Genexpression nach dem Auftauen

Durch die Analyse entwicklungsrelevanter Gentranskripte bleibt die Beurteilung der Qualität boviner Embryonen nicht auf die morphologischen Kriterien beschränkt sondern kann auch auf molekularer Ebene erfolgen. Als „goldener Standard“ dienen hier die Expressionshäufigkeiten in vivo gewonnener Embryonen, welche sich nachweislich von denen in vitro produzierter unterscheiden (WRENZYCKI et al.

2007). Doch nicht nur die Herkunft der Embryonen hat Auswirkungen auf die exprimierte Menge entwicklungsrelevanter Gentranskripte. Auch andere Parameter,

wie beispielsweise das verwendete Kultursystem (WRENZYCKI et al. 1998), das Alter der untersuchten Embryonen (WRENZYCKI et al. 1999) oder die Art der Kryokonservierung (ANCHAMPARUTHY et al. 2010, KUZMANY et al. 2011, SIQUEIRA FILHO et al. 2011, STINSHOFF et al. 2011, AKSU et al. 2012), haben Einfluss auf die molekulare Qualität in vitro produzierter, boviner Embryonen.

In der vorliegenden Arbeit wurde die Expression sechs entwicklungsrelevanter Gentranskripte untersucht. Dabei waren bei vier der sechs untersuchten Gentranskripte signifikante Unterschiede in den Expressionsmengen kryokonservierter und nicht kryokonservierter Embryonen zu erkennen.

Der Glukosetransporter Typ 1 ist verantwortlich für die Regulierung der intrazellulären Glukosekonzentration und den Transport von Glukose über epitheliale und endotheliale Membranen (MUECKLER 1994). Die SLC2A1-Expression kann bei bovinen Embryonen ab dem 2-Zell Stadium in allen frühembryonalen Stadien nachgewiesen werden (LEQUARRÉ et al. 1997). Dabei erreicht die Menge des exprimierten Gens im Stadium der Kompaktierung, in dem der embryonale Metabolismus von Laktat und Pyruvat auf Glukose umgestellt wird, ihren Höchstwert (RIEGLER et al. 1992). In diesem Entwicklungsstadium konnte bei in vitro produzierten bovinen Embryonen signifikant weniger SLC2A1 als bei in vivo generierten nachgewiesen werden (WRENZYCKI et al. 2001, KNIJN et al 2002).

Ebenso konnte bei Embryonen von morphologisch schlechter Qualität geringere Mengen SLC2A1 nachgewiesen werden (LOPES et al. 2007). Dies legt den Schluss nahe, dass in vitro produzierte Embryonen geringere Mengen Glukose aufnehmen können als in vivo gewonnene. Auch nach der Kryokonservierung boviner IVP-Embryonen durch konventionelle Kryokonservierung oder Vitrifikation konnte signifikant weniger SLC2A1 nach dem Auftauen nachgewiesen werden als bei nicht kryokonservierten Embryonen (STINSHOFF et al. 2011). Diese Beobachtung konnte auch in der vorliegenden Arbeit gemacht werden. So wurde bei den Embryonen der DMSO-haltigen Vitrifikationsmethode 1 eine signifikante Reduzierung der SLC2A1-Expression im Vergleich zur Kontrollgruppe und zur KV1-Gruppe ermittelt.

Die Reduzierung der SLC2A1-Expression nach der Kryokonservierung kann zu einer verminderten Glukoseaufnamefähigkeit der Embryonen, welche mit DMSO-haltigen

Medien vitrifiziert wurden, führen. Dies könnte ein Grund für eine verminderte Überlebensfähigkeit und somit eine reduzierte Qualität der auf diese Weise kryokonservierten Embryonen sein. Inwiefern sich diese Qualitätsminderung auch bei der Übertragung der Embryonen auf die Trächtigkeitsraten und die Gesundheit der Kälber auswirkt, müsste in weiteren Untersuchungen geklärt werden.

Auch bei der Ermittlung der TJP1-Expression konnte in der vorliegenden Arbeit eine signifikante Reduzierung der Expressionsmenge bei Embryonen der V1- und der KV2-Gruppe im Vergleich zu solchen der Kontrollgruppe festgestellt werden. Des Weiteren wurde eine tendenzielle Reduzierung der TJP1-Expression bei der V2-Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe ermittelt. Das TJP1 ist das erste entdeckte Protein des Multiproteinkomplexes der Tight junctions (STEVENSON et al.

1986). Als Zellverbindungsmoleküle dienen sie unter anderem der Kommunikation zwischen verschiedenen Zellen. Die entscheidende Expression beginnt bei Embryonen im Kompaktierungsstadium, in dem die Differenzierung zwischen TE und ICM beginnt. Hier dient das TJP1 vor allem dem Aufbau von Verbindungen zwischen den zuvor deutlich voneinander getrennt liegenden Zellen und deren Differenzierung in TE und ICM. Bei bovinen Embryonen mit kurzer Kompaktierungsphase konnte signifikant weniger TJP1 ermittelt werden als bei solchen, die eine längere Kompaktierungsphase durchliefen (MILLER et al. 2003). Außerdem konnte bei dem Vergleich zwischen in vivo und in vitro produzierten Embryonen eine signifikant niedrigere Expression bei den IVP-Embryonen gemessen werden (MILLER et al.

2003). Eine verringerte Expression von TJP1 konnte auch bei dem Vergleich zwischen kryokonservierten und nicht-kryokonservierten Embryonen festgestellt werden, so exprimierten vitrifizierte und konventionell kryokonservierte Embryonen signifikant geringere Mengen TJP1 (STINSHOFF et al. 2011). Die signifikante Reduzierung der TJP-Expression bei der Vitrifikationsmethode mit DMSO-haltigen Medien in der vorliegenden Arbeit kann hinsichtlich der Qualität der Embryonen von Bedeutung sein. So kann eine geringere Expressionsmenge Störungen in der Kompaktierungsphase und bei der Ausdifferenzierung des TE der Embryonen verursachen. Die Tatsache, dass eine tendenzielle Reduzierung der TJP1-Expression auch in der V2-Gruppe zu erkennen war legt die Vermutung nahe,

dass die Kryokonservierung an sich einen Einfluss auf die Bildung von Zellverbindungen und die Zelldifferenzierung der Embryonen hat.

Das von bovinen Embryonen ausgeschüttete Interferon  dient dem maternalen Organismus als primäres Signal zur Erkennung der Trächtigkeit (BAZER 1992). Die Ausschüttung erfolgt ausschließlich aus den Zellen des TE und beginnt bei bovinen Embryonen mit dem Blastozystenstadium (FARIN et al. 1990, WRENZYCKI et al.

1998). Die Menge des exprimierten IFNT2 ist abhängig von der Herkunft der Embryonen. In vitro produzierte Embryonen zeigten beispielsweise im Gegensatz zu in vivo generierten eine höhere Expression von IFNT2 (WRENZYCKI et al. 2001).

Dies scheint ein Anzeichen für eine schlechtere Embryonenqualität zu sein, da IVP-Embryonen mit einer höheren Expression IFNT2 zu geringeren Trächtigkeitsraten nach Embryotransfer führen (KUBISCH et al. 2004). Bei konventionell kryokonservierten bovinen IVP-Embryonen konnte im Gegensatz zu Embryonen welche vitrifiziert wurden, eine erhöhte IFNT2-Expression ermittelt werden, was bedeuten könnte, dass die konventionelle Kryokonservierung für IVP-Embryonen nicht so gut geeignet ist wie die Vitrifikation (STINSHOFF et al.

2011). Auch in der vorliegenden Arbeit konnte bei den vitrifizierten Embryonen kein Unterschied in der Expressionsmenge des IFNT2 im Vergleich zu denen des nicht kryokonservierten Standards ermittelt werden. Die Vitrifikation scheint demnach keinen Einfluss auf die IFNT2-Expression zu haben.

Auch bei der Betrachtung der PTGS2-Expression konnten in der vorliegenden Arbeit keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen den Embryonen der verschiedenen Gruppen festgestellt werden. Die Prostaglandin G/H-Synthase 2 spielt eine entscheidende Rolle in vielen Reproduktionsmechanismen. Sie beeinflusst die Ovulation, die Maturation der Oozyten, die Implantation von Embryonen oder auch die Plazentabildung (SIROIS et al. 1992, LIM et al. 1999). Nachgewiesen werden kann PTGS2 bei bovinen Embryonen in allen Stadien bis zur geschlüpften Blastozyste, wobei es hauptsächlich in den Zellen des TE vorkommt. Die Menge des exprimierten PTGS2 hat auch in bovinen Embryonen eine entscheidende Bedeutung, so bilden Embryonen von guter Qualität signifikant mehr PTGS2 als solche von schlechter Qualität (SAINT-DIZIER et al. 2011). GAD et al. konnten eine signifikante

Verringerung der Expression bei in vitro produzierten bovinen Embryonen im Vergleich zu in vivo generierten ermitteln (GAD et al. 2012). Da nach der Vitrifikation der Embryonen in der vorliegenden Arbeit keine signifikante Reduzierung der PTGS2-Expression zu erkennen war, kann davon ausgegangen werden, dass diese Art der Kryokonservierung keinen entscheidenden Einfluss auf die Expression von PTGS2 hat.

Das HSPA1A-Protein dient der Zelle unter anderem als Schutzprotein vor Hitzestress und als Chaperon. In Embryonen kann das Hitzeschockprotein in allen Entwicklungsphasen bis zur geschlüpften Blastozyste nachgewiesen werden (WRENZYCKI et al. 1998). Es dient als eine Art Indikator für den Nachweis suboptimaler Kulturbedingungen, so exprimieren beispielsweise Embryonen aus einer Kultur, welcher Serum zugesetzt ist, signifikant mehr HSPA1A als solche aus einer Kultur mit PVA (WRENZYCKI et al. 1999). Auch bei dem Vergleich zwischen in vitro produzierten und in vivo gewonnenen Embryonen kann ein Unterschied in der HSPA1A-Expression festgestellt werden. So exprimieren bovine und murine IVP-Embryonen größere Mengen des Proteins, was die Vermutung nahe legt, dass die IVP-Embryonen größeren Stressfaktoren ausgesetzt sind (CHRISTIANS et al.

1995, WRENZYCKI et al. 2001). Auch bei der Kryokonservierung konnten Unterschiede in der HSPA1A-Expression festgestellt werden, diese sind jedoch nicht eindeutig. So ermittelten PARK et al. und KUZMANY et al. eine Steigerung der HSPA1A-Expression nach dem Auftauen vitrifizierter in vitro produzierter boviner Embryonen (PARK et al. 2006, KUZMANY et al. 2011), SIQUEIRA FILHO et al.

konnten dagegen keine Veränderung der Expression feststellen (SIQUEIRA FILHO et al. 2011). AKSU et al. konnten ebenfalls eine gesteigerte Expression eines ähnlichen Hitzeschockproteins, HSPA5, nach der Vitrifikation boviner in vitro produzierter Embryonen im Vergleich zu in vivo generierten ermitteln (AKSU et al.

2012). STINSHOFF et al. stellte jedoch sowohl bei der konventionellen Kryokonservierung als auch bei der Vitrifikation eine niedrigere Expression von HSPA1A in den kryokonservierten Embryonen im Vergleich zu nicht eingefrorenen IVP-Embryonen fest (STINSHOFF et al. 2011). Diese widersprüchlichen Ergebnisse sind durch die Verwendung verschiedener Kultursysteme in den einzelnen Arbeiten

zu erklären, da diese nachweislichen Einfluss auf die HSPA1A-Expression haben können (WRENZYCKI et al. 1999). In der vorliegenden Arbeit konnte, ähnlich wie bei STINSHOFF et al. (2011) eine verminderte HSPA1A-Expression der Embryonen der V1- und der KV2-Gruppe im Vergleich zu denen der V2- und KV1-Gruppe festgestellt werden. Weiterhin war die Expression der Embryonen der V1-Gruppe im Vergleich zu denen der Kontrollgruppe signifikant reduziert. Dies kann auf eine verminderte Qualität der Embryonen der V1- und der KV2-Gruppe hindeuten, da diese durch die möglicherweise geringere Proteinbildung nicht mehr ausreichend auf Stressfaktoren reagieren können, was zu einer geringeren Überlebensfähigkeit führen kann. Ob sich diese beispielsweise auch bei den Trächtigkeitsraten nach Übertragung solcher Embryonen bemerkbar macht, müsste in weiteren Untersuchungen getestet werden.

Das DSC2 ist ein wichtiger Bestandteil des Zell-Zell-Verbindungsapparates (FLEMING et al. 1991). Es wird nachweislich ab dem 2-4 Zellstadium exprimiert und spielt eine entscheidende Rolle in der Stabilisierung des Blastozoels von Embryonen (WRENZYCKI et al. 1998). In vitro produzierte, bovine Embryonen zeigen eine verringerte Expression von DSC2 im Vergleich zu in vivo generierten, was eine Erklärung für die zum Teil verzögerte Entwicklung dieser Embryonen wäre (WRENZYCKI et al. 2001, KNIJN et al. 2002). Auch die Zusammensetzung der Kulturmedien hat einen Einfluss auf die Expression von DSC2. Embryonen aus einer Kultur mit PVA-Zusatz zeigen eine erhöhte Expression im Vergleich zu Embryonen aus einer Kultur mit Serum (WRENZYCKI et al. 1999). Nach der Kryokonservierung konnte in der vorliegenden Arbeit eine Reduzierung der DSC2-Expression in den Embryonen der V1- und der KV2-Gruppe im Vergleich zu den drei anderen Gruppen nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse werden durch STINSHOFF et al. (2011) bestätigt, welche ebenfalls eine Reduzierung der Desmocollin-Expression nach der Vitrifikation boviner IVP-Embryonen ermittelten. Da in der vorliegenden Arbeit die DSC2-Expression in der Vitrifikationsgruppe mit DMSO-Zusatz signifikant geringer war als in der Kontrollgruppe und der V2-Gruppe, kann dies ein Hinweis auf eine reduzierte Entwicklung der so vitrifizierten Blastozysten sein. Dies müsste durch weitere Untersuchungen wie beispielsweise das Übertragen so vitrifizierter Embryonen und die Ermittlung der Trächtigkeitsraten oder auch durch eine

Immunfluorenzenzuntersuchung zur Darstellung der Zell-Zell-Verbindungen weiter untersucht werden.

5.4. Schlussfolgerungen

Die Verwendung verschiedener Vitrifikationsmedien hat einen entscheidenden Einfluss auf die Qualität der Embryonen nach dem Auftauen. Dies kann in der vorliegenden Arbeit verdeutlicht werden. Die morphologische Qualitätsmessung durch die Ermittlung der Reexpansions- und Schlupfraten dient häufig als erste Analysemethode vitrifizierter IVP-Embryonen. Die Embryonen, welche zuvor durch DMSO-freie Medien kryokonserviert wurden, zeigten eine geringere Reexpansions- und Schlupfrate und eine geringere Lebend-Tot-Zellratio als die Embryonen der anderen Gruppen. Dies legt die Vermutung nahe, dass die Embryonen durch das DMSO-freie Vitrifikationsmedium nicht ausreichend geschützt sind. DMSO hat eine ausgeprägte Fähigkeit zur Bildung eines glasähnlichen Zustandes (FRIEDLER et al.

1988, VALDEZ et al. 1992), wodurch es zur Vitrifikation sehr gut geeignet ist. Die Vitrifikation durch DMSO-freie Medien führte möglicherweise zu einer nicht ausreichenden Glasbildung, wodurch die Embryonen durch intrazelluläre Eiskristalle geschädigt werden können, was die geringeren Überlebensraten erklären würde.

Bei Betrachtung allerdings nicht nur der morphologischen Qualitätsanalyse sondern auch der Expressionsmessung entwicklungsrelevanter Gentranskripte wird deutlich, dass die Mehrheit der molekularen Veränderungen bei Embryonen der V1- und der KV2-Gruppe auftraten. So konnten in den Embryonen der V1-Gruppe Veränderungen in vier der sechs untersuchten Gentranskripte ermittelt werden, während in der V2-Gruppe nur bei der Expression von TJP1 eine tendenzielle Reduzierung im Vergleich zur Kontrollgruppe zu erkennen war. Dies lässt die Vermutung zu, dass die Vitrifikation mit DMSO zwar zu höheren Überlebensraten nach dem Auftauen der Embryonen führt, die toxische Wirkung des DMSO jedoch auf molekularer Ebene zu zahlreichen Veränderungen der Expression entwicklungsrelevanter Gentranskripte führt, welche bei der Vitrifikation ohne DMSO nicht auftreten.

Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass die Vitrifikation durch DMSO-haltige Medien zwar zu hohen Überlebensraten führt, die Embryonen auf molekularer Ebene jedoch signifikante Veränderungen aufweisen. Ob sich diese molekularen Veränderungen auch auf die Etablierung der Trächtigkeit und auf die Überlebensraten und Gesundheit der geborenen Kälber auswirken müsste in weiteren Versuchen untersucht werden. Die Vitrifikation durch DMSO-freie Medien scheint solche molekularen Veränderungen nicht auszulösen, allerdings konnten in der vorliegenden Arbeit keine zufriedenstellenden Überlebensraten der Embryonen nach dem Auftauen erreicht werden. Um eine praxisreife Methode zur Vitrifikation boviner Blastozysten zu entwickeln, sind demnach weitere Untersuchungen und Modifikationen der gewählten Methoden nötig. Die Entwicklung einer solchen Methode hat für die Rinderzucht, insbesondere im Hinblick auf die Ermittlung des genomischen Zuchtwertes von Embryonen, große Bedeutung. Die Vitrifikation ist für die Kryokonservierung in vitro produzierter boviner Embryonen besser geeignet als die konventionelle Kryokonservierung. Da die Embryonen zu Ermittlung des genomischen Zuchtwertes für den Zeitraum des Untersuchungsverfahrens kryokonserviert werden ist eine Verbesserung der Überlebensraten von großer Bedeutung. Auch in der Humanmedizin werden, bei der Präimplantationsdiagnostik, Biopsien von frühen Embryonalstadien entnommen und die Embryonen für die Dauer der Untersuchungen kryokonserviert. Eine Verbesserung der Konservierungsmethode wäre auch in diesem Bereich von enormer Bedeutung.

6. Zusammenfassung

Katharina Beuing

Auswirkungen zweier Vitrifikationsverfahren auf die morphologische und molekulare Qualität in vitro produzierter boviner Embryonen

Das Ziel der vorliegenden Studie war es den Einfluss zweier Vitrifikationsmedien auf die morphologische und molekulare Qualität boviner, in vitro generierter Embryonen zu untersuchen. Die Vitrifikation und das Auftauen von an Tag 7 expandierten Blastozysten, die aus einem Standard-IVP-System (SOFaa) stammten, erfolgte entweder mit einem Vitrifikationskit das unter anderem DMSO als Kryoprotektivum enthielt (V1, n=142; Gynemed, Lehnsahn, Deutschland), oder mit einem Kit, welches kein DMSO enthielt (V2, n=151; Origio, Berlin, Deutschland). Embryonen, die zwei weiteren Gruppen zugeordnet wurden, hatten nur Kontakt mit den jeweiligen Einfrier- respektive Auftaumedien, ohne tatsächlich kryokonserviert worden zu sein (KV1 - Kontakt zum DMSO-haltigen Medium der Firma Gynemed, n=107; KV2 - Kontakt zum DMSO-freien Medium der Firma Origio, n=97). Nach der Vitrifikation und dem Auftauen erfolgten weitere 48 Stunden der Kultur, um nach 24 bzw. 48 Stunden die Reexpansions- und Schlupfraten zu ermitteln.

Die Analyse der geschlüpfte Blastozysten der jeweiligen Gruppen erfolgte mittels einer Lebend-Tot-Färbung oder einer RT-qPCR. In der molekularen Analyse wurde die relative Transkriptmenge von SLC2A1, HSPA1A, IFNT2, TJP1, DSC2 und PTGS2 bestimmt. Als Standard dienten für diese Analysen nicht vitrifizierte, geschlüpfte Blastozysten (K), die weder Kontakt zu den Vitrifikationsmedien hatten noch eingefroren wurden. Die folgenden Ergebnisse konnten erzielt werden:

1. Die in den versuchen eingesetzten Blastozysten entstammen 26 IVP-Durchgängen. Die durchschnittliche Teilungsrate betrug 61,1 ± 6,2% (n = 2990). Die Entwicklungsrate bis zur Morula oder Blastozyste lag an Tag 7 bei 18,6 ± 4,8% (n = 906) und an Tag 8 bei 25,9 ± 6,1% (n = 1275).

2. Nach dem Auftauen lag die Reexpansionsrate für die expandierten Blastozysten der V1-Gruppe bei 89,2 ± 5,3%, die der V2-Gruppe bei 67,0 ± 15,5%. Die Schlupfrate lag bei 62,9 ± 12,2% für die Embryonen der V1- und bei 29,4 ± 14,5%

für die Embryonen der V2-Gruppe. Die Reexpansionsraten der Embryonen der KV1- bzw. der KV2-Gruppe lagen bei 90,0 ± 8,2% und 90,0 ± 15,4%, die Schlupfraten bei 69,2 ± 12,0% und 47,9 ± 17,8%. Es konnte eine statistisch signifikante Reduzierung der Reexpansions- und Schlupfrate der Embryonen der V2-Gruppe im Vergleich zu allen anderen Gruppen ermittelt werden. Des Weiteren konnte eine Reduzierung der Schlupfrate der KV2-Blastozysten im Vergleich zu den Blastozysten der KV1-Gruppe festgestellt werden.

3. Die durchschnittliche Zellzahl lag bei den Embryonen der einzelnen Versuchsgruppen bei 119,8 ± 5,8 in der V1-Gruppe (n = 25), 123,5 ± 4,0 in der V2-Gruppe (n = 20), 120,6 ± 4,8 in der KV1-Gruppe (n = 25), 119,0 ± 5,0 in der KV2-Gruppe (n = 25) und 116,7 ± 4,8 in der Kontrollgruppe (n = 24). Es konnte kein statistisch signifikanter Unterschied in der Gesamtzellzahl der geschlüpften Blastozysten zwischen den einzelnen Gruppen festgestellt werden. Die Lebend-Tot-Zellratio war bei den Embryonen der V2-Gruppe (7,8 ± 0,8) statistisch signifikant niedriger als die der V1-Gruppe (12,5 ± 0,9), der KV1-Gruppe (15,6 ± 2,1), der KV2-Gruppe (13,1 ± 1,0) und der Kontrollgruppe (17,0 ± 2,0).

4. Die Analyse der relativen Transkriptmengen von IFNT2 und PTGS2 ergab keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen der Embryonen der einzelnen Gruppen.

5. Die Expression von SLC2A1 war in den Embryonen der V1-Gruppe signifikant niedriger als in den Embryonen der KV1- und der Kontrollgruppe.

6. Bei der Analyse der Blastozysten der Gruppen V1 und KV2 konnten signifikant weniger TJP1-Transkripte nachgewiesen werden als in denen der Kontrollgruppe.

Tendenziell waren in den Embryonen der V2-Gruppe ebenfalls weniger TJP1-Transkripte als in den Embryonen der Kontrollgruppe darstellbar.

7. Blastozysten, die nach dem KV2- oder dem V1-Protokol behandelt wurden, wiesen eine geringere Menge an DSC2-Transkripten auf als die Blastozysten der anderen Versuchsgruppen und der Kontrollgruppe.

8. Die Expression von HSPA1A war in den Embryonen der V1-Gruppe statistisch signifikant niedriger als in denen der Kontrollgruppe, der V2- und der KV1-Gruppe. Die Transkriptmenge der Embryonen der KV2-Gruppe war signifikant niedriger als die der Embryonen der V2- und der KV1-Gruppe, unterschied sich jedoch im Vergleich zur Kontrollgruppe nicht.

Schlussfolgernd lässt sich festhalten, dass die Vitrifikation durch Medien, welche unter anderem DMSO als Kryoprotektivum enthalten, auf morphologischer Ebene zu einer besseren Überlebensfähigkeit nach dem Auftauen führt. Die Embryonen zeigen jedoch Veränderungen auf molekularer Ebene. Bei vier der sechs untersuchten, entwicklungsrelevanten Gentranskripte konnte eine verringerte Qualität im Vergleich zu den Embryonen der DMSO-freien Gruppen festgestellt werden. Inwiefern sich diese molekularen Unterschiede auf die Überlebensfähigkeit und die Gesundheit von Kälbern auswirken, müsste in weiteren Untersuchungen ermittelt werden.

7. Summary

Katharina Beuing

Effects of two different vitrification methods on the morphological and molecular quality of in vitro produced bovine embryos

The aim of the present study was to analyze the influence of two different vitrification solutions on the morphological and molecular quality of in vitro produced bovine embryos. Expanded day 7 blastocysts from a standard IVP-system (SOFaa) were either vitrified with a commercially available vitrification kit containing DMSO as a cryoprotective agent (V1, n= 142; Gynemed, Lehnsahn, Germany), or with a commercially available vitrification kit without DMSO (V2, n= 151; Origio, Berlin, Germany). Additional blastocysts were passed through the vitrification solutions without succeeding vitrification (KV1 – contact to the DMSO-containing vitrification-solutions, n= 107; KV2 – contact to the solution without DMSO, n= 97).

After thawing the blastocysts were further cultured for 48h. Reexpansion rates were documented 24h post thawing and finally 48h post thawing hatching rates were assessed. Hatched blastocycsts of all groups were either subjected to live-dead staining or the analysis of relative abundance of developmentally important gene transcripts (SLC2A1, HSPA1A, IFNT2, TJP1, DSC2 and PTGS) via RT-qPCR. As control, non vitrified blastocysts cultured until hatching were employed. The following results could be obtained:

1. The average cleavage rate lay at 61.1 ± 6.2% (n = 2990). Development rates were 18.6 ± 4.8% (n = 906) on day 7 and 25.9 ± 6.1% (n = 1275) on day 8.

2. After thawing re-expansion rates were 89.2 ± 5.3% among the blastocysts of the V1 group and 67.0 ± 15.5% in the V2 group. Hatching rates lay at 62.9 ± 12.2%

and 29.4 ± 14.5%. Reexpansion rates for blastocysts of the KV1 group were 90.0 ± 8.2% and 90.0 ± 15.4% for those of the KV2 group. Hatching rates of the

latter two groups lay at 69.2 ± 12.0% and 47.9 ± 17.8%, respectively. Significantly fewer embryos reexpanded and hatched in the V2 group compared to all other groups. Furthermore, significantly more embryos hatched in the KV2 group than in the KV1 group.

3. Average cell numbers lay at 119.8 ± 5.8 cells in embryos of group V1 (n = 25), 123.5 ± 4.0 cells V2 (n = 20), 120.6 ± 4.8 cells in KV1 (n = 25), 119.0 ± 5.0 cells in KV2 (n = 25) and 116.7 ± 4.8 cells in the control group (n = 24). No significant differences could be detected. The live/dead ratio was significantly decreased in blastocyst of the V2 group (7.8 ± 0.8) compared to those of the V1 (12.5 ± 0.9), KV1 (15.6 ± 2.1), KV2 (13.1 ± 1.0) and the control group (17.0 ± 2.0).

4. No significant differences could be detected regarding the expression of IFNT2 and PTGS2 among embryos of all groups.

5. The expression of SLC2A1 was significantly reduced in embryos derived from the V1 group in comparison to those from the KV1 and the control group.

6. A significantly lower amount of TJP1 transcripts was detected in embryos of the

6. A significantly lower amount of TJP1 transcripts was detected in embryos of the