Die konventionelle Kryokonservierung stellt das ursprünglich bei Embryonen eingesetzte Verfahren dar. Es wurde bei Forschungen zu den Effekten von Einfrier- und Auftauraten auf die Überlebensfähigkeit von Säugetierzellen entwickelt (MAZUR et al. 1972). Bei der konventionellen Kryokonservierung wird noch einmal zwischen langsamen und schnellen Gefrierverfahren unterschieden.
Bei den langsamen Gefrierverfahren werden die Embryonen bis zu einer bestimmten Temperatur langsam heruntergekühlt und bei dieser Temperatur für eine gewisse Zeit gelagert bevor, sie wieder aufgetaut werden. WHITTINGHAM benutzte ein solches Verfahren erstmalig 1971 für die Kryokonservierung von Mäuseembryonen, dabei lagen die Kühlraten bei ca. 1°C/s und die Embryonen wurden in einem
Medienvolumen von 0,25 ml in einem Glas- oder Plastikröhrchen eingefroren. Die Embryonen wurden für 30 Minuten auf Trockeneis bei -79°C in einem isolierten Gefäß gelagert, bevor sie wieder aufgetaut wurden. Als Kryoprotektivum kam hier PVP zum Einsatz (WHITTINGHAM 1971). Später wurden Einfrierautomaten verwendet, durch welche die Kühlraten individuell angepasst und eingestellt werden konnten.
Bei den schnellen Gefrierverfahren werden die Embryonen in diesen Gefrierautomaten ebenfalls zunächst schrittweise heruntergekühlt. Bei einer Temperatur von ca. -6°C wird das sogenannte „Seeding“ durchgeführt. Dabei wird manuell eine Kristallisation des extrazellulären Mediums hervorgerufen, wodurch schädliche Effekte auf den Embryo durch Unterkühlung vermieden werden sollen (LEIBO 1984). Daraufhin erfolgt die weitere langsame Kühlung auf ca. -20 - -40°C.
Anschließend werden die Embryonen, im Gegensatz zu den langsamen Gefrierverfahren, direkt in flüssigen Stickstoff überführt und können dort sehr lange gelagert werden.
Im Allgemeinen können bei der konventionellen Kryokonservierung die folgenden Schritte unterschieden werden (NIEMANN 1991):
Äquilibrierung des Embryos im Kryoprotektivum
Einführen des Embryos in das Trägersystem
Einführen des Trägersystems in den Einfrierautomaten und Herunterkühlen
Seeding
Erneutes Herunterkühlen
Überführung in flüssigen Stickstoff
Auftauen
Ausverdünnen des Mediums
Die Äquilibrierung im Kryoprotektivum erfolgte in mehreren Schritten, allerdings zeigte NIEMANN (1985), dass eine erfolgreiche Kryokonservierung auch mit nur einem Äquilibrierungsschritt in 1,4 M Glyzerin möglich ist. Heute werden bovine Embryonen bei der konventionellen Kryokonservierung standardmäßig in einem
Äquilibrierungsschritt in Ethylenglycol (EG) eingefroren. Eine große Verbesserung der Einfriertechnik wurde durch die Verwendung von Plastikstraws mit einem Volumen von 250 µl erreicht. Dadurch konnten die Embryonen zum einen besser in den Stickstoffcontainern gelagert werden, zum anderen war es nun möglich, eine Verdünnungslösung direkt mit in den Straw aufzuziehen, wodurch das Ausdünnen der Kryoprotektiva nach dem Auftauen vereinfacht werden konnte (MASSIP 2001).
Auf diese Weise gelang es LEIBO 1984 ein sogenanntes „One-step-Verfahren“ zu etablieren, bei dem das Kryoprotektivum durch Schütteln des Straws nach dem Auftauen direkt ausverdünnt wurde. Die Embryonen können dadurch, ohne dass eine weitere Manipulation im Labor nötig ist, unmittelbar auf Empfängertiere übertragen werden (LEIBO 1984).
2.3.2. Vitrifikation
Seit der Entwicklung und dem standardmäßigen Einsatz von Kryokonservierungstechniken bei Embryonen wurden immer neue, verbesserte Methoden entwickelt. Die Entwicklung der Vitrifikation gilt als eine zunehmend nennenswerte Alternative zur konventionellen Kryokonservierung (DOBRINSKY 2002). Die Vitrifikation ist ein physikalischer Prozess, bei dem ein flüssiges Medium durch extrem schnelle Kühlraten ohne die Bildung von Eiskristallen in einen amorphen, glasartigen Zustand übergeht (LUYET u. HODAPP 1938). Dadurch können Schäden durch die Bildung intrazellulärer Eiskristalle verringert werden. Ein weiterer Vorteil ist eine Zeitersparnis, die dadurch entsteht, dass die Zellen nicht mehr durch Einfrierautomaten schrittweise heruntergekühlt werden müssen, sondern nach einer Äquilibrierungszeit im Einfriermedium direkt in flüssigen Stickstoff überführt werden können. Des Weiteren entfallen die Kosten für die Anschaffung von Einfrierautomaten, welche zur konventionellen Kryokonservierung benötigt werden (RALL 1987, VAN WAGTENDONK-DE LEEUW et al. 1997). Die erste erfolgreiche Vitrifikation fand 1985 durch RALL und FAHY bei Mäuseembryonen statt. Die Embryonen wurden in einem Schritt in sehr hochkonzentrierten Lösungen äquilibriert, wobei Medien benutzt wurden, denen sowohl penetrierende als auch
nicht-penetrierende Kryoprotektiva zugesetzt waren. Durch VAN-WAGTENDONK-DE LEEUW et al. wurde 1997 zum ersten Mal eine große, vergleichende Versuchsreihe mit vitrifizierten und konventionell kryokonservierten bovinen Blastozysten veröffentlicht. Sie zeigten unter anderem, dass die Vitrifikation eine Methode ist, die auch unter praxisähnlichen Bedingungen keine Reduzierung der Trächtigkeitsraten im Vergleich zu konventionell kryokonservierten Embryonen hervorrief (VAN WAGTENDONK-DE LEEUW et al. 1997).
Laut ARAV et al. wird eine erfolgreiche Vitrifikation durch drei Hauptfaktoren beeinflusst. Diese sind eine genügend hohe Viskosität des Einfriermediums durch hohe Konzentrationen an Kryoprotektiva, das Erreichen möglichst hoher und gleichbleibender Kühl- und Auftauraten und ein möglichst kleines Probenvolumen.
Durch eine genügend hohe Viskosität des Mediums wird verhindert, dass beim Einfrieren der Embryonen in flüssigem Stickstoff Eiskristalle entstehen, welche die Zellmembran und die Zellorganellen schädigen können. Allerdings wird durch die Verwendung von hohen Konzentrationen an Kryoprotektiva die Gefahr der Zellschädigung durch toxische Effekte erhöht. Um diese zu minimieren, werden häufig Gemische aus mehreren Kryoprotektiva verwendet, wodurch die Konzentration der einzelnen Komponenten niedrig gehalten werden kann, die Fähigkeit zur Vitrifikation aber erhalten bleibt. Sowohl die Nutzung möglichst kleiner Probenvolumina als auch möglichst hoher Kühlraten bei der Vitrifikation dienen dazu, das Probenmaterial schnell in einen glasähnlichen Zustand zu überführen (ARAV et al. 2002). Beide Faktoren werden hauptsächlich durch die Wahl des Trägersystems beeinflusst. Dabei zeigt die Verwendung von offenen Trägersystemen wesentlich höhere Kühlraten, da das Probenmaterial in direktem Kontakt mit dem flüssigen Stickstoff steht. Einen limitierenden Faktor für die Kühlraten stellt die Bildung einer isolierenden Dampfschicht um das Probenmaterial dar, wodurch bei offenen Verfahren maximale Kühlraten von ca. 20.000°C/min erreicht werden können (VAJTA et al. 1998). Allerdings konnte durch die Verwendung von Stickstoff, der sich am Übergang vom flüssigen zum festen Aggregatzustand befand und damit eine Temperatur von -210°C aufwies, die Kühlraten auf ca. 53.000°C/min gesteigert werden (YAVIN et al. 2009). Ein weiterer Faktor, der die Qualität vitrifizierter
Embryonen beeinflusst, ist eine schrittweise Äquilibrierung in immer höher konzentrierten Medien vor dem eigentlichen Einfrierprozess. So konnte gezeigt werden, dass Blastozysten, die in vier oder mehr Schritten einer ansteigenden Konzentration an Kryoprotektiva ausgesetzt waren bessere Reexpansionsraten zeigten als solche, die nur zwei Äquilibrierungsschritte durchliefen oder direkt in das Vitrifikationsmedium überführt wurden (KUWAYAMA et al. 1992).
Vergleiche zwischen den Überlebensraten und der Qualität vitrifizierter und konventionell kryokonservierter boviner IVP-Embryonen ergaben, dass die Vitrifikation als Konservierungsmethode gleich gut oder besser geeignet zu sein scheint (MAHMOUDZADEH et al. 1995, KAIDI et al. 2001, DOBRINSKY 2002, VIEIRA et al. 2007, STINSHOFF et al. 2011). Beispielsweise unterschieden sich die Ergebnisse bezüglich der Trächtigkeitsraten beim Übertragen vitrifizierter oder konventionell Kryokonservierter boviner Embryonen nicht voneinander (VAN WAGTENDONK-DE LEEUW et al. 1997). Die Vitrifikation stellt demnach eine praxistaugliche, einfache und effektive Methode für die Kryokonservierung präimplantatorischer Embryonen bei Nutztieren dar.
2.4. Kryoprotektiva
Kryoprotektiva werden in zwei Gruppen eingeteilt: Die penetrierenden Kryoprotektiva, welche in der Lage sind, Zellmembranen zu überwinden und in hohen Konzentrationen Zellen vor Gefrierschäden bei langsamen Kühlraten zu schützen und die nicht-penetrierenden Kryoprotektiva, welche in wesentlich niedrigeren Konzentrationen eingesetzt werden können, jedoch schnellere Einfrierraten benötigen, um einen schützenden Effekt zu haben (MERYMAN 1971). Die erste erfolgreiche Kryokonservierung von Mäuseembryonen erfolgte in einem Gemisch aus phosphate buffered saline (PBS) mit Natriumchlorid (NaCl), BSA, Glukose und Penicillin G, dem PVP als Kryoprotektivum zugesetzt war (WHITTINGHAM 1971).
Als Basismedium für die Kryokonservierung wird meist PBS mit einem Zusatz von BSA oder FCS verwendet (NIEMANN 1991). Diesem Grundmedium werden ein oder mehrere Kryoprotektiva zugesetzt. Bei der Vitrifikation werden meist Gemische aus
penetrierenden und nicht-penetrierenden Kryoprotektiva verwendet, um die Konzentration und damit die Toxizität der Einzelsubstanzen zu verringern.