humaner Oozyten, welche zuvor durch DMSO in Kombination mit EG oder nur durch EG vitrifiziert wurden und erreichten bei der Vitrifikation mit DMSO signifikant höhere Reifungsraten. KARTBERG et al.
benutzten 2008 ein Vitrifikationsmedium mit DMSO, PG und EG im Vergleich zur Vitrifikation in PG und EG bei humanen Embryonen sowie Mäuseembryonen und konnten keine Unterschiede in den Entwicklungsraten feststellen (KARTBERG et al.
2008).
2.4.1.4. Propylenglycol
Propylenglycol (PG, Abb. 6) oder auch 1,2-Propandiol ist wie EG ein zweiwertiger Alkohol, der, wie alle penetrierenden Kryoprotektiva, stark hygroskopische Eigenschaften aufweist.
Abbildung 6: Strukturformel Propylenglycol
Die Toxizität von PG gilt im Vergleich zu EG als gering, die Fähigkeit, einen glasähnlichen Zustand zu bilden, ist bei PG allerdings noch höher als bei DMSO oder Glyzerin (RENARD u. BABINET 1984). BOUTRON u. KAUFMANN untersuchten 1979 die Stabilität wässriger Lösungen verschiedener Kryoprotektiva, wenn sie bei niedrigen Temperaturen in eine komplett amorphe Phase übergehen. Dabei zeigte sich, dass die PG-Lösung im Gegensatz zu DMSO- und EG-Lösungen eine wesentlich größere Stabilität aufwies. Es wurde vermutet, dass ein Zusammenhang zwischen der Stabilität und den kryoprotektiven Eigenschaften der Substanzen besteht, so dass PG demnach eine gute Schutzwirkung aufweisen müsste. Die Versuche wurden allerdings mit rein wässrigen Lösungen durchgeführt, welche nicht, wie zum Beispiel die heutzutage benutzten Vitrifikationslösungen, Proteinzusätze wie BSA oder FCS aufwiesen (BOUTRON u. KAUFMANN 1979).
Zur konventionellen Kryokonservierung von Mäuseembryonen scheint PG als alleiniges Kryoprotektivum gut geeignet zu sein. So erreichten RENARD u. BABINET (1984) bei einer Verwendung von 1,5 M PG Blastozystenraten von 88,1. Auch beim Rind konnten gute Ergebnisse bei der konventionellen Kryokonservierung von Blastozysten erzielt werden. Bei der Verwendung von 1,6 M PG-Lösung wurden Überlebensraten von 72-89% und Trächtigkeitsraten von bis zu 61% erreicht
(SUZUKI et al. 1990). Andere Autoren hingegen erzielten weit schlechtere Ergebnisse bei bovinen Embryonen. VOELKEL u. HU verglichen 1992 1,5 M Lösungen verschiedener Kryoprotektiva bei der konventionellen Kryokonservierung von bovinen Blastozysten und erreichten bei der Verwendung von PG Entwicklungsraten von nur 11% (Tab. 3; VOELKEL u. HU 1992). DOCHI et al.
ermittelten 1998 Trächtigkeitsraten nach dem Direkttransfer konventionell kryokonservierter, in vivo generierter boviner Morulae und Blastozysten. Sie verglichen zwei verschiedene Einfriermethoden unter Verwendung von 1,6 M PG oder 1,8 M EG und zeigten ebenfalls, dass die Trächtigkeitsraten unter Nutzung von PG niedriger waren. Sie lagen bei 36% im Vergleich zu 44,7% bei der Verwendung von EG (DOCHI et al. 1998).
Trotz der guten glasbildenden Eigenschaften und der Tatsache, dass die Stabilität von PG-Lösungen im amorphen Zustand sehr gut ist (BOUTRON u. KAUFMANN 1979), wurden bei der Verwendung von PG in Vitrifikationslösungen sowohl für die Maus als auch für das Rind eher schlechte Überlebensraten ermittelt. KASAI verglich 1990 den Einsatz 30-50%iger Lösungen verschiedener penetrierender Kryoprotektiva bei der Vitrifikation von Maus-Morulae. Wie in Tab. 4 ersichtlich, konnten bei der Verwendung von 30%iger PG-Lösung Blastozystenraten von nur 16% erreicht werden. Beim Einsatz einer 40%igen PG-Lösung wurden keine überlebenden Blastozysten mehr ermittelt, was dazu führte, dass die Verwendung einer 50%igen PG-Lösung nicht mehr untersucht wurde (KASAI et al 1990). Bei bovinen Blastozysten ermittelten TACHIKAWA et al. ebenfalls wesentlich schlechtere Entwicklungsraten bei der Verwendung von PG im Vergleich zu EG und Glyzerin. Sie benutzten ein Gemisch aus 40 % des jeweiligen penetrierenden Kryoprotektivums in Kombination mit 30% Ficoll und 0,5 M Saccharose und bewerteten die Reexpansions- und Schlupfraten nach dem Auftauen. Des Weiteren wurden in diesem Versuch Äquilibrierungszeiten von zwei, fünf und zehn Minuten verglichen, die Ergebnisse sind in Tab. 8 dargestellt (TACHKAWA et al. 1993).
Tabelle 8: Reexpansions- (ReexR) und Schlupfraten (SR) boviner Blastozysten nach Vitrifikation durch verschiedene penetrierende Kryoprotektiva (EG, Glyzerin und PG) in Kombination mit Ficoll und
Saccharose (TACHIKAWA et al. 1993)
Äquilibrierungszeiten 2 min. 5 min. 10 min.
Kryoprotektiva ReexR SR ReexR SR ReexR SR EG + Ficoll + Saccharose 90% 73% 14% 4% 0% 0%
Glyzerin + Ficoll + Saccharose 94% 81% 68% 52% 37% 17%
PG + Ficoll + Saccharose 31% 24% 0% 0% 0% 0%
Es zeigt sich, dass, auch in Kombination mit nicht-penetrierenden Kryoprotektiva, PG als Schutzmittel für die Vitrifikation boviner Blastozysten eher ungeeignet zu sein scheint.