Untersuchungen zur in-vitro Empfindlichkeit boviner und porciner Erreger von Infektionen des Respirationstraktes gegenüber Florfenicol

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Untersuchungen zur in-vitro Empfindlichkeit boviner und porciner Erreger

von Infektionen des Respirationstraktes gegenüber Florfenicol

INAUGURAL - DISSERTATION

zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von

Saskia Priebe (geb. Wecker) aus Hannover

Hannover 2003

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1. Gutachter: Apl. Prof. Dr. S. Schwarz,

Institut für Tierzucht, Bundesforschungs- anstalt für Landwirtschaft (FAL)

2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. P. Valentin-Weigand

Tag der mündlichen Prüfung: 3. Juni 2003

Die Durchführung der vorliegenden Dissertation wurde von der Firma Schering- Plough unterstützt.

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oder Postern präsentiert:

PRIEBE, S. and S. SCHWARZ:

In vitro activities of florfenicol against bovine and porcine respiratory tract pathogens. Antimicrob. Agents Chemother., 2003, 47 (im Druck)

PRIEBE, S. and S. SCHWARZ:

Monitoring of florfenicol susceptibility in porcine respiratory pathogens collected at the time of introduction of florfenicol into clinical veterinary use.

Proceedings of the 103^rd General Meeting of the American Society for Microbiology (ASM), 2003, Z-053, 684-685

PRIEBE, S. und S. SCHWARZ:

In-vitro Empfindlichkeit porciner Atemwegsinfektionserreger gegenüber Florfeni-col.

Tagungsbericht des 25. Kongresses der Deutschen veterinärmedizinischen Gesellschaft (DVG), 2003 (im Druck)

PRIEBE, S., J. MUMME und S. SCHWARZ:

In-vitro Empfindlichkeit boviner Pasteurella multocida- und Mannheimia haemolytica-Isolate und porciner Pasteurella multocida- und Actinobacillus pleuropneumoniae-Isolate gegenüber Florfenicol.

Berl. Münch. Tierärztl. Wschr., 2002, 115: 342-343

WECKER, S. and S. SCHWARZ:

Studies on the in-vitro sensitivity to florfenicol of bovine Pasteurella multocida and Mannheimia haemolytica isolates.

Proceedings of the XXII. World Buiatrics Congress (WBC), 2002, 42-43

WECKER, S. and S. SCHWARZ:

Monitoring of florfenicol sensitivity in Pasteurella multocida and Mannheimia haemolytica from cattle as well as Pasteurella multocida and Actinobacillus pleuropneumoniae from swine.

Proceedings of the Meeting of the International Pasteurellaceae Society, 2002, P-84, 58.

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2.1 In-vitro Empfindlichkeitsprüfung bakterieller Infektionserreger ... 2

2.2 Methodik der in-vitro Empfindlichkeitsprüfung ... 5

2.2.1 Agardiffusionstest unter Verwendung von Testplättchen... 6

2.2.2 Epsilontest (E-Test) ... 9

2.2.3 Agardilution ... 11

2.2.4 Bouillondilution... 12

2.2.5 Korrelation von Ergebnissen aus Agardiffusions- und Bouillondilutionstest ... 16

2.3 Empfindlichkeitsprüfungen im Rahmen von Monitoringprogrammen.... 18

2.3.1 Untersuchungsmaterial ... 19

2.3.2 Untersuchungsmethode... 19

2.3.3 Nationale Resistenzmonitoringprogramme in der EU ... 22

2.4 Festlegung von Grenzwerten... 25

2.5 Taxonomische Einordnung der Genera Pasteurella, Mannheimia, Bordetella, Actinobacillus und Streptococcus... 29

2.6 Pasteurella, Mannheimia, Bordetella, Actinobacillus und Strepto- coccus als Erreger von Atemwegsinfektionen bei Rind und Schwein ... 31

2.6.1 Pasteurella- und Mannheimia-Infektionen... 31

2.6.2 Bordetella bronchiseptica-Infektionen ... 33

2.6.3 Actinobacillus pleuropneumoniae-Infektionen... 34

2.6.4 Streptococcus suis-Infektionen ... 35

2.6.5 Therapeutische Maßnahmen ... 36

2.7 Resistenz gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen... 37

2.7.1 Grundlagen der bakteriellen Resistenzentstehung ... 37

2.7.2 Resistenzmechanismen ... 38

2.7.3 Resistenzlage von Pasteurella-, Mannheimia-, Bordetella-, Actinobacillus und Streptococcus-Isolaten... 39

2.8 Florfenicol... 41

2.8.1 Struktur und Wirkungsweise ... 41

2.8.2 Untersuchungen zur Florfenicolresistenz... 43

2.8.3 Bisherige Untersuchungen zur Empfindlichkeit boviner Infektionserreger gegenüber Florfenicol ... 45

2.8.4 Bisherige Untersuchungen zur Empfindlichkeit porciner Infektionserreger gegenüber Florfenicol ... 46

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3.1.2 Kontrollstämme ... 50

3.1.3 Nährmedien ... 50

3.2 Methoden ... 51

3.2.1 Anzuchtbedingungen ... 51

3.2.2 Speziesdifferenzierung... 51

3.2.2.1 Isolate bovinen Ursprungs ... 51

3.2.2.2 Isolate porcinen Ursprungs... 52

3.2.3 Empfindlichkeitsprüfung... 52

3.2.3.1 Agardiffusionsmethode ... 52

3.2.3.2 Bouillondilutionsmethode... 54

3.2.4 Statistik ... 55

4 RESULTATE ... 58

4.1 Empfindlichkeitsbestimmung boviner Erreger ... 58

4.1.1 Pasteurella multocida... 58

4.1.1.1 Verteilung der HHD-Werte aus den Jahren 2000 und 2001 ... 58

4.1.1.2 Verteilung der MHK-Werte aus den Jahren 2000 und 2001... 60

4.1.1.3 Korrelation zwischen HHD- und MHK-Werten ... 62

4.1.2 Mannheimia haemolytica... 64

4.2 Empfindlichkeitsbestimmung porciner Erreger... 70

4.2.1 Pasteurella multocida... 70

4.2.2 Actinobacillus pleuropneumoniae... 76

4.2.3 Bordetella bronchiseptica... 82

4.2.4 Streptococcus suis... 88

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5.1 Vergleich und Bewertung eigener Untersuchungsergebnisse der

Isolate boviner Herkunft mit denen anderer Studien... 96

5.2 Vergleich und Bewertung eigener Untersuchungsergebnisse der Isolate porciner Herkunft mit denen anderer Studien ... 100

6 ZUSAMMENFASSUNG... 105

SUMMARY ... 108

7 LITERATURVERZEICHNIS ... 111

8 ANHANG ... 121

8.1 Medien und Lösungen ... 121

8.2 Chemikalien... 124

9 Tabellenverzeichnis ... 125

10 ABBILDUNGSVERZEICHNIS... 127

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A. pleuropneumoniae Actinobacillus pleuropneumoniae

Abb. Abbildung

aqua bidest. doppelt destilliertes Wasser (lat.: aqua bidestillata)

ATCC American Type Culture Collection

B. bronchiseptica Bordetella bronchiseptica

BAP Blutagarplatte(n)

bzw. beziehungsweise

E. coli Escherichia coli

et al. und andere (lat: et alii)

Fa. Firma

HHD Hemmhofdurchmesser

M. haemolytica Mannheimia haemolytica

µg/ml Mikrogramm pro Milliliter

MH Mueller-Hinton

MHK Minimale Hemmkonzentration

mm Millimeter

NCCLS National Committee on Clinical Laboratory Standards

P. multocida Pasteurella multocida

s. siehe

S. suis Streptococcus suis

spp. Spezies

subsp. Subspezies

Tab. Tabelle

z.B. zum Beispiel

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1 EINLEITUNG

Antimikrobielle Wirkstoffe stellen unverzichtbare Hilfsmittel für die Bekämpfung und Verhütung bakterieller Infektionen in Humanmedizin und Veterinärmedizin dar. Stei- gende Resistenzraten bei bakteriellen Infektionserregern limitieren insbesondere im veterinärmedizinischen Bereich zunehmend die zur Verfügung stehenden therapeutischen Optionen. Die Beobachtung, dass sämtliche Neuentwicklungen von antimikrobiellen Wirkstoffen wie Ketolide, Glycylcycline oder Oxazolidinone ausschließlich für die Anwendung in der Humanmedizin konzipiert sind bedeutet, dass für die Veterinärmedizin mittelfristig keine neuen Wirkstoffgruppen zu erwarten sind. Um die Wirksamkeit der derzeit in der Veterinärmedizin verfügbaren Wirkstoffe auch auf län- gere Sicht zu sichern, wurden Leitlinien zum verantwortungsbewussten Umgang mit antimikrobiellen Wirkstoffen erlassen, die die Anwendung antimikrobieller Substan- zen unter dem Aspekt einer Minimierung der bakteriellen Resistenzentwicklung fest- legen. Florfenicol ist einer der vielversprechendsten Wirkstoffe, der derzeit für die ausschließlich veterinärmedizinische Nutzung zur Verfügung steht. Eine stetige Überprüfung der Empfindlichkeit der hauptsächlich zu bekämpfenden Erreger von Atemwegsinfektionen bei Rind und Schwein gegenüber Florfenicol setzt eine konti- nuierliche Empfindlichkeitsprüfung auf der Grundlage einer ausreichend großen Zahl der betreffenden Erreger unter Verwendung einer international anerkannten Methodik voraus. Ein solches Monitoring stellt ein Frühwarnsystem dar, welches das Auftreten resistenter Erreger rechtzeitig erkennen lässt.

In der vorliegenden Studie wurden Erreger von Infektionen des Respirationstraktes vom Rind (Pasteurella multocida und Mannheimia haemolytica) und Schwein (Pasteurella multocida, Actinobacillus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica und Streptococcus suis) aus den Jahren 2000 und 2001 parallel mit zwei Verfahren, Agardiffusion und Mikrodilution, hinsichtlich ihrer Empfindlichkeit gegenüber Florfenicol untersucht. Die erhaltenen Resultate geben einen detaillierten Überblick über den Empfindlichkeitsstatus der mit Florfenicol hauptsächlich zu bekämpfenden Erreger in Deutschland und leisten einen wichtigen Beitrag zur Grenzwertfestlegung für Florfenicol bei Erregern, für die bislang keine anerkannten Grenzwerte vorliegen.

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2 LITERATURÜBERSICHT

2.1 In-vitro Empfindlichkeitsprüfung bakterieller Infektionserreger

Die Bestimmung der antimikrobiellen Empfindlichkeit bakterieller Infektionserreger wird in diagnostischen Labors mit dem Ziel durchgeführt, eine Vorhersage des Resultates einer Behandlung mit einem bestimmten antimikrobiellen Wirkstoff zu treffen. Erweist sich ein Erreger bei der in-vitro durchgeführten Empfindlichkeits- prüfung gegenüber einem potentiell für die jeweilige Behandlung als geeignet einge- stuften Wirkstoff als "empfindlich", so ist mit hoher Wahrscheinlichkeit davon auszugehen, dass mit dem Einsatz dieses Wirkstoffes ein Therapieerfolg zu erreichen ist.

Ergibt die in-vitro Empfindlichkeitsprüfung die Klassifizierung des betreffenden Infektionserregers als "resistent", so ist davon auszugehen, dass mit dem betreffenden Wirkstoff der angestrebte Therapieerfolg nicht zu erreichen ist. Neben den beiden Kategorien "empfindlich" und "resistent" findet man bei den meisten Test- systemen eine dritte Kategorie, die als "intermediär" oder "mäßig empfindlich"

bezeichnet wird. Sofern der betreffende Wirkstoff auch in höheren Dosierungen sicher angewendet werden kann, ist bei einem als "intermediär" klassifizierten Erreger eine höhere Wirkstoffdosis erforderlich, um den Behandlungserfolg sicherzustellen. Vielfach dient die Kategorie "intermediär" als Pufferzone im jeweiligen Test- system, um Erreger mit grenzgängiger Empfindlichkeit nicht fälschlicherweise als

"empfindlich" oder "resistent" einzustufen.

Ziel der in-vitro Empfindlichkeitsprüfung ist es, dem Arzt oder Tierarzt eine Hilfestellung in Hinblick auf die bestmögliche Auswahl des für die jeweilige Behandlung einzusetzenden antimikrobiellen Wirkstoffes zu geben. Die ideale Grundlage für eine Entscheidung für bzw. gegen einen betreffenden Wirkstoff schließt die Identifizierung des am Krankheitsgeschehen ursächlich beteiligten Erregers und die Bestimmung seiner in-vitro Empfindlichkeit gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen ein.

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Auch wenn in Einzelfällen Unterschiede zwischen der in-vitro Empfindlichkeit und der in-vivo Wirksamkeit beobachtet werden, liefert die in-vitro Empfindlichkeitsprüfung wertvolle Informationen und hilft diejenigen Wirkstoffe auszuschließen, gegenüber denen sich der betreffende Erreger bereits unter in-vitro Bedingungen als "resistent"

erwiesen hat.

In der Veterinärmedizin sind diese hilfreichen Hintergrundinformationen häufig zu dem Zeitpunkt, an dem seitens des Tierarztes ein unverzügliches Handeln erforderlich ist, nicht verfügbar. Die Entnahme einer Probe, ihr Versenden an ein Diagnostiklabor und Erhalten der erwünschten Ergebnisse dauert mindestens 2 – 3 Tage. Zudem ist bei Infektionsprozessen, die ganze Herden betreffen können, in der Regel sofortiges Handeln gefragt. Daher erfolgt die Auswahl eines geeigneten Wirkstoffes unter solchen Bedingungen häufig auf der Grundlage der meist nicht durch adäquate Laboruntersuchungen abgesicherten klinischen Diagnose, empirischen Daten und der Erfahrung des Tierarztes. Sofern der direkte Beginn einer antimikrobiellen Behandlung unumgänglich ist, empfiehlt sich die initiale Anwendung eines Breitspektrum-Antibiotikums, wobei – sobald die Daten zum Erreger und seiner Empfindlichkeit vorliegen – ein Wechsel zu einem Wirkstoff angezeigt ist, der spezifisch auf den zu bekämpfenden Erreger ausgerichtet ist.

Darüber hinaus muss der Tierarzt die pharmakologischen und pharmakokinetischen Eigenschaften des einzusetzenden Wirkstoffes – insbesondere in Hinblick auf die mit dem geplanten Therapieregime am jeweiligen Infektionsort erreichbaren Wirkstoffkonzentrationen – sorgfältig bedenken. Im Rahmen der antimikrobiellen Therapie muss sichergestellt sein, dass bei konzentrationsabhängig wirkenden Antibiotika (z.B. Aminoglykoside, Fluorchinolone) unter Berücksichtigung pharmakokinetischer Parameter, toxischer Wirkungseigenschaften sowie der Rückstands-/Wartezeitproblematik eine ausreichend hohe Spitzenkonzentration im Zielgewebe erreicht werden muss, um eine antibakterielle Wirkung gegenüber dem zu bekämpfenden Erreger zu gewährleisten.

Bei zeitabhängig wirkenden Antibiotika (z.B. Tetracycline, Makrolide, Florfenicol) ist zu berücksichtigen, dass im Zielgewebe über den Behandlungszeitraum eine ausreichend hohe Wirkstoffkonzentration aufrechterhalten werden muss, um die gewünschte antibakterielle Wirkung gegenüber dem zu bekämpfenden Erreger

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sicherzustellen. Auch hierbei muss der Tierarzt abwägen, ob die erforderliche Wirk- stoffkonzentration im Zielgewebe ebenfalls unter Berücksichtigung pharmakokinetischer Parameter, toxischer Wirkungseigenschaften sowie der Rückstands- /Wartezeitproblematik bei vertretbaren praxisrelevanten Behandlungsbedingungen (Behandlungsintervallen) erreicht werden kann. Aus pharmakologischer Sicht sind diesbezüglich die Resorptionsrate des Wirkstoffes in Abhängigkeit von der Applika- tionsform und der Zeitpunkt des Wirkstoffmaximums nach Verabreichung (Peak) zu beachten. In Hinblick auf die Verteilung des Wirkstoffes sind Eiweißbindung, Vertei- lungsvolumen, Wirkstoffkonzentration im Blut bzw. Plasma und in den verschiedenen Körperflüssigkeiten und Geweben von großer Bedeutung. Weiterhin spielen die Bio- transformation und Ausscheidung (Halbwertszeit t50, Clearance) des antimikrobiellen Wirkstoffes eine wichtige Rolle. Mögliche Interaktionen des Wirkstoffes mit anderen Pharmaka müssen vor Beginn einer jeden Behandlung bedacht werden. Neben den pharmakokinetischen Eigenschaften des jeweiligen Wirkstoffes sind außerdem die klinischen Erfahrungswerte bei der Anwendung des Wirkstoffes in Betracht zu ziehen.

Bei jedem Therapieregime ist unbedingt sicherzustellen, dass subtherapeutische Wirkstoffkonzentrationen vermieden werden. Die Therapiedauer sollte so kurz wie möglich, aber so lange wie notwendig gewählt werden. Während der gesamten Behandlungsdauer ist die jeweils volle therapeutische Dosis anzuwenden. Weiterhin sollte grundsätzlich jede Anwendung antimikrobiell wirksamer Substanzen bei Tieren immer durch den Tierarzt oder zumindest unter dessen Aufsicht erfolgen.

Aus den vorab genannten Aspekten ist ersichtlich, dass die Auswahl des am besten geeigneten antimikrobiellen Wirkstoffes oft eine ausgesprochen schwierige Entscheidung ist, bei der der Tierarzt sorgfältig sämtliche Vorteile und Risiken der Behandlung mit dem einen oder anderen Wirkstoff – auch unter Berücksichtigung wirtschaftlicher Aspekte – gegeneinander abwägen muss.

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2.2 Methodik der in-vitro Empfindlichkeitsprüfung

Prinzipiell sollte eine mikrobiologische Diagnostik und damit auch die Durchführung von in-vitro Empfindlichkeitsprüfungen nur in einem entsprechend ausgestatteten Labor von fachkundigen Personen durchgeführt werden, um die Einhaltung von Qualitätsstandards zu gewährleisten und um Fehlinterpretationen der Ergebnisse zu vermeiden. Diese Voraussetzungen sind nötig, da für eine aussagekräftige Interpretation von Empfindlichkeitsprüfungen der ursächlich am Infektionsgeschehen beteiligte Erreger diagnostisch erfasst und differenziert werden muss. Für eine derartige Diagnostik müssen spezielle Anzuchtbedingungen (Medien, Zusätze, Anaerobiertöpfe etc.), insbesondere auch für anspruchsvollere Keime, vorhanden sein. Auch die Empfindlichkeitsbestimmung – insbesondere bei anspruchsvollen Bakterien – ist mitunter aufwendig und von vielen Faktoren beeinflussbar. Neben den zur Qualitätssicherung in die Untersuchungen einbezogenen Referenzstämmen müssen auch die verwendeten Medien und wirkstoffhaltigen Plättchen (beim Agardiffusionstest) bzw. Mikrotiterplatten (bei der Mikrodilution) ständig überprüft werden. Diese Aufwendungen zur Qualitätskontrolle werden sicherlich nur für die Diagnostiklabors sinnvoll sein, denen täglich eine ausreichend große Anzahl an Proben vorliegt, in denen die Möglichkeiten zur ordnungsgemäßen Durchführung von Erregerdifferenzierung und Empfindlichkeitsprüfung vorhanden sind und die über Personal mit spezifischen mikrobiologischen Fachkenntnissen sowie Erfahrung in der Durchführung und Auswertung der Empfindlichkeitsprüfungen verfügen. Die Landesveterinäruntersuchungsämter, die Diagnostikeinrichtung der veterinär- medizinischen Fakultäten sowie private Diagnostiklabors bieten die zuverlässige Erregerbestimmung und Empfindlichkeitsprüfung im Rahmen ihrer Serviceleistungen an. Von einer Durchführung antimikrobieller Empfindlichkeitsprüfungen in der eigenen tierärztlichen Praxis ist dringend abzuraten.

Zur Bestimmung der in-vitro Empfindlichkeit bakterieller Erreger gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen stehen unterschiedliche Verfahren zur Verfügung, die sich prinzipiell in Diffusions- und Dilutionsmethoden unterteilen lassen.

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Die Durchführung der einzelnen Testmethoden ist exakt in verschiedenen Durchführungsvorschriften festgelegt, deren strikte Befolgung eine wichtige Voraussetzung für den Erhalt verlässlicher Daten ist. Die einzelnen Durchführungsvorschriften unterscheiden sich in Hinblick auf die für das jeweilige Testsystem und die zu testende Erregergruppe verwendeten Medien Inokula und Testbedingungen. Weiterhin bestehen Unterschiede in Hinblick auf die Verwendung der zur Qualitätssicherung einzusetzenden Referenzstämme sowie den pro Testsystem zur Klassifizierung der Erreger angegebenen Grenzwerten für die Kategorien "empfindlich", "intermediär" und "resistent". Die Anwendung einer bestimmten Durchführungsvorschrift sollte während einer Studie unbedingt beibehalten werden, um die Untersuchungsergebnisse vergleichen zu können.

Nachfolgend werden zunächst die unterschiedlichen Verfahren zur in-vitro Empfindlichkeitsprüfung mit ihren Vor- und Nachteilen kurz dargestellt.

2.2.1 Agardiffusionstest unter Verwendung von Testplättchen

Der Agardiffusionstest beruht auf dem Prinzip der Diffusion eines antimikrobiellen Wirkstoffes aus Plättchen in das umliegende Medium. Dabei ist das Plättchen mit einer definierten Menge des betreffenden antimikrobiellen Wirkstoffes beschickt. Um das Plättchen entsteht somit im Agar ein Wirkstoffgradient, bei dem die höchste Wirkstoffkonzentration in unmittelbarer Nähe des Plättchens besteht, während in Richtung Peripherie eine logarithmischen Abnahme der Wirkstoffkonzentration zu beobachten ist. In den Bereichen, in denen die Wirkstoffkonzentration ausreichend hoch ist, um das Wachstum des zu testenden Erregers zu unterdrücken, ergibt sich eine bakterienfreie Zone, die als Hemmhof bezeichnet wird. Nach der Inkubationsperiode werden die für jeden Wirkstoff zu beobachtenden Hemmhöfe ausgemessen.

Anschließend erfolgt ein Vergleich der Hemmhofdurchmesser mit bereits vorliegenden Referenzwerten aus den jeweiligen Durchführungsvorschriften. Auf der Grund- lage dieses Vergleichs erfolgt dann die Einstufung des Erregers als "empfindlich",

"intermediär" oder "resistent" gegenüber dem jeweils getesteten Wirkstoff.

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Der Agardiffusionstest ist ein einfach durchzuführender, bei Einhaltung standardisierter Bedingungen zuverlässiger und leicht auswertbarer Test, der zudem mit vergleichsweise geringem Zeit- und Kostenaufwand verbunden ist. Weiterhin ist der Agardiffusionstest ausgesprochen flexibel hinsichtlich der zu testenden Wirkstoffe. Die Auswertung der Hemmhofdurchmesser ist unter Verwendung entsprechender Geräte und Auswertungssoftwares zumindest partiell automatisierbar. Da bei diesem Test mehrere Wirkstoffe zeitgleich auf einer Agarplatte getestet werden können, findet dieser Test derzeit noch in vielen Routinelabors seine Anwendung.

Abbildung 2-1: Resultat eines Agardiffusionstests zur Bestimmung der in-vitro Empfindlichkeit eines bakteriellen Erregers

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Nachteilig an diesem Testsystem ist, dass die Ergebnisse nicht in Form quantitativer Werte, sondern in Form der qualitativen Kategorien "empfindlich", "intermediär" oder

"resistent" angegeben werden. Weiterhin können viele Faktoren die Testergebnisse beeinflussen (STOCK et al. 2001).

Eine unterschiedliche Schichtdicke des Agars führt zu einer erheblichen Beeinflussung des Untersuchungsergebnisses, da die Schichtdicke des Agars negativ mit dem Hemmhofdurchmesser korreliert ist. Bei zu dickem Agar ergeben sich kleinere Hemmhöfe, während bei zu dünnen Agarplatten die Hemmhöfe im Vergleich zur Verwendung von Agarplatten mit korrekter Schichtdicke deutlich größer ausfallen. Zum einen garantiert die Verwendung industriell hergestellter Agarplatten eine gleichbleibende Schichtdicke, zum anderen kann bei eigener Herstellung auf die verschiedenen Leitlinien (DIN, NCCLS) zurückgegriffen werden. Das Keiminokulum beeinflusst nachhaltig das Ergebnis der Empfindlichkeitsprüfung. Je höher die Bakterienmenge im Inokulum ist, desto kleiner ist der anschließend entstehende Hemmhofdurchmesser. Eine Einstellung des Inokulums sollte auf der Basis des in der jeweiligen Durchführungsvorschrift angegebenen McFarland- Standards erfolgen. Alter und Zusammensetzung der Agarplatten beeinflussen ebenfalls das Testergebnis. Generell ist darauf zu achten, dass nur die in den Durchführungsvorschriften ausdrücklich benannten Medien in der vorgegebenen Konzentration zur Herstellung der Agarplatten verwendet werden. Bei kommerziell hergestellten Agarplatten ist auf eine schnelle Lieferung und sorgfältige Lagerung anhand der Angaben des Herstellers zu achten. Bei eigener Herstellung sollte exakt nach den Herstellervorschriften vorgegangen werden. Eine Prüfung der entsprechenden Chargen ist unerlässlich. Die Qualität der Testblättchen, wie Papierqualität, Beschickung und Größe ist in Deutschland standardisiert. Lediglich bei unsachgemäßer Lagerung ist eine negative Beeinflussung des Testergebnisses nicht auszuschließen. Aus diesem Grund sollte die Lagerung entsprechend den Angaben des Herstellers erfolgen, wobei das Haltbarkeitsdatum der Testblättchen zu berücksichtigen ist. Testplättchen, deren Haltbarkeitsdatum – auch bei sachgemäßer Lagerung – überschritten ist, dürfen keinesfalls mehr zur Anwendung kommen.

Die Positionierung der Plättchen auf der Agarplatte ist von nicht zu unterschätzender Bedeutung. Eine fehlerhafte Positionierung einzelner Plättchen

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kann das Ausmessen der entsprechenden Hemmhofdurchmesser erheblich erschweren und zu Fehlinterpretationen der Ergebnisse führen. Durch die Verwendung eines Dispensers kann diesem Kritikpunkt entgegengewirkt werden.

Auch in Hinblick auf die Inkubation sind verschiedene Aspekte zu bedenken. Der Begriff der Inkubation beinhaltet die Prädiffusionszeit, die Atmosphäre, die Temperatur und die Dauer der Inkubation, wodurch das Ergebnis eines Tests erheblich beeinflusst werden kann. Aufgrund der starken Einflussnahme dieser Parameter auf das Testergebnis, muss sich die Durchführung der Empfindlichkeitsprüfung diesbezüglich strikt an den in den jeweiligen Vorschriften festgelegten Vorgaben orientieren. Hinsichtlich der Auswertung von Agardiffusionstests zeigen sich mitunter große Diskrepanzen. Bei der manuellen Auswertung ergeben sich individuelle Schwankungen in Abhängigkeit von der die Auswertung durchführenden Person, aber auch Schwankungen, die auf den verwendeten Hilfsmitteln zur Ausmessung der Hemmhöfe (Lineale, Schieblehren, etc.) basieren. Um diese Fehlerquellen möglichst gering zu halten, sollte im Rahmen einer Studie möglichst die gleiche Person unter Verwendung des gleichen Hilfsmittels die Auswertung vornehmen. Die Verwendung von Auswertesoftwares und entsprechender Geräte minimiert diese individuellen Fehlerquellen.

Zusammenfassend ist festzustellen, dass der Agardiffusionstest ein rein qualitatives Ergebnis liefert, während jedoch in vielen Fällen ein quantitatives Ergebnis, welches den Grad der Empfindlichkeit des zu untersuchenden Erregers anzeigt, erwünscht ist. Unter Verwendung des Agardiffusionstests und seiner in qualitativen Kategorien wiedergegebenen Ergebnisse lassen sich nur bedingt allgemeine Aussagen über die aktuelle Resistenzlage und Resistenzentwicklungstendenzen im Rahmen von Monitoringprogrammen erarbeiten.

2.2.2 Epsilontest (E-Test)

Bei dem E-Test (BOLMSTRÖM et al. 1988) handelt es sich um eine spezielle Form des Agardiffusionstests. Der E-Test wird wie der reguläre Agardiffusionstest auf einem festen Testmedium durchgeführt. Im Gegensatz zu dem mit einer definierten

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Wirkstoffmenge beschickten Plättchen kommt beim E-Test ein Kunststoffstreifen (E- Test-Streifen) zum Einsatz, der den betreffenden Wirkstoff in einer Vielzahl von Verdünnungsstufen – meist als zweifache Verdünnungsreihe – enthält. Die Wirkstoffkonzentrationen sind auf dem Streifen vermerkt und so für die Auswertung des Testergebnisses ablesbar. Die Durchführung des E-Tests ähnelt weitgehend der des regulären Agardiffusionstests. Aus dem E-Test-Streifen diffundieren die unterschiedlichen Wirkstoffmengen in den Agar und produzieren anstelle eines kreisrunden Hemmhofes nun einen ellipsoiden Hemmhof um den Streifen herum.

Dort, wo das sichtbare Bakterienwachstum den Teststreifen trifft, wird der MHK-Wert abgelesen. Als MHK-Wert wird die nächste, auf das sichtbare Bakterienwachstum folgende, Wirkstoffkonzentration angegeben.

Abbildung 2-2: Schematische Darstellung des Resultats eines E-Tests zur Bestim- mung der in-vitro Empfindlichkeit eines bakteriellen Erregers

Der E-Test ermöglicht im Vergleich zum regulären Agardiffusionstest, durch die Be- stimmung des MHK-Wertes, eine quantitative Beschreibung des Resistenzverhaltens eines bestimmten Erregers. Der E-Test ist jedoch weitaus arbeitsintensiver, und die E-Teststreifen – sofern sie für den entsprechenden Wirkstoff überhaupt kommerziell erhältlich sind – sind erheblich teurer als die im Agardiffusionstest verwendeten Plätt- chen. Darüber hinaus kann das Ablesen der Werte bei mukoid wachsenden oder

∈∈

PG 96 64 48 32 24 16 12 8 6 4 3 2 1,5 1,0 ,75 ,50 ,38 ,25 ,12

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stark hämolytisch aktiven Bakterien mitunter erschwert sein. Die pro Platte mittels E- Test zu untersuchenden Wirkstoffe sind bei Verwendung regulärer Agarplatten auf zwei Wirkstoffe, bei Verwendung größerer Agarplatten auf fünf Wirkstoffe begrenzt.

Aus dieser Limitierung der pro Platte zu testenden Wirkstoffe ergeben sich ebenfalls erhöhte Materialkosten. Zudem ist eine automatische Durchführung des E-Tests und eine computergestützte Auswertung der Testergebnisse derzeit noch nicht möglich.

Hinsichtlich potentieller Fehlerquellen bei der Durchführung des E-Tests sind die beim Agardiffusionstest aufgelisteten Faktoren zu berücksichtigen.

2.2.3 Agardilution

Bei der Agardilution handelt es sich um einen Reihenverdünnungstest unter Verwendung eines festen Mediums. Dazu werden Agarplatten hergestellt, die jeweils eine bestimmte Verdünnungsstufe eines antimikrobiellen Wirkstoffes enthalten.

Anschließend erfolgt das Auftragen einer definierten Menge des zu untersuchenden Bakterienstammes. Nach der Inkubationsperiode wird das Bakterienwachstum auf den einzelnen Platten begutachtet. Als MHK gilt die niedrigste Verdünnungsstufe des Wirkstoffes, bei der kein Wachstum des zu untersuchenden Erregers mehr festzustellen ist. Mit Hilfe der Agardilution kann somit eine Bestimmung des MHK- Wertes eines speziellen Erregers für ein bestimmtes Antibiotikum erfolgen. Auf der Grundlage dieses im Agardilutionstest ermittelten MHK-Wertes erfolgt über den Vergleich mit vorliegenden MHK-Referenzwerten zudem eine Einstufung des Erregers als "empfindlich", "intermediär" oder "resistent".

Die Agardilution ist eine gut standardisierte, zuverlässige Methode, die durch die Bestimmung des MHK-Wertes eine präzisere Beschreibung des Resistenzverhaltens des zu untersuchenden Erregers ermöglicht. Bei diesem Verfahren ist – im Gegensatz zur nachfolgend beschriebenen. Bouillondilutionsmethode – von Vorteil, dass mögliche mikrobielle Kontaminationen, die das Testergebnis beeinflussen können, schnell und sicher erkannt werden. Dieser Test ist jedoch weitaus zeit- arbeits- und kostenintensiver, da jeweils nur ein Wirkstoff pro Agarplatte getestet werden kann. Im Gegensatz zu den vorab beschriebenen Diffusionsverfahren spielt

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hier die Schichtdicke des Agars keine Rolle, während andere Faktoren wie die Inokulumdichte, die Inkubationsbedingungen und –zeiten, die Verwendung eines für die Agardilution geeigneten Mediums sowie Alter und Lagerung der Testmedien auch bei dieser Methode von großer Bedeutung sind.

2.2.4 Bouillondilution

Auch die Bouillondilution basiert auf der Herstellung einer Serienverdünnung eines antimikrobiellen Wirkstoffes in einem bestimmten Testmedium, welches hierbei jedoch flüssig ist. In Abhängigkeit von der Menge des Flüssigmediums wird die Bouillondilution in "Makrodilution“ und "Mikrodilution“ unterteilt. Die Makrodilution wird in der Regel mit Volumina von 3 – 5 ml in Reagenzgläsern durchgeführt, während die Mikrodilution unter Verwendung von deutlich kleineren Volumina (50 – 100 µl) in Mikrotiterplatten durchgeführt wird. Bei der Makrodilution wird eine hohe Ausgangskonzentration (meist 256 µg/ml oder 512 µg/ml) hergestellt. Durch entsprechende Verdünnung dieser Ausgangskonzentration ergibt sich eine zweifache Verdünnungsreihe des betreffenden Wirkstoffes, die dann mit einer definierten Menge der zu testenden Bakterien versetzt wird. Bei den kommerziell erhältlichen Mikrotiterplatten zur Bestimmung der in-vitro Empfindlichkeit liegen die zu testenden Wirkstoffe in getrockneter Form und in der entsprechenden Konzentration in den jeweiligen Kavitäten der Mikrotiterplatte vor.

Nach der Zugabe einer den zu testenden Erreger in geeigneter Konzentration enthaltenden Bakteriensuspension, löst sich der Wirkstoff in dem Medium und entfaltet seine Wirkung. Um die Verdunstung des Mediums während der Inkubationszeit zu verhindern, wird die Mikrotiterplatte mit einer Folie versiegelt.

Nach der Inkubationsperiode werden bei Makro- und Mikrodilution die Reagenzgläser bzw. Kavitäten der Mikrotiterplatte hinsichtlich des Bakterienwachstums untersucht. Bei der Makrodilution zeigt sich das Bakterienwachstum in Form einer Trübung des Mediums, während bei der Mikrodilution ein "Knopf“ am Boden der jeweiligen Kavität der Mikrotiterplatte ein Bakterienwachstum anzeigt. Als MHK-Wert gilt auch hier die niedrigste

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Konzentration des Wirkstoffes in der zweifachen Verdünnungsreihe, die ein sichtbares Bakterienwachstum unterbindet. Wie bei der Agardilution erfolgt auch bei der Bouillondilution durch die Bestimmung des MHK-Wertes eine detaillierte quantitative Beschreibung des Resistenzverhaltens des zu testenden Erregers.

Abbildung 2-3: Resultat eines Mikrodilutionstests zur Bestimmung der in-vitro Empfindlichkeit eines bakteriellen Erregers

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Die Makrodilution (Abb. 2-4) ist eine ausgesprochen zeitaufwendige und arbeitsintensive Methode, bei der jeweils nur ein Wirkstoff in einer Konzentration pro Röhr- chen getestet werden kann. Zudem ist die Makrodilution durch vielfältige individuelle Fehler bei der Herstellung der Verdünnungsreihe zu beeinflussen. Diese Methode wird nur in einzelnen Forschungsprojekten – wenn geeignetere, andere Verfahren nicht zur Verfügung stehen – und für die Testung kleiner Isolatzahlen angewendet.

Abbildung 2-4: Resultat eines Makrodilutionstests zur Bestimmung der in-vitro Empfindlichkeit eines bakteriellen Erregers

Für die Routinediagnostik empfiehlt sich die Mikrodilution, da dieses Verfahren unter Verwendung kommerziell erhältlicher Mikrotiterplatten erfolgt. Diese Mikrotiterplatten haben bereits beim Hersteller eine Qualitätsprüfung durchlaufen und sind problemlos in jedem Labor einzusetzen. Bei einer 96 Kavitäten umfassenden Mikrotiterplatte sind in Abhängigkeit von der Belegung der Mikrotiterplatten und der Anzahl der zu testenden Konzentrationen der betreffenden Wirkstoffe unterschiedliche

16

⁸

⁴

²

¹

^0.5

^0.25

^0.12

^0.06

0.03 - +

Konzentrationen in µg/ml MHK

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Anwendungen vorstellbar. Im Rahmen eines Resistenzmonitorings, das auf einen bestimmten Wirkstoff ausgerichtet ist, werden meist elf verschiedene Konzentrationsstufen des Wirkstoffes inklusive einer Wachstumskontrolle getestet.

In diesem Fall können pro Mikrotiterplatte acht unterschiedliche Bakterienisolate getestet werden. Bei der Empfindlichkeitsprüfung im Rahmen eines Nationalen Resistenzmonitorings sieht die Plattenbelegung meist acht Wirkstoffe in elf oder zwölf Konzentrationen vor, wobei in einem solchen Plattenlayout zwei bis drei Wachstumskontrollen enthalten sein müssen. In diesem Fall, bei dem man einen möglichst detaillierten Überblick über das Resistenzverhalten eines bestimmten Erregers erhalten will, wird pro Mikrotiterplatte nur ein einzelner Erreger getestet.

In der Routinediagnostik sind Mikrotiterplatten häufig so konfiguriert, dass pro Wirkstoff nur wenige Konzentrationsstufen – meist die Konzentrationen, die die Grenzwerte für "empfindlich", "intermediär" und "resistent" einschließen – getestet werden. Sofern für eine bestimmte Anwendung, z.B. Mastitis/Rind, nur vergleichsweise wenige Wirkstoffe zugelassen sind, kann eine entsprechende Mikrotiterplatte auch zweigeteilt sein, sodass zwei Isolate pro Platte getestet werden können.

Bei der Mikrodilution ist die Einhaltung strikter Durchführungsvorschriften unbedingt zu beachten. Kritische Parameter sind auch hier ebenfalls die Inokulumdichte, die Verwendung eines für das Testsystem und den zu testenden Erreger geeigneten Mediums und die Inkubationsbedingungen und –zeiten. Demzufolge handelt es sich auch bei dieser Methode um eine relativ zeit- und arbeitsintensive Methode. Bei einer größeren Anzahl von Proben kann eine automatische Durchführung und Ablesung unter Verwendung von sog. Mikrotiterplatten erfolgen. Dabei ist eine gleichzeitige Prüfung mehrerer Wirkstoffe pro Mikrotiterplatte möglich, wodurch der, insbesondere in der Routinediagnostik relevante, Kostenfaktor positiv beeinflusst wird.

Generell ist festzustellen, dass die Mikrodilution bei ordnungsgemäßer Durchführung ausgesprochen stabile und aussagekräftige quantitative Daten zum Empfindlichkeitsstatus eines bakteriellen Infektionserregers liefert. Die mit dieser Methode erhaltenen Daten sind für den Kliniker von großer Bedeutung, da sie eine bessere Abschätzung des angestrebten Therapieerfolges erlauben. Mit der Kenntnis

(26)

des MHK-Wertes kann der behandelnde Tierarzt schlussfolgern, ob der anzuwendende Wirkstoff geeignet ist, um den betreffenden Infektionserreger am Infektionsort effizient zu bekämpfen.

2.2.5 Korrelation von Ergebnissen aus Agardiffusions- und Bouillondilutionstest Vergleicht man die im Agardiffusionstest ermittelten HHD-Werte mit den im Bouillondilutionstest ermittelten MHK-Werten, so ergibt sich in der Regel eine gewisse Korrelation beider Ergebnisse bei der Testung eines bestimmten Wirkstoffes an einer bestimmten Erregergruppe. Diese Korrelation besagt, dass mit steigenden HHD-Werten die entsprechenden MHK-Werte abnehmen bzw. dass mit abnehmenden HHD-Werten die korrespondierenden MHK-Werte steigen (Abb. 2-5).

Da der Agardiffusionstest ein vergleichsweise billiger und einfacher Test ist, der aber leider nicht die in vielen Fällen erwünschten MHK-Werte liefert, hat es immer wieder Versuche gegeben, die im Agardiffusionstest ermittelten HHD-Werte über lineare Regressionsgleichungen in MHK-Werte umzurechnen. Diese Versuche sind jedoch mit einer erheblichen Fehlerquote behaftet, da Isolate mit gleichem HHD-Wert unterschiedliche MHK-Werte aufweisen können. Umgekehrt können Isolate mit gleichem MHK-Wert auch unterschiedliche HHD-Werte besitzen. Generell ist hierbei zu bedenken, dass die HHD-Werte absolute Werte darstellen, während die MHK- Werte, ermittelt in einer zweifachen Verdünnungsreihe, jeweils einen nach oben immer größer werdenden Bereich an Werten zusammenfassen. Auch wenn eine gewisse Korrelation zwischen der Größe des Hemmhofdurchmessers und der Minimalen Hemmkonzentration (MHK) eines Erregers für einen bestimmten Wirkstoff unbestritten ist, ist es nicht erlaubt, Hemmhofdurchmesser in MHK-Werte umzurechnen. Diesbezüglich kommerziell erhältliche Computerprogramme (D'AMATO et al. 1985) sind strikt abzulehnen. Wenn MHK-Werte erwünscht sind, so sollten sie unter Verwendung entsprechender standardisierter Verfahren (Bouillondilution, E-Test, Agardilution) erarbeitet werden.

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HHD in mm 35

34 3

33 4

32 1 4

31 1 1 3

30 2

29 4 2

28 2

27 1 3

26

25 5

24 empfindlich 1 "minor error" "very major error"

23 22 21

20 1 1

19

18 "minor error" intermediär "minor error"

17 1 1

16

15 1

14 2

13 2

12

"major error" "minor error"

1

resistent

11 2 2

10 3

9 3

8 2 1

≤ 7 4 5

0,12 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64 128

MHK in µg/ml

Abbildung 2-5: Vergleich von HHD-Werten und MHK-Werten für einen fiktiven anti-mikrobiellen Wirkstoff getestet an einem fiktiven Bakterienkollektiv, modifiziert nach TURNIDGE und JORGENSEN (1999)

In Abbildung 2-5 ist ein Vergleich von HHD-Werten und MHK-Werten für einen fiktiven antimikrobiellen Wirkstoff schematisch dargestellt. Die Grenzwerte für diesen Wirkstoff liegen im Agardiffusionstest bei ≤ 16 mm (resistent), 17-20 mm (intermediär) und ≥ 21 mm (empfindlich), während die MHK-Grenzwerte bei ≤ 1 µg/ml (empfindlich), 2-4 µg/ml (intermediär) und ≥ 8 µg/ml (resistent) liegen.

(28)

In diesem Beispiel wurde die überwiegende Mehrzahl der getesteten Isolate mit beiden Testsystemen den gleichen Kategorien zugeordnet. Lediglich je ein im Agardiffusionstest als "intermediär" charakterisiertes Isolat wurde im Bouillondilutionstest als "empfindlich" bzw. "resistent" angegeben. Wenn ein, mit einer der beiden Methoden als "intermediär eingestuftes, Isolat mit der anderen Methode als "empfindlich" oder "resistent" bestimmt wird, so wird diese Diskrepanz in den Ergebnissen beider Testmethoden gemäß TURNIDGE und JORGENSEN (1999) als "minor error" bezeichnet. In diesem Zusammenhang ist festzustellen, dass der MHK-Wert bei der Empfindlichkeitsprüfung als der verlässlichere Wert angesehen wird. Im Rahmen der Routinediagnostik wird jedoch vielfach dem Agardiffusionstest noch der Vorzug gegeben, wodurch dementsprechend die Auswahl der Wirkstoffe auf dem Ergebnis des Agardiffusionstests basiert. Erweist sich ein Isolat in der Agardiffusion als "resistent", während es anhand seines MHK- Wertes als "empfindlich" klassifiziert werden muss, so wird dieser Unterschied als

"major error" bezeichnet. Ein solches Isolat wird fälschlicherweise als "resistent"

angesehen. Aus klinischer Sicht hat dieser Fehler lediglich den Ausschluss eines vermeintlich geeigneten Wirkstoffes aus den therapeutischen Optionen zur Folge.

Problematischer ist, wenn sich ein Isolat im Agardiffusionstest als "empfindlich"

erweist, anhand seines MHK-Wertes jedoch als "resistent" eingestuft wird. Die hierbei beobachtete Diskrepanz in den Ergebnissen beider Tests wird als "very major error" bezeichnet. Dieser größtmögliche Fehler bei der Empfindlichkeitsprüfung hat ernsthafte Konsequenzen für den zu behandelnden Patienten, da nun ein Wirkstoff zum Einsatz kommt, der mit hoher Wahrscheinlichkeit nicht die erhoffte Wirksamkeit zeigt.

2.3 Empfindlichkeitsprüfungen im Rahmen von Monitoringprogrammen Grundvoraussetzungen für die Durchführung von Empfindlichkeitsprüfungen im Rahmen von Monitoringprogrammen sind neben der methodisch korrekten Durchführung und Auswertung der Empfindlichkeitsprüfung gemäß international anerkannter Durchführungsrichtlinien eine einheitliche Speziesdifferenzierung der zu

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untersuchenden Bakterien auf der Basis des aktuellen Kenntnisstandes sowie die Untersuchung einer ausreichend großen Anzahl epidemiologisch unverwandter Isolate der zu testenden Spezies.

2.3.1 Untersuchungsmaterial

Grundsätzlich muss das für eine Empfindlichkeitsprüfung erforderliche Untersuchungsmaterial in statistisch repräsentativer Anzahl zusammengetragen werden. Dadurch werden an die qualitative und quantitative Auswahl sowie an die Dokumentation hohe Anforderungen gestellt. Vor Untersuchungsbeginn ist der Probenumfang mittels statistischer Methoden in Abhängigkeit vom Untersuchungsziel festzulegen. Angaben über den Herkunftsbetrieb (Größe, Management, Hygiene, Struktur), den Medikamenteneinsatz (Prophylaxe, Metaphylaxe, Therapie), die Tierart (Alter, Nutzung), die Probenart (Klinik, Pathologie) sowie die Anamnese (Art und Dauer der Erkrankung, Verlauf) sind wünschenswert und tragen wesentlich zur Charakterisierung des Untersuchungsmaterials bei. Leider sind derartige Hintergrundinformationen bei Untersuchungsmaterial aus der tierärztlichen Praxis in den meisten Fällen nicht oder nur zum Teil verfügbar.

Die Bestimmung der Spezieszugehörigkeit des zu untersuchenden Erregers muss dem aktuellen Wissensstand entsprechen. Sofern für den betreffenden Erreger verfügbar, können kommerziell erhältliche, standardisierte Identifizierungssysteme hierbei eine wertvolle Hilfe sein. Das Vorliegen des zu untersuchenden Erregers in Reinkultur ist eine unabdingbare Voraussetzung für die Durchführung der Empfindlichkeitsprüfung.

2.3.2 Untersuchungsmethode

Zur Durchführung der Empfindlichkeitsprüfung muss, sofern mehrere Labors an dem Monitoringprogramm beteiligt sind, in allen an der Untersuchung beteiligten Labors die gleiche Methodik (Agardiffusionstest, Agar- oder Bouillondilutionstest, E-Test) über den gesamten Zeitraum der Studie zur Anwendung kommen. Die Anwendung

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dieser Methode(n) muss strikt einer einheitlichen, international anerkannten Durchführungsvorschrift folgen. Zum Zweck der Qualitätssicherung müssen in der jeweiligen Durchführungsvorschrift benannte, internationale Referenzstämme in den Versuchen mitgeführt werden. Soll eine neue Methode in einem Labor etabliert werden, so bietet es sich an, dass dieses Labor zunächst an entsprechenden Ringversuchen teilnimmt und so seine Fähigkeit zur akkuraten Durchführung der Empfindlichkeitsprüfung nachweist.

Unabhängig von der Auswahl einer speziellen Untersuchungsmethode müssen folgende Parameter standardisiert werden: Die Verwendung eines geeigneten Nährmediums [Mueller-Hinton (MH), Diagnostic Sensitivity Test (DST) oder spezifische Medien für ausgewählte Erregergruppen], welches weder das Wachstum der zu testenden Erreger noch die Wirkung des zu testenden Wirkstoffes beeinträchtigt, sollte gewährleistet sein. Das Medium muss bei Raumtemperatur einen pH-Wert aufweisen (7,4 ± 0,2), der die Wachstumsgeschwindigkeit der Erreger und die Wirksamkeit der Wirkstoffe weder positiv noch negativ beeinflusst. Weiterhin muss gegebenenfalls eine Supplementierung des verwendeten Mediums mit zweiwertigen Kationen (Ca⁺⁺, Mg⁺⁺) in Betracht gezogen werden. Dieses ist für die Empfindlichkeitsprüfung bestimmter Wirkstoffe (z.B. Aminoglykoside bei Pseudomonas aeruginosa oder Tetracycline bei allen Bakterien) unbedingt erforderlich.

Auf die bei anderen Wirkstoffen ermittelten Ergebnisse der Empfindlichkeitsprüfung hat eine solche Supplementierung keine nachteiligen Einflüsse und sollte daher – sofern in der Durchführungsvorschrift festgelegt – generell verwendet werden. Die Bebrütungstemperatur des Untersuchungsmaterials sollte zwischen 30°C und 37°C liegen, damit es zu keiner Beeinträchtigung des Erregerwachstums und der Wirkung des zu untersuchenden antimikrobiellen Wirkstoffes kommt. Die Inokulumdichte orientiert sich am Trübungsgrad des sogenannten McFarland- Standards. Dabei sind detaillierte Anweisungen hinsichtlich des zu verwendenden Inokulums aus den verschiedenen Durchführungsvorschriften zu entnehmen. Eine Überprüfung der korrekten Inokulumdichte durch Auszählen entsprechender Bakterienverdünnungen ist in gewissen zeitlichen Abständen unbedingt erforderlich.

Die meisten Angaben hinsichtlich der Atmosphäre beziehen sich auf die Empfindlichkeitsprüfung unter aeroben Bedingungen. Bei der Untersuchung von mikroaerophilen oder anaeroben Erregern sind besondere Bedingungen, wie

(31)

beispielsweise der Einsatz von speziellen Nährmedien (Wilkens-Chalgren-Agar) sowie die Verwendung geeigneter Behältnisse (Anaerobiertöpfe) und Zusätze zum Erreichen standardisierter atmosphärischer Bedingungen (GasPacks) zu beachten.

Zur Qualitätskontrolle von Nährmedien und antimikrobiellen Wirkstoffen werden internationale Referenzstämme eingesetzt, deren Verhalten gegenüber den verschiedenen Wirkstoffen in den unterschiedlichen Testsystemen bekannt ist. Diese Referenzstämme sind in Deutschland von der Deutschen Stammsammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) zu beziehen.

Für die Durchführung der Empfindlichkeitsprüfungen von aeroben, schnell wachsenden Erregern werden in der DIN 58940 folgende Referenzstämme empfohlen:

- Escherichia coli ATCC 25922

- Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 - Staphylococcus aureus ATCC 29312 - Staphylococcus aureus ATCC 25923 - Enterococcus faecalis ATCC 29212

In den Empfehlungen der NCCLS wird zusätzlich zu den oben aufgeführten Referenzstämmen die Verwendung folgender Referenzstämme empfohlen:

- Escherichia coli ATCC 35218

- Enterococcus faecalis ATCC 33186

- Actinobacillus pleuropneumoniae ATCC 27090 - Haemophilus somnus ATCC 700025

(32)

2.3.3 Nationale Resistenzmonitoringprogramme in der EU

Ein gutes Beispiel für die Problematik der Vergleichbarkeit von Ergebnissen, die in unterschiedlichen Laboren unter Verwendung unterschiedlicher Methodiken, basierend auf unterschiedlichen Durchführungsvorschriften, erarbeitet wurden, zeigt eine Analyse der nationalen Resistenzmonitoringprogramme in den EU- Mitgliedstaaten Belgien, Dänemark, Deutschland, Frankreich, Großbritannien, Irland, Italien, Niederlande, Österreich, Portugal, Spanien und Schweden aus dem Jahr 1997 (GNANOU 1998).

Die Durchführung und Auswertung der Empfindlichkeitsprüfung erfolgte innerhalb der verschiedenen Länder nach unterschiedlichen Durchführungsrichtlinien (Tabelle 2-1). In den meisten EU-Mitgliedstaaten kam 1997 der Agardiffusionstest zum Einsatz. Zum Teil führten jedoch einige Länder wie Dänemark, Niederlande, Spanien und Portugal zusätzlich das Mikrodilutionsverfahren durch. Lediglich in Schweden erfolgte die Resistenzbestimmung ausschließlich mittels Mikrodilution. Die Ergebnisse wurden größtenteils nur als Kategorie "empfindlich“ (E), "intermediär“ (I) oder "resistent“ (R) angegeben. In Abhängigkeit von der Methodik erfolgte bei der Mikrodilution gegebenenfalls die Angabe des MHK-Wertes in µg/ml beziehungsweise bei der Agardiffusion die Angabe des HHD-Wertes in mm (Tabelle 2-4). Weiterhin wurden zur Qualitätskontrolle in den unterschiedlichen Monitoringprogrammen auch eine Vielzahl unterschiedlicher Referenzstämme eingesetzt.

Die in den nationalen Monitoringprogrammen untersuchten Erregergruppen umfas- sen (a) Zoonoseerreger, (b) Indikatorbakterien und (c) veterinärmedizinisch relevante Erreger. Welche Bakterien in den verschiedenen EU-Mitgliedstaaten als Zoonose- erreger, Indikatorbakterien oder veterinärmedizinisch relevante Bakterien getestet werden und wieviele Wirkstoffe für die Empfindlichkeitsprüfung dieser Bakterien zum Einsatz kommen ist in Tabelle 2-2 dargestellt. Eine detaillierte Liste der jeweils getesteten Wirkstoffe findet sich bei GNANOU (1998). Interessanterweise traten zum Teil erhebliche Diskrepanzen bezüglich der Definition der Erreger zwischen den verschiedenen Ländern auf. Beispielsweise wurden innerhalb der "Staphylokokken“ in Großbritannien und Frankreich ausschließlich bovine S. aureus-Isolate getestet. In Deutschland, Dänemark und Portugal erfolgte eine Differenzierung der "Staphylo-

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kokken“ lebensmittelliefernder Tiere in S. aureus, S. hyicus und koagulasenegative Staphylokokken. In den Niederlanden wurden lediglich porcine S. hyicus- und bovine S. aureus-Isolate untersucht und in Österreich lediglich S. aureus-Isolate und Staphylococcus ssp. aus Milchproben. Ähnliche Unterschiede bei der Klassifizierung der Erreger bestanden auch für Bakterien der Gattungen Salmonella, Campylobac- ter, Streptococcus, Pasteurella und Escherichia.

Tabelle 2-1: Übersicht über die zur Empfindlichkeitsprüfung in den verschiedenen nationalen Monitoringprogrammen verwendeten Methoden

Land Methode Auswertung nach Angabe des

Ergebnisses

Belgien Agardiffusion CA-SFM ¹ S / I / R

Dänemark Agardiffusion

Mikrodilution NCCLS S / I / R; HHD-Werte S / I / R; MHK-Werte Deutschland Agardiffusion DIN 58940 S / I / R

Frankreich Agardiffusion CA-SFM S / I / R

Großbritannien Agardiffusion BSAC ² S / R

Irland Agardiffusion Methode nach Stokes S / I / R Italien Agardiffusion

Mikrodilution NCCLS S / I / R

Niederlande Agardiffusion

Mikrodilution NCCLS S / I / R

Österreich Agardiffusion DIN 58940 S / I / R Portugal Agardiffusion

Mikrodilution keine Angaben S / I / R Schweden Mikrodilution

Empfehlungen der Swedish Reference

Group S / I / R; MHK-Werte Spanien Agardiffusion

Mikrodilution NCCLS S / I / R; HHD-Werte S / I / R; MHK-Werte

1 CA-SFM (Comité de l'antibiogramme de la societé française de microbiologie)

2 BSAC (British society for antimicrobial chemotherapy)

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LITERATURÜBERSICHT24

Tabelle 2-2:Übersicht über die in den nationalen Monitoringprogrammen getesteten Bakterien und die Anzahl der beidiesen Bakterien untersuchten Wirkstoffe

ZoonoseerregerIndikatorbakterienVeterinärmedizinisch relevante Erreger

Salmo-nella Campylo-bacter E. coli Entero-coccus Staphylo-coccus Strepto-coccus Pasteu-rella Actino-bacillus YersiniaBordetellaKlebsiella

1114k. A.k. A.k. A.

ark17 B16 B16 B25 B26 B19k. A.chland37163727373637reich275999roßbritannien161288

12151

lande5957/6 C810/5 D555sterreich938/11 A6

tugal181824267k. A.

hweden10

17

A 8 Wirkstoffe bei enteropathogenen E. coli Isolaten von Schweinen, 11 Wirkstoffe bei E. coli-Isolaten vom Geflügel; B bei Isolaten vonlebensmittelliefernden Tieren, C 7 Wirkstoffe bei S. aureus boviner Herkunft, 6 Wirkstoffe bei S. hyicus porciner Herkunft; D 10 Wirkstoffe beiIsolaten von Kälbern, 5 Wirkstoffe bei Isolaten von Ferkeln; k.A.: keine Angaben; leeres Kästchen: diese Bakterien wurden im Rahmen desnationalen Monitoringprogrammes des betreffenden Landes nicht untersucht.

(35)

Generell ist bei dieser Übersicht festzustellen, dass die in den verschiedenen Monitoringprogrammen erarbeiteten Ergebnisse kaum miteinander vergleichbar sind.

Lediglich die an gleichermaßen definierten Bakterien, mit der gleichen Methodik erarbeiteten und unter Verwendung der gleichen Grenzwerte ausgewerteten Ergebnisse sind miteinander vergleichbar.

2.4 Festlegung von Grenzwerten

Zur Einordnung der untersuchten Bakterien anhand ihrer HHD-Werte und/oder MHK- Werte in die Kategorien "empfindlich“, "intermediär“ oder "resistent“ sind verlässliche Grenzwerte ("breakpoints") erforderlich. Bei den Grenzwerten handelt es sich nicht um direkt messbare und nachweisbare Werte (BÖTTNER et al. 2000). Grenzwerte werden aus den Ergebnissen aufwendiger Untersuchungen abgeleitet. Hierbei ist zu beachten, dass die für einen bestimmten Wirkstoff ermittelten Grenzwerte jedoch nur für das originäre pharmazeutische Produkt im zugelassenen Dosierungs- und Applikationsschema für spezielle Indikationen, Tierarten und zum Teil auch Erregergruppen gelten. Aufgrund der insbesondere für "alte" Wirkstoffe wenig aussagekräftigen oder zum Teil auch fehlenden Daten aus der Veterinärmedizin erfolgt die Klassifizierungen bakterieller Erreger animaler Herkunft im Rahmen von Empfindlichkeitsprüfungen häufig anhand humanmedizinischer Grenzwerte. Da jedoch wesentliche Unterschiede hinsichtlich des Erregerspektrums sowie der Verteilung und Verstoffwechselung der Wirkstoffe zwischen Mensch und den verschiedenen Tierarten bestehen, ist eine Übertragung von Grenzwerten vom Mensch auf eine beliebige Tierart wissenschaftlich nicht vertretbar (BÖTTNER et al.

2000).

Für jeden antimikrobiellen Wirkstoff existieren prinzipiell mindestens zwei klinisch relevante Grenzwerte: der Empfindlichkeitsgrenzwert (Sensitivitätsgrenzwert, Rs) und der Unempfindlichkeitsgrenzwert (Resistenzgrenzwert, Rr) (BÖTTNER et al.

2000). Zwischen beiden befindet sich bei manchen Wirkstoffen eine Pufferzone, die die Kategorie "intermediär" repräsentiert.

(36)

Als "intermediär" klassifizierte Erreger können mit der vorgegebenen Dosierung des jeweiligen Wirkstoffes nicht sicher erfasst werden. Eine höhere Dosierung des Wirk- stoffes ist im veterinärmedizinischen Bereich, vor allem im Rahmen der Anwendung bei lebensmittelliefernden Tieren, aufgrund der Verlängerung der Wartezeit proble- matisch. Für die Therapie sollten daher nur Wirkstoffe empfohlen werden, gegen- über denen der zu bekämpfende Erreger als eindeutig "empfindlich" getestet wurde.

Für die Grenzwertfestlegung in der Veterinärmedizin existieren seit 1999 von der NCCLS Leitlinien zur Festlegung von Grenzwerten (NCCLS, M37-A, 1999; M37-A2, 2002). Zur Ableitung von Grenzwerten sind folgende Daten erforderlich (DIN 58940 und NCCLS Dokument M37-A2):

- allgemeine Angaben des zu untersuchenden antimikrobiellen Wirkstoffes, die Darreichungsform, Dosis, Dosierungsintervall und Indikation beinhalten;

- chemische und physikalische Daten des Wirkstoffes, wobei die Daten zur chemischen Struktur, Löslichkeit und Stabilität des Wirkstoffes unabdingbar sind;

- Daten zur Pharmakokinetik und Bioverfügbarkeit, wobei für die angegebene Do- sis und Dosierungsintervalle für jede einzelne Tierart Angaben über den Blut- /Plasmaspiegel (Cmax, Tmax, T0,5), das Verteilungsvolumen (Vd) und die Wirkstoff- gehalte in den Körperflüssigkeiten, Organen und Geweben gemacht werden müssen. Dieses gilt weiterhin für alle galenischen Zubereitungen des Wirkstoffes, da hinsichtlich Absorption, Verteilung, Metabolisierung und Ausscheidung erhebliche tierart- und formulierungsspezifische Unterschiede bestehen. Unterschiede in der Pharmakokinetik und deren Einfluss auf eine Grenzwertfestlegung wurden 1994 von WATTS und YANCEY ausführlich beschrieben;

- mikrobiologische Daten, die Angaben zur Minimalen Hemmkonzentration, zur Bakterizidie und zum Resistenzverhalten (Kreuz- oder Parallelresistenz) beinhalten, werden ebenso für eine Grenzwertfestlegung benötigt. Klinische Isolate müssen repräsentativ für die jeweilige Erkrankung sein und in ausreichend gro- ßer Anzahl (300 Isolate nach DIN und NCCLS) vorliegen. Angaben zur klinischen Prüfung können nur von einer ausreichend großen Anzahl bakteriologischer Pro- ben von Tieren vor und nach der Therapie erfolgen. Dabei sind Daten über die Erreger auf Speziesebene, bakteriologische Heilung (Erregerelimination) und klinische Heilung zu erheben.

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Während die in den Vorschriften von DIN, CA-SFM und BSAC befindlichen Grenzwerte ausschließlich auf Daten aus der Humanmedizin basieren, finden sich im NCCLS Dokument M31-A2 (2002) veterinärspezifische Grenzwerte für zumindest einige in der Veterinärmedizin verwendete Wirkstoffe (Tabelle 2-3). Die Grenzwerte für nicht in Tabelle 2-3 aufgelistete, aber im NCCLS Dokument M31-A2 (2002) befindliche Wirkstoffe (z.B. Ampicillin, Erythromycin, Tetracyclin) basieren ebenfalls auf Daten aus der Humanmedizin.

Tabelle 2-3: Darstellung der veterinärspezifischen Grenzwerte gemäß NCCLS Dokument M31-A2

Wirkstoff Tier-

art * HHD-Werte (mm) MHK-Werte (µg/ml)

empfindlich intermediär resistent empfindlich intermediär resistent

Spectinomycin R ≥ 14 11-13 ≤ 10 ≤ 32 64 ≥ 128

Penicillin/

Novobiocin

R ≥ 18 15-17 ≤ 14 ≤ 1/2 2/4 ≥ 4/8

Ceftiofur R/S ≥ 21 18-20 ≤ 17 ≤ 2 4 ≥ 8

Enrofloxacin H/K ≥ 23 17-22 ≤ 16 ≤ 0.5 1-2 ≥ 4

G ≥ 23 17-22 ≤ 16 ≤ 0.25 0.5-1 ≥ 2

R ≥ 21 17-20 ≤ 16 ≤ 0.25 0.5-1 ≥ 2

Difloxacin ≥ 21 18-20 ≤ 17 ≤ 0.5 1-2 ≥ 4

Orbifloxacin H/K ≥ 23 18-22 ≤ 17 ≤ 1 2-4 ≥ 8

Clindamycin H ≥ 21 15-20 ≤ 14 ≤ 0.5 1-2 ≥ 4

Pirlimycin R ≥ 13 - ≤ 12 ≤ 2 - ≥ 4

Tilmicosin R ≥ 14 11-13 ≤ 10 ≤ 8 16 ≥ 32

S ≥ 11 - ≤ 10 ≤ 16 - ≥ 32

Florfenicol R ≥ 19 15-18 ≤ 14 ≤ 2 4 ≥ 8

Tiamulin S ≥ 9 - ≤ 8 ≤ 16 - ≥ 32

* G (Geflügel), H (Hund), K (Katze), R (Rind), S (Schwein)

(38)

Tabelle 2-4: Zielorganismen und Indikationen für die Anwendung bestimmter Wirkstoffe bei Tieren

Wirkstoff Zielorganismen Indikation

Spectinomycin Mannheimia haemolytica, Pasteurella multocida, Haemophilus somnus

Atemwegsinfektionen beim Rind

Penicillin/

Novobiocin

Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae,

Streptococcus uberis

Mastitis beim Rind

Ceftiofur Mannheimia haemolytica, Pasteurella multocida, Haemophilus somnus

Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida, Salmonella

Choleraesuis

Atemwegsinfektionen beim Schwein

Enrofloxacin Gramnegative Bakterien des Intestinal- traktes, Staphylococcus spp. und andere

empfindliche Organismen

Hauterkrankungen und Harnwegsinfektionen bei

Hund/Katze

Pasteurella multocida, Escherichia coli Infektionen bei Huhn/Pute Mannheimia haemolytica, Pasteurella

multocida, Haemophilus somnus

Orbifloxacin Gramnegative Bakterien des Intestinaltraktes, Staphylococcus spp.

und andere empfindliche Organismen

Hauterkrankungen und Harnwegsinfektionen bei

Hund/Katze

Clindamycin Staphylococcus spp. Hauterkrankungen und

Weichteilinfektionen beim Hund

Pirlimycin Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae,

Streptococcus uberis

Mastitis beim Rind

Tilmicosin Mannheimia haemolytica Atemwegsinfektionen beim Rind

Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida

Atemwegsinfektionen beim Schwein

Florfenicol Mannheimia haemolytica, Pasteurella multocida, Haemophilus somnus

Tiamulin Actinobacillus pleuropneumoniae Atemwegsinfektionen beim Schwein

(39)

Die meisten veterinärspezifischen Grenzwerte wurden nur für eine bestimmte kleine Gruppe von hauptsächlich mit dem betreffenden Wirkstoff zu bekämpfenden Bakte- rien erarbeitet. Dementsprechend gelten diese Grenzwerte ausschließlich für die jeweiligen Zielorganismen und können nicht beliebig auf andere Bakteriengruppen übertragen werden. In Tabelle 2-4 sind die Wirkstoffe mit ihren Zielorganismen und Indikationen – sofern im NCCLS Dokument M31-A2 angegeben – aufgelistet.

Weiterhin ist festzustellen, dass die in Tabelle 2-3 dargestellten Grenzwerte für den Agardiffusionstest nur für eine festgelegte Beschickung der Plättchen Gültigkeit besitzen. Diese Beschickungen betragen 100 µg für Spectinomycin, 10 Units/30 µg für Penicillin/Novobiocin, je 30 µg für Ceftiofur, Florfenicol und Tiamulin, 15 µg für Tilmicosin, je 10 µg für Difloxacin und Orbifloxacin, 5 µg für Enrofloxacin und je 2 µg für Clindamycin und Pirlimycin. Plättchen, die eine von diesen Werten abweichende Beschickung mit den jeweiligen Wirkstoffen aufweisen, können nicht für in-vitro Empfindlichkeitsprüfungen anhand der in Tabelle 2-3 aufgelisteten Grenzwerte verwendet werden.

Eine Verwendung dieser veterinärspezifischen NCCLS-Grenzwerte zur Bewertung von MHK- und HHD-Werten, die anhand der DIN-Empfehlungen oder anderer Durchführungsvorschriften erarbeitet wurden, wird aufgrund signifikanter methodischer Unterschiede bei den in-vitro Empfindlichkeitsprüfungen nicht empfohlen. Sofern Institutionen in unterschiedlichen Ländern im Rahmen eines gemeinsamen Monitoringprogrammes tätig sind, ist unbedingt eine in allen Labors gleichermaßen zu verwendende, international anerkannte Methodik festzulegen.

2.5 Taxonomische Einordnung der Genera Pasteurella, Mannheimia, Bordetella, Actinobacillus und Streptococcus

Anfänglich wurden die Gattungen Pasteurella, Actinobacillus und Haemophilus zu der Familie Pasteurellaceae zusammengefasst.

Diese Gruppe gramnegativer Bakterien ist auf den Schleimhäuten von Menschen und Tieren zu finden.