Nicht-penetrierende Kryoprotektiva zeichnen sich dadurch aus, dass sie ihre protektive Wirkung im Extrazellularraum entfalten, da sie aufgrund ihrer Molekulargröße die Zellmembran nicht frei überwinden können. Für die Kryokonservierung lebender Zellen werden unter anderem Zucker und verschiedene Makromoleküle wie PVP, PVA oder Ficoll verwendet. Sie können ihre Schutzwirkung schon in geringen Konzentrationen erreichen und gelten damit als weniger toxisch als penetrierende Kryoprotektiva (NIEMANN 1991). Ihre Wirkung beruht auf einer Erhöhung der extrazellulären Osmolarität, wodurch die Zellen eine geringere Zeitspanne benötigen, um den für den Einfriervorgang erforderlichen Dehydrierungsgrad zu erreichen. Dies hat den positiven Effekt, dass die Zellen den toxischen Medien weniger lange ausgesetzt sein müssen (LIEBERMANN u.
TUCKER 2002). Nicht-penetrierende Kryoprotektiva werden daher in der Regel bei hohen Einfrierraten eingesetzt, um eine schnelle Dehydrierung zu erreichen (MERYMAN 1971). Des Weiteren kommen sie in der Auftauphase zum Einsatz. Hier verhindern sie ein zu schnelles Anschwellen durch die Diffusion von Wasser in die
Zelle und ermöglichen eine gute Ausschleusung der penetrierenden Kryoprotektiva aus den Zellen (NIEMANN 1991).
2.4.2.1. Zucker
Bei den für die Kryokonservierung verwendeten Zucker handelt es sich hauptsächlich um Disaccharide wie Saccharose und Trehalose (Abb. 7), welche mit einem Molekulargewicht von >340 g/mol Zellmembranen nicht überwinden können. Sie werden am häufigsten in Auftaumedien verwendet.
Abbildung 7: Strukturformeln von Saccharose (links) und Trehalose (rechts)
Werden Zellen aufgetaut, enthalten sie meist sehr hohe Konzentrationen penetrierender Kryoprotektiva, welche schnell aus der Zelle entfernt werden müssen, da sie durch die steigenden Temperaturen an Toxizität gewinnen (NIEMANN 1991).
Bei der Verwendung einer isotonen PBS-Lösung kommt es durch die Hyperosmolarität des Intrazellularraumes zu einem schnellen Einstrom von Wasser, da Wasser einfacher in die Zelle penetrieren kann als die Kryoprotektiva heraus kommen. Um ein extremes Anschwellen der Zellen zu verhindern, werden dem Auftaumedium Zucker hinzugefügt, welche als osmotischer Puffer dienen und dadurch die Überlebensraten der Zellen steigern können (NIEMANN 1991, MCWILLIAMS et al. 1995). Bei der konventionellen Kryokonservierung werden solche Auftaumedien häufig direkt beim Einfrieren in den Straw mit aufgezogen.
Dadurch können die Medien beim Auftauen schon im Straw vermischt und die
Kryoprotektiva schneller ausverdünnt werden. Dies wird als „in-straw-dilution“ bezeichnet. Sie ermöglicht ein sogenanntes „One-step-Verfahren“, durch das die Embryonen direkt auf Emfängertiere übertragen werden können, und macht eine Ausverdünnung des Mediums unter dem Mikroskop im Labor unnötig. Der Einsatz von Zuckern bei der konventionellen Kryokonservierung beschränkt sich jedoch nicht nur auf die Auftaumedien. SUZUKI et al. zeigten 1990, dass der Zusatz von Saccharose zu einem Einfriermedium mit Glyzerin in Konzentrationen von 0,4 M und 0,8 M im Vergleich zu einer Konzentration von 0,2 M oder einem Medium ohne Saccharosezusatz die Überlebensraten boviner Blastozysten steigern konnte. In Verbindung mit PG trat diese Wirkung nicht auf, hier waren die Überlebensraten ohne Saccharosezusatz genauso hoch wie mit Saccharosezusatz. Ein Überblick über die Überlebensraten ist in Tab. 9 aufgeführt (SUZUKI et al. 1990).
Tabelle 9: Überlebensraten in vitro produzierter boviner Embryonen nach konventioneller Kryokonservierung in Glyzerin oder Propylenglycol mit Saccharosezusätzen verschiedener
Konzentrationen (SUZUKI et al. 1990, M = Molar)
Saccharosezusatz (M) Kryoprotektiva 0 M 0,2 M 0,4 M 0,8 M
Glyzerin 0% 21% 82% 88%
Propylenglycol 88% 89% 84% 72%
LIM et al. zeigten 2008 ebenfalls, dass der Zusatz von 0,1 M Saccharose zu einem Einfriermedium mit 1,5 M EG im Vergleich zu 0,1 M Xylose oder dem Einfrieren ohne Zucker zu besseren Entwicklungsraten nach konventioneller Kryokonservierung führt. (LIM et al. 2008).
Bei der Vitrifikation werden Zucker ebenfalls sowohl dem Einfrier- als auch dem Auftaumedium zugesetzt, wobei die Ergebnisse sehr unterschiedlich ausfallen. So zeigten DOBRINSKY et al. (1992) nach Versuchen mit drei unterschiedlichen Saccharosekonzentrationen im Auftaumedium (1 M, 0,3 M und 0,1 M) eine Verbesserung der Überlebensraten boviner Embryonen bei einer Konzentration von
0,3 M Saccharose. MAHMOUDZADEH et al. (1995) jedoch konnten keine Veränderungen bei den Reexpansions- und Schlupfraten durch den Einsatz von 0,25 M oder 0,5 M Saccharose im Auftaumedium erkennen. Auch VAJTA et al.
(1999) ermittelten beim Zusatz von Saccharose sowohl zum Auftau- als auch zum Vitrifikationsmedium keine Unterschiede in den Überlebensraten boviner Blastozysten nach der Vitrifikation. Dagegen konnten verschiedene andere Autoren zeigen, dass ein Zuckerzusatz zum Vitrifikationsmedium einen positiven Effekt auf die Überlebensraten zu haben scheint. So wurden beispielsweise Vitrifikationsmedien, die Glyzerin und Ethylenglycol und einen Zusatz von 0,75 M Saccharose oder 0,375 M Saccharose und 0,375 M Dextrose enthielten, verglichen.
Dabei führte der Zusatz der Kombination aus Saccharose und Dextrose zu signifikant höheren Überlebensraten (SAITO et al. 1994). SAHA et al. (1996) konnten zeigen, dass der Einsatz von 11,3% Trehalose in Kombination mit 20% PVP zum Vitrifikationsmedium ebenfalls zu signifikant höheren Reexpansions- und Schlupfraten führte als die Vitrifikation ohne Zusatz nicht-penetrierender Kryoprotektiva.
2.4.2.2. Makromoleküle
Makromoleküle, wie beispielsweise PVP, PVA (Abb. 8) oder Ficoll, haben ebenso wie Zucker den Effekt, die Osmolarität im Extrazellularraum zu erhöhen. Sie werden am häufigsten in Verbindung mit penetrierenden Kryoprotektiva eingesetzt, um deren Konzentration im Einfriermedium senken zu können.
Abbildung 8: Strukturformeln von Polyvinylpyrrolidon (PVP, links) und Polyvinylalkohol (PVA, rechts)
Schon MERYMAN berichtete 1971 über einen positiven Effekt des Zusatzes von PVP zu Einfriermedien. Durch den Einsatz des Makromoleküls konnte die Toleranz gegenüber höheren Kühlraten gesteigert und somit die Überlebensrate von Erythrozyten nach dem Auftauen verbessert werden. Dabei reichten schon kleinste Mengen von 3 mM PVA aus (MERYMAN 1971).
Ein wichtiger Grund, warum Makromoleküle bei der Kryokonservierung von Embryonen den Einfriermedien zugesetzt werden, ist das Problem einer möglichen Infektionsgefahr bei dem Einsatz von Seren wie FCS oder semidefinierten Zusätzen wie BSA. Es wurde versucht, diese Proteine durch PVA, Ficoll oder PVP zu ersetzten und somit beispielsweise eine virale Kontamination zu vermeiden (GUTIERREZ et al.
1993) Des Weiteren gab es das Bestreben, die verwendeten Medien zu standardisieren, um Versuche verschiedener Laboratorien vergleichbarer zu machen (SOMMERFELD u. NIEMANN 1999). Der Zusatz von PVP oder PVA wurde allerdings schon früh wegen deren starker zytotoxischer Wirkung kritisiert (WILMUT u. ROWSON 1973). So konnte nachgewiesen werden, dass bei der Vitrifikation mit Medien, denen PVA oder PVP als Ersatz für die Serumkomponente beigefügt wurde, schlechtere Trächtigkeitsraten erreicht wurden. Des Weiteren wurde von einer schlechteren Handhabung der so vitrifizierten Embryonen berichtet (SEIDEL et al.
1990). SOMMERFELD und NIEMANN (1999) ermittelten zusätzlich reduzierte Schlupfraten nach konventioneller Kryokonservierung boviner Blastozysten mit PVA statt bovinem Kälberserum (bovine calf serum, BCS) im Einfriermedium.
Der Zusatz von Ficoll zu Vitrifikationslösungen scheint im Gegensatz zu PVA und PVP besser geeignet zu sein, so kann Ficoll zum Beispiel die Rekristallisation eines Vitrifikationsmediums beim Auftauen erfolgreich verhindern (KASAI et al. 1990, PALASZ et al. 1997). KASAI et al. (1990) entwickelten eine sehr effektive Vitrifikationslösung durch den Einsatz von EG, Ficoll und Saccharose (EFS), dabei konnten gute Entwicklungsraten bei Mäuseembryonen und später auch bei der Vitrifikation von Rinderembryonen ermittelt werden(PALASZ et al. 1997). Auch MARTINEZ et al. erreichten 1998 durch den Zusatz von Ficoll zum Vitrifikationsmedien mit EG eine Verbesserung der Schlupfraten boviner Blastozysten (MARTINEZ et al. 1998).