Vergleichende Analyse der In-vitro-Empfindlichkeit Gram-positiver Erreger boviner Mastitiden
gegenüber Tylosin mittels Bouillon-Mikrodilution und Agardiffusion
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von
Monika Entorf, geb. Buß Lüdenscheid
Hannover 2016
Friedrich-Loeffler-Institut Mariensee
1. Gutachter: Prof. Dr. Stefan Schwarz Institut für Nutztiergenetik
Friedrich-Loeffler-Institut Mariensee
2. Gutachter: Prof. Dr. Martin Ganter
Klinik für kleine Klauentiere und Forensische Medizin und Ambulatorische Klinik
Tierärztliche Hochschule Hannover
Tag der mündlichen Prüfung: 13.05.2016
„
Die Hummel hat eine Flügelfläche von 0,7 Quadratzentimeter, bei 1,2 Gramm Gewicht. Nach den bekannten Gesetzen der Aerodynamik ist es
unmöglich, bei diesen Verhältnissen zu fliegen.
Die Hummel weiß das nicht. Sie fliegt einfach.“
Arthur Lassen (*1939 - †2000) (deutscher Motivations- und Erfolgstrainer)
Veröffentlichungen 7
Poster und Vorträge 8
Abkürzungsverzeichnis 10
1. Einleitung 13
1.1. Tylosin 14
1.2. Makrolid-Antibiotika 15
1.2.1. Struktur und Ursprung 15
1.2.2. Wirkungsweise 15
1.2.3. Resistenzen gegen Makrolide 16
1.3. Mastitis 19
1.3.1. Definition Mastitis 19
1.3.2. Ökonomie der Mastitis 21
1.3.3. Einteilung und Vorkommen von Mastitiserregern 22
1.3.4. Mastitisdiagnostik 24
1.3.4.1. Milchprobengewinnung 24
1.3.4.2. Ätiologischer Nachweis 25
1.3.4.3. Keimdifferenzierung 27
1.4. Antibiotika-Empfindlichkeitsprüfung 29
1.4.1. Methoden der Antibiotika-Empfindlichkeitsprüfung 30
1.4.2. Qualitätskontrolle 32
1.4.3. Klinische Grenzwerte 33
1.4.4. Interpretation der ermittelten Daten 34
1.5. Ziele der Arbeit 36
3. Tylosin susceptibility of staphylococci from bovine mastitis. (Manuskript 2)
43
4. Comparative erythromycin and tylosin susceptibility
testing of streptococci from bovine mastitis. (Manuskript 3) 51
5. Zusammenfassung der Ergebnisse und übergreifende Diskussion
59
5.1. Ermittlung von Qualitätskontrollbereichen für die Testung von mit 30 µg beladenen Tylosin-Testplättchen mittels
Agardiffusionstest
60
5.2. Vergleichende Untersuchung der Empfindlichkeit gegenüber Tylosin mittels Agardiffusion und Bouillon-Mikrodilution
62
5.2.1. Verteilung von MHK- und HHD-Werten 63
5.2.2. Erythromycin-resistente Isolate 65
5.2.3. Fehlerrate 66
5.2.4. MHK50- und MHK90-Werte 66
5.3. Molekulare Untersuchungen zum Vorliegen von Makrolid- Resistenzgenen
67
5.3.1. Nachgewiesene Resistenzgene 68
5.3.2. Ergebnisse des Induktionstests 68
5.4. Schlussfolgerungen 69
6. Zusammenfassung 71
7. Summary 75
8. Literaturverzeichnis 79
9. Abbildungen und Tabellen 90
10. Danksagung 91
BUß, M.*, A. T. FEßLER*, J. TURNIDGE, T. PETERS and S. SCHWARZ (2014):
Quality control ranges for tylosin 30 µg and 15 µg discs applicable to Staphylococcus aureus ATCC® 25923.
J. Antimicrob. Chemother. 69, 277 - 280
* These authors contributed equally to this study
ENTORF, M., A. T. FEßLER, K. KADLEC, H. KASPAR, J. MANKERTZ, T. PETERS and S. SCHWARZ (2014):
Tylosin susceptibility of staphylococci from bovine mastitis.
Vet. Microbiol. 171, 368 - 373
ENTORF, M., A. T. FEßLER, H. KASPAR, K. KADLEC, T. PETERS and S.
SCHWARZ (2015):
Comparative erythromycin and tylosin susceptibility testing of streptococci from bovine mastitis.
Vet. Microbiol., in press doi:10.1016/j.vetmic.2015.12.003
Development of tylosin interpretive criteria for bovine mastitis pathogens (Poster).
1st Junior Scientist-Symposium FLI, 10.08. - 11.08.2012, Vilm, Deutschland
BUß, M., A. T. FEßLER*, K. KADLEC, T. PETERS u. S. SCHWARZ (2012):
Comparative analysis of tylosin minimum inhibitory concentrations and zone
diameters of bovine staphylococcal isolates (Poster).
International Symposium on Staphylococci and Staphylococcal Infections, 26. 08. - 30.08.2012, Lyon, France
BUß, M., J. TURNIDGE, A. T. FEßLER, T. PETERS u. S. SCHWARZ* (2013):
Development of tylosin 15 and 30 µg quality control ranges for S. aureus ATCC®
25923 (Vortrag).
VAST-CLSI Meeting, 21.06.2013, Baltimore, USA
BUß, M., A. T. FEßLER*, J. TURNIDGE, T. PETERS u. S. SCHWARZ (2013):
Proposal for quality control ranges of Staphylococcus aureus ATCC® 25923 for agar disk diffusion using 15 µg and 30 µg tylosin disks (Poster).
5th Symposium on Antimicrobial Resistance in Animals and the Environment (ARAE), 30.06. - 03.07.2013, Gent, Belgien
BUß, M., A. T. FEßLER*, K. KADLEC, H. KASPAR, J. MANKERTZ, T. PETERS u. S.
SCHWARZ (2013):
Tylosin susceptibility testing of staphylococci from bovine mastitis (Poster).
5th Symposium on Antimicrobial Resistance in Animals and the Environment (ARAE), 30.06. - 03.07.2013, Gent, Belgien
BUß, M., J. TURNIDGE, A. T. FEßLER*, T. PETERS u. S. SCHWARZ (2013):
Proposal for quality control ranges of Staphylococcus aureus ATCC® 25923 for agar disk diffusion using 15 µg and 30 µg tylosin disks (Vortrag).
2nd Junior Scientist-Symposium FLI, 21.08. - 24.08.2013, Jena, Deutschland
BUß, M., A. T. FEßLER*, J. TURNIDGE, T. PETERS u. S. SCHWARZ (2013):
Proposal for quality control ranges of Staphylococcus aureus ATCC® 25923 for agar disk diffusion using 30 µg tylosin disks (Poster).
3rd ASM-ESCMID Conference on Methicillin-resistant Staphylococci in Animals:
Veterinary and Public Health Implications, 04.11. - 07.11.2013, Kopenhagen, Dänemark
Hemmkonzentrationen bei Staphylokokken-Isolaten aus Boviner Mastitis (Poster).
4. Jahrestagung der DVG-Fachgruppe Deutsche buiatrische Gesellschaft, 7.11. - 9.11.2013, Berlin, Deutschland
ENTORF, M., A. T. FEßLER*, J. TURNIDGE, T. PETERS u. S. SCHWARZ (2014):
Quality control (QC) criteria for susceptibility testing using cefoperazone and tylosin 30 µg disks (Poster).
Tagung der DVG-Fachgruppe “Bakteriologie und Mykologie”, 26.05. - 28.05.2014, Freising, Deutschland
ENTORF, M., A. T. FEßLER*, H. KASPAR, K. KADLEC, T. PETERS, J. MANKERTZ u. S. SCHWARZ (2014):
Tylosinresistenz bei Staphylokokken und Streptokokken aus Fällen boviner Mastitis (Vortrag).
Tagung der DVG-Fachgruppe “Bakteriologie und Mykologie”, 26.05. - 28.05.2014, Freising, Deutschland
ENTORF, M.*, A. T. FEßLER, H. KASPAR, K. KADLEC, T. PETERS, J. MANKERTZ u. S. SCHWARZ (2014):
Phenotypic and genotypic analysis of tylosin resistance among staphylococci and streptococci from cases of bovine mastitis (Vortrag).
3rd Junior Scientist-Symposium FLI, 19.08. - 22.08.2014, Mariensee, Deutschland ENTORF, M., A. T. FEßLER*, K. KADLEC, H. KASPAR, T. PETERS u. S.
SCHWARZ (2015):
Tylosin susceptibility testing of streptococci from cases of bovine mastitis (Vortrag).
6th Symposium on Antimicrobial Resistance in Animals and the Environment (ARAE), 29.06. - 01.07.2015, Tours, France
* präsentierender Autor
ATCC American Type Culture Collection ATP Adenosintriphosphat
AVID Arbeitskreis für Veterinärmedizinische Infektionsdiagnostik der DVG
CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute CoNS coagulase-negative staphylococci
ECOFF Epidemiologische Cut-Off-Werte
E. Escherichia
erm erythromycin ribosome methylase
HHD Hemmhofdurchmesser
KNS Koagulase-negative Staphylokokken
MBFG Milchtierherden-Betreuungs- und Forschungsgesellschaft mbH
mef macrolide efflux
MFS Major Facilitator Superfamily MHK Minimale Hemmkonzentration MIC Minimal inhibitory concentration
ml Milliliter
MLP Milchleistungsprüfung
mm Millimeter
NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards
OD optische Dichte
RNA Ribonukleinsäure
mRNA messenger RNA
rRNA ribosomale RNA
S. Staphylococcus oder Streptococcus spp. Spezies (Pl.)
T. Trueperella
TGD Tiergesundheitsdienst UV-Licht ultraviolettes Licht
VAST Veterinary Antimicrobial Susceptibility Testing
µg Mikrogramm
µl Mikroliter
13
Kapitel 1
Einleitung
14
Die Mastitis des Rindes ist eine der wirtschaftlich bedeutendsten Erkrankungen in der Nutztierhaltung. Zur Therapie von Mastitiden werden in großem Umfang Antibiotika auf Einzeltierebene eingesetzt. Einen häufigen Einsatz in der Mastitistherapie findet der antimikrobielle Wirkstoff Tylosin. Für die Auswahl eines geeigneten Antibiotikums sind die Ermittlung des ursächlichen Erregers und dessen Empfindlichkeit gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen von Bedeutung. Für die Auswertung der bei der In-vitro-Empfindlichkeitsprüfung erhaltenen Daten werden klinische Grenzwerte für die entsprechende Indikation bei der entsprechenden Tierart benötigt. Für viele antimikrobielle Wirkstoffe, wie auch Tylosin, gibt es aber bisher keine veterinärspezifischen klinischen Grenzwerte. Auch für die Überprüfung der korrekten Durchführung der Antibiotika-Empfindlichkeitstestung fehlen zum Teil anerkannte Qualitätskontrollbereiche für die entsprechenden Qualitätskontroll- stämme.
1.1. Tylosin
Tylosin ist ein seit 1961 bekanntes, natürlich vorkommendes Antibiotikum, welches von dem Bakterium Streptomyces fradiae produziert wird (LOHDE et al. 1998). Als bakteriostatisch wirkendes Antibiotikum hat es eine wachstumshemmende Wirkung auf gegenüber Tylosin empfindliche Bakterien. Tylosin wird ausschließlich in der Veterinärmedizin zur Behandlung bakteriell bedingter Infektionen eingesetzt, die durch Gram-positive Bakterien, Mykoplasmen oder Spirochaeten verursacht werden.
Es ist unwirksam gegenüber Gram-negativen Bakterien wie zum Beispiel Escherichia coli (E. coli) (VETIDATA 2016). Laut VETIDATA ist Tylosin unter anderem für die Behandlung von Dysenterie, Rotlauf und der Enzootischen Pneumonie der Schweine, zur Therapie von Bronchitis und Bronchopneumonien bei Hunden und zur Behandlung von Pneumonien und Arthritiden von Kälbern zugelassen (VETIDATA 2016). Ein weiteres wichtiges Einsatzgebiet ist außerdem die Therapie von Euterentzündungen, da sich Tylosin aufgrund seiner Pharmakokinetik gut in der Milch bzw. im Euter anreichert (ZIV u. SULMAN 1973; EL-SAYED et al. 1986;
15
VETIDATA 2016). Die in der Milch ermittelten Konzentrationen sind bis zu fünfmal höher als die im Plasma gemessenen Konzentrationen (AVCI u. ELMAS 2014).
1.2. Makrolid-Antibiotika 1.2.1. Struktur und Ursprung
Tylosin wird der antimikrobiellen Wirkstoffklasse der Makrolide zugeordnet. Makrolide sind Antibiotika, die einen zentralen Laktonring aufweisen. Dieser kann durch eine unterschiedliche Anzahl von Kohlenstoffatomen 14-, 15- oder 16-gliedrig sein.
Tylosin besitzt einen 16-gliedrigen Laktonring. Der Laktonring der Makrolid- Antibiotika ist über glykosidische Bindungen mit Neutral- oder Aminozuckern verbunden. Durch diese Zucker sind Makrolide basisch und daher im sauren Milieu instabil. Makrolide sind sehr lipophil. Die Makrolid-Antibiotika werden anhand ihres Laktonrings in drei Gruppen eingeteilt. Typische Vertreter der 14-gliedrigen Makrolide sind Erythromycin und Clarithromycin, bei Azithromycin handelt es sich um ein 15- gliedriges Makrolid und zu den 16-gliedrigen Makroliden gehören Tildipirosin, Tilmicosin, Spiramycin und Tylosin. (KROKER 2006; KROKER et al. 2007; LODE et al. 1998).
Die ersten Makrolid-Antibiotika wurden aus den Kulturüberständen von verschiedenen Streptomyces-Arten gewonnen. Heute gibt es natürliche, halb- und vollsynthetisch hergestellte Makrolide. Das älteste und bekannteste Makrolid- Antibiotikum ist das 14-gliedrige Erythromycin (KROKER 2006; KROKER et al. 2007;
LODE et al. 1998).
1.2.2. Wirkungsweise
Makrolide wirken bakteriostatisch und zeitabhängig, das heißt sie verhindern die Vermehrung der Bakterien, töten diese aber nicht primär ab. Sofern die Bakteriostase über längere Zeit anhält, kann es jedoch auch zum Absterben der
16
Bakterien kommen. Die Elimination der Bakterien muss dann durch das körpereigene Immunsystem erfolgen. Die Makrolid-Antibiotika wirken, indem sie die Proteinsynthese der Bakterien stören. Sie binden dabei reversibel an die 50S- Untereinheit der bakteriellen 70S-Ribosomen. Die Bindung setzt am Peptidyl- Transferase-Zentrum an und blockiert so die Translokation des Ribosoms und damit die Polypeptidverlängerung, so dass nicht-funktionelle Polypeptid-Zwischenstufen entstehen (LODE et al. 1998; KROKER 2006; KROKER et al. 2007).
1.2.3. Resistenzen gegen Makrolide
Der Begriff der antimikrobiellen Resistenz beschreibt eine Unempfindlichkeit von Bakterien gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen. Die Ausprägung der Unempfindlichkeit ist abhängig von dem einzelnen Wirkstoff, den untersuchten Bakterien und dem bei diesen Bakterien vorhandenen Resistenzmechanismen. Es wird zwischen einer natürlichen oder intrinsischen Resistenz und einer erworbenen Resistenz unterschieden. Eine intrinsische Resistenz beruht auf einer, stets bei allen Vertretern einer Bakterienart oder Gattung vorhandenen, genetisch bedingten Unempfindlichkeit gegen ein bestimmtes Antibiotikum bzw. gegen eine Klasse von Antibiotika. In diesem Fall fehlt entweder die Angriffsstelle, die das Antibiotikum benötigt oder das Antibiotikum kann die Angriffstelle nicht erreichen. Makrolide können zum Beispiel an die von den Zellmembranen befreiten Ribosomen von E. coli binden und ihre Wirkung entfalten. In das intakte Bakterium können sie aber aufgrund des Aufbaus der äußeren Zellmembran nur schwerlich eindringen. Zudem verfügen die meisten Gram-negativen Bakterien, wie auch E. coli, über Ausschleusungssysteme, die in die Bakterienzelle eingedrungenen Makrolidmoleküle wieder aus der Bakterienzelle transportieren. Eine erworbene Resistenz beruht entweder auf der Ausbildung von Mutationen oder dem Erwerb von Resistenzgenen.
Resistenzen durch Mutationen treten primär, das bedeutet ohne antibiotischen Einfluss, oder sekundär im Zuge einer Behandlung mit entsprechenden Wirkstoffen auf. Dabei unterscheidet man zwischen den schnellen Einschritt-Mutationen und den sich langsamer entwickelnden Mehrschritt-Mutationen. Resistenzvermittelnde
17
Mutationen können nur vertikal durch Zellteilung der mutierten Bakterien weitergegeben werden. Resistenzgene können hingegen auch horizontal zwischen Bakterien übertragen werden, wenn sie auf mobilen genetischen Elementen wie Plasmiden, Transposons oder Genkassetten lokalisiert sind. Dies ermöglicht eine rasche Ausbreitung der Resistenzgene. Die vermittelten Resistenzen betreffen entweder nur einzelne Wirkstoffe, die Vertreter einer ganzen Wirkstoffklasse oder sogar Vertreter unterschiedlicher Wirkstoffklassen (LODE et al. 1998; KROKER et al.
2007; GUARDABASSI u. COURVALIN 2006; SCHWARZ et al. 2006; BUß et al.
2012).
Die für eine Resistenz gegen Makrolid-Antibiotika bisher bekannten Resistenz- Mechanismen lassen sich in drei Gruppen einteilen: (i) Veränderungen an der Zielstruktur, also den Ribosomen, (ii) Ausschleusung der Wirkstoffe aus der Bakterienzelle und (iii) enzymatische Inaktivierung der Antibiotika (SCHWARZ et al.
2006).
Die größte Bedeutung wird den Veränderungen an der Zielstruktur der Makrolid- Antibiotika in der Bakterienzelle zugeschrieben. Die Bakterien synthetisieren hierfür rRNA-Methylasen. Diese werden als „erythromycin ribosome methylasen“, kurz erm bezeichnet. Die hierfür kodierenden Gene sind die erm-Gene. 1999 waren bereits 20 verschiedene erm-Gene bekannt, 2008 waren es 33 (ROBERTS 2008) und bis dato beläuft sich die Zahl der bekannten erm-Gene auf 39 (ROBERTS 2016). Die Erm Methylasen vermitteln den Transfer von Methylresten an spezifische Stellen der ribosomalen RNA, wodurch die Bindungsaffinität der Makrolide an die Ribosomen deutlich vermindert wird.
Die erm-Gene können induzierbar oder konstitutiv exprimiert werden. Grundlage für die induzierbare Makrolid-Resistenz ist eine dem erm-Gen vorgeschaltete und als Translationsattenuator bezeichnete Regulatorregion mit ein bis zwei Leserahmen für kurze Peptide sowie zwei oder drei Paaren umgekehrt komplementärer Sequenzen.
Letztere können in An- bzw. Abwesenheit des Inducers unterschiedliche mRNA- Sekundärstrukturen bilden, die dann die Ablesung des erm-Gens ermöglichen oder verhindern. Als Inducer fungieren in erster Linie 14- und 15-gliedrige Makrolide wie
18
Erythromycin und Azithromycin. Nicht als Inducer fungieren 16-gliedrige Makrolide, Lincosamide und Streptogramine. Bei einer vorliegenden induzierbaren Makrolid- Resistenz würde somit ein entsprechendes Isolat als gegenüber Tylosin phänotypisch sensibel gewertet, während es gegenüber Erythromycin phänotypisch resistent wäre. Durch Anwesenheit eines Inducers oder durch eine strukturelle Veränderung im Translationsattenuator kann diese induzierbare Makrolid-Resistenz aber innerhalb kurzer Zeit, auch unter der Therapie, zu einer konstitutiven Resistenz wechseln. Bislang bei erm-Genen beschrieben strukturelle Veränderungen im Translationsattenuator umfassen einzelne oder multiple Punktmutationen sowie Deletionen und Duplikationen unterschiedlichen Ausmaßes (SCHWARZ et al. 1998;
WERCKENTHIN u. SCHWARZ 2000; SCHMITZ et al. 2001, 2002a; LÜTHJE u.
SCHWARZ 2007b). Konstitutiv bedeutet, dass die erm-Gene dauerhaft exprimiert werden und die Methylasen ständig gebildet werden. Eine konstitutive Expression bedingt eine Resistenz gegenüber allen Makrolid-Antibiotika, Lincosamiden und Streptogramin B Antibiotika. LÜTHJE und SCHWARZ (2007b) konnten in Bezug auf erm(C) in vitro über einen Selektionsdruck mit nicht-Inducern wie Pirlimycin und Tylosin den Wechsel von induzierbarer zu konstitutiver Resistenz zeigen. Bei Staphylokokken werden häufig die Resistenzgene erm(A) und erm(C) beschrieben, bei den Streptokokken kommt erm(B) am häufigsten vor. Die entsprechenden Gene sind in den meisten Fällen auf Plasmiden oder Transposons lokalisiert (WERCKENTHIN u. SCHWARZ 1997; WEISBLUM 1998; ROBERTS et al.1999;
SCHWARZ et al. 2006; WERCKENTHIN et al. 2005; ROBERTS 2008).
Ein anderer Mechanismus der Resistenz gegenüber Makroliden ist der Efflux mittels Transportsystemen. Dieser Transport ist energieabhängig, je nach Quelle der benötigten Energie wird zwischen „ATP-binding cassette transporters“ (= ABC- Transporter) und den Transportern der „Major Facilitator Superfamily“ (MFS) unterschieden. Die ABC-Transporter nutzen die ATP-Hydrolyse als Energiequelle.
Die msr-Gene (macrolide streptogramin resistance), wie zum Beispiel das msr(A)- Gen, kodieren ABC-Transporter. Diese häufig plasmidlokalisierten Gene sind auf die Ausschleusung von 14- und 15-gliedrigen Makroliden und Streptogramin B Antibiotika spezialisiert. 16-gliedrige Makrolide und Lincosamide können jedoch nicht
19
exportiert werden. Das msr(A)-Gen wurde bei Staphylokokken nachgewiesen, während das msr(D)-Gen bei Streptokokken gefunden wurde. Im Gegensatz zu den msr-Genen kodieren die mef-Gene (macrolide efflux) MFS-Effluxproteine. Diese nutzen den Protonengradienten der Membran als Energiequelle für den Ausschleusungsvorgang. Auch dieser Efflux betrifft nur die 14- und 15-gliedrigen Makrolide und nicht die 16-gliedrigen Makrolide (GEISS et al. 2003; GUARDABASSI u. COURVALIN 2006; SCHWARZ et al. 2006; ROBERTS 2008).
An der Inaktivierung von Antibiotika durch Enzyme sind Esterasen, Lyasen, Transferasen und Phosphorylasen beteiligt. Für die Inaktivierung von Makroliden sind vier Phosphorylasen bekannt. Dabei wurde bisher lediglich das mph(C)-Gen bei Staphylokokken nachgewiesen. Die Phosphorylasen binden eine Phosphatgruppe an das Antibiotikum und inaktivieren es auf diesem Wege. Diese Gene sind häufig auf Plasmiden lokalisiert (GUARDABASSI u. COURVALIN 2006; SCHWARZ et al.
2006). Das mph(C)-Gen kommt häufig in Kombination mit dem msr(A)-Gen vor. Das mph(C)-Gen alleine vermittelt nur eine geringgradige Makrolid-Resistenz (LÜTHJE u.
SCHWARZ 2006).
1.3. Mastitis
1.3.1. Definition Mastitis
Als Mastitis wird eine Entzündung des Eutergewebes bezeichnet. Die Milchdrüse besteht aus den milchbildenden, den milchspeichernden und den milchableitenden Geweben. Die häufigsten Ursachen für Euterentzündungen sind bakterielle Infektionen (JONES u. BAILEY 2009).
Bei der Diagnose von Mastitiden wird, wie auch bei anderen Untersuchungen, zwischen der morphologischen und der ätiologischen Diagnose unterschieden.
Morphologisch wird zwischen klinischen und subklinischen Mastitiden differenziert.
Klinische Mastitiden sind durch eine makroskopisch wahrnehmbare Veränderung des Milchsekretes gekennzeichnet. Je nach Stärke der Mastitis liegen unterschiedlich
20
große Flocken vor oder die Milch hat den Milchcharakter vollkommen verloren. Bei geringgradigen klinischen Mastitiden treten keine weiteren klinischen Symptome auf.
Bei mittel- bis hochgradigen Mastitiden ist das Eutergewebe in der Regel vermehrt warm, geschwollen und schmerzhaft, die Tiere weisen häufig Fieber auf.
Subklinische Mastitiden weisen keine makroskopisch wahrnehmbaren Veränderungen auf. Die Tiere sind klinisch unauffällig und der Milchcharakter ist erhalten. Bei einer subklinischen Mastitis sind die Zellzahlen und die elektrische Leitfähigkeit der Milch erhöht. Eine Zellzahl von weniger als 100.000 Zellen pro ml Milch wird als physiologisch angesehen (DVG 2009). Die Dauer einer Mastitis wird mit den Begriffen subakut, akut und chronisch beschrieben. Bei einer ätiologischen Diagnose wird nach der Ursache der Erkrankung gesucht. Dies ist im Rahmen der Mastitisdiagnostik und im Hinblick auf die bakteriologische Untersuchung besonders wichtig, da nur hier im Anschluss an den Erregernachweis eine Antibiotika- Empfindlichkeitsprüfung für den ursächlichen Erreger durchgeführt werden und eine gezielte Antibiotika-Therapie erfolgen kann.
Die Milch eines gesunden Euters gilt im Allgemeinen als steril. Erst bei der Passage des Strichkanals kann es zu Kontaminationen kommen (KRÖMKER 2007). Neuere Studien der Arbeitsgruppe um Professor Schukken hingegen stellen die Theorie auf, dass es im gesunden Euter, ähnlich wie auf der äußeren Haut, ein Mikrobiom verschiedenster Bakterien gibt, die in einem bestimmten Gleichgewicht leben. Zu den Bakterien des Mikrobioms zählen auch die typischen Mastitiserreger. Eine Mastitis wird als Ausdruck der Verschiebung des Gleichgewichts zu Gunsten einer Spezies, also eine Dysbakteriose, verstanden. Dieser Erreger kann dann in der Milch mit einer hohen Zahl an koloniebildenden Einheiten kulturell nachgewiesen werden. Der Nachweis des Mikrobioms in einem gesunden Euterviertel gelang der Arbeitsgruppe bisher nur mittels PCR. Die Studien hierzu sind noch nicht abgeschlossen.
(OIKONOMOU et al. 2014).
21 1.3.2. Ökonomie der Mastitis
Die Milchwirtschaft ist die wichtigste Einnahmequelle der gesamten Rinderhaltung.
2011 wurden in Deutschland im Bereich der Rinderhaltung 13,7 Milliarden Euro eingenommen, davon entfielen 10,1 Milliarden Euro auf die Milcherzeugung. In Bezug auf die gesamte tierische Produktion sind dies 43,3% (FEHLINGS 2013). So erscheint es nicht verwunderlich, dass Mastitiden die wirtschaftlich bedeutendsten Erkrankungen in der Rinderhaltung darstellen.
MAHLKOW-NERGE und Kollegen (2007) berechneten Gesamtkosten von 470 Euro für einen Fall einer klinischen Mastitis bei einer Herde mit einer jährlichen Milchleistung von 8.500 kg. Neben den offensichtlichen Kosten für die Untersuchungen durch den Tierarzt und die Medikamente fließen in diese Berechnung weitere Kosten ein. Auch der Milchverlust während der Therapie, eine zeitweise oder dauerhafte Minderleistung der Kuh nach überwundener Infektion (Laktationsdelle), die eventuell anfallenden Remontierungskosten, (Anschaffungs- kosten für eine Färse abzüglich des Schlachtkuherlöses) und die Mehrarbeit des Landwirtes müssen hier einberechnet werden. Von diesen Kosten entfallen 47% auf den Verlust der Milch (MAHLKOW-NERGE et al. 2007). KRÖMKER (2007) gibt als einfache Rechenformel an, dass von jedem Liter verkaufter Milch etwa zwei Cent durch Kosten und Verluste auf Grund von Mastitiden weniger erwirtschaftet werden.
Durch ein optimiertes Tiergesundheitsmanagement kann diese Summe bis auf einen Cent reduziert werden. Die anfallenden Kosten für den Einzelfall sind sehr stark von dem Laktationszeitpunkt, dem ursächlichen Erreger und der Leistung des Tieres abhängig. Je früher in der Laktation und je höher die Milchleistung, desto höher ist der voraussichtliche Verlust. JONES und BAILEY (2009) geben für die Milchindustrie in Virginia einen Verlust von 171 Dollar pro Kuh an.
Besonders bei sinkenden Milchpreisen ist eine gute Eutergesundheit von besonderer wirtschaftlicher Bedeutung für die landwirtschaftlichen Betriebe (TSCHISCHKALE 1996). Wie der allgemeinen Presse entnommen werden kann, ist der Milchpreis aktuell sehr niedrig. In Norddeutschland schwankte der Milchpreis im Januar 2016 zwischen 23 und 25 Cent pro Kilogramm abgelieferter Milch (LISTE 2016). Neben
22
der grundsätzlich zu vermeidenden Verbreitung von Antibiotikaresistenzen und dem Tierschutzaspekt ist es bei der geringen Gewinnspanne in der Milchproduktion auch von enormer wirtschaftlicher Bedeutung, dass schon die erste antibiotische Behandlung erfolgreich verläuft.
1.3.3. Einteilung und Vorkommen von Mastitiserregern
Bei der Einteilung der Mastitiserreger wird zwischen kuh- bzw. euterassoziierten Keimen wie Staphylococcus aureus (S. aureus) und Streptococcus agalactiae (S. agalactiae), und den umweltassoziierten Keimen wie Streptococcus uberis (S. uberis) und den coliformen Keimen (z. B. E. coli) unterschieden. Die Koagulase- negativen Staphylokokken (KNS) werden dazwischen eingeordnet. Bei Streptococcus dysgalactiae (S. dysgalactiae) herrscht hinsichtlich der Einordnung Uneinigkeit. WATTS (1988) ordnet sie den umweltassoziierten Keimen zu, BRADLEY (2002) hingegen den kuhassoziierten. Die kuhassoziierten Mastitiserreger werden auch als kontagiöse Mastitiserreger bezeichnet. Sie werden hauptsächlich während des Melkvorgangs durch den Melker oder das Melkzeug übertragen. Eine wichtige Quelle stellen hier infizierte Euterviertel dar, daher ist eine rigorose Melkhygiene unverzichtbar. Die umweltassoziierten Mastitiserreger befinden sich überall in der Umwelt der Tiere wie zum Beispiel in der Einstreu. Sie können aus dem Darm der Kühe mit dem Kot ausgeschieden werden. Die Infektion mit umweltassoziierten Erregern erfolgt in der Zwischenmelkzeit. Durch Optimierung der Boxenhygiene, der Fütterung und auch der Zitzenkonditionen kann hier der Infektionsdruck gesenkt werden.
Die am häufigsten nachgewiesenen Mastitiserreger sind Staphylokokken, Streptokokken und coliforme Keime (DENAMIEL et al. 2005; PERSSON et al. 2011;
PILLAR et al. 2014). Seltener nachgewiesene Mastitiserreger sind zum Beispiel Trueperella pyogenes (T. pyogenes), Streptococcus canis (S. canis), Hefen, Prototheken, Nokardien, Schimmelpilze oder Bazillen.
23
Während einer Studie in Schweden in den Jahren 2002 bis 2003 (BENGTSSON et al. 2009) wurden Viertelgemelksproben von Tieren mit akuter klinischer Mastitis auf die Verbreitung der kausalen Erreger untersucht. Es wurden 987 Viertelgemelksproben untersucht, hiervon gelang aus 694 Viertelgemelksproben ein Erregernachweis. Es wurden 743 Isolate bakterieller Mastitiserreger gewonnen. Am häufigsten wurde S. aureus nachgewiesen (n=211, 28,4%) gefolgt von E. coli (n=163, 21,9%), S. dysgalactiae (n=152, 20,5%), S. uberis (n=113, 15,2%), KNS (n=56, 7,5%), Klebsiella spp. (n=42, 5,7%) und S. agalactiae (n=6, 0,8%)
Im Labor der Milchtierherden-Betreuungs- und Forschungsgesellschaft mbH (MBFG) wurden im Jahr 2015 insgesamt 210.302 Viertelgemelksproben untersucht. Die Proben wurden zur Mastitisdiagnostik eingesandt. Im Gegensatz zur Studie in Schweden stammen sie nicht nur von Fällen klinischer Mastitis. Gründe für die Einsendungen waren vorliegende subklinische, klinische, oder chronische Mastitiden.
Außerdem wurden Kühe vor dem Trockenstellen, zur Kontrolle einer erfolgreichen Behandlung, vor Einrichtung eines automatischen Melksystems und vor dem geplanten Zukauf beprobt. In 80.158 Viertelgemelksproben konnte ein Erregernachweis getätigt werden. Von den für die Mastitisdiagnostik relevantesten Keimen wurde hier S. uberis (n=23.594, 29,4%) am häufigsten nachgewiesen, gefolgt von KNS (n=17.026, 21,2%), S. aureus (n=13.538, 16,9%), coliforme Keime (n=5.729, 7,1%), S. dysgalactiae (n=5.323, 6,6%) und S. agalactiae (n=1.059, 1,3%).
Unter sonstige Erreger sind alle Nachweise zusammengefasst, die selten getätigt wurden, wie zum Beispiel Nokardien, Aerokokken, Bazillen, Pseudomonaden und Misch-Infektionen.
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MBFG Erregernachweise 2015
Coryneforme, 1,1%
T. pyogenes , 1,0%
sonstige Erreger, 5,7%
Hefen & Prototheken, 2,2%
coliforme Keime, 7,1%
S. uberis , 29,4%
Fäkalstreptokokken, 6,8%
S. canis , 0,4%
S. dysgalactiae , 6,6%
S. agalactiae , 1,3%
S. aureus , 16,9%
KNS, 21,2%
Abb. 1.3.3. Verteilung der Erregernachweise aus zur Mastitisdiagnostik eingesandten Viertelgemelksproben der Milchtierherden-Betreuungs- und Forschungsgesellschaft mbH (MBFG) 2015
1.3.4. Mastitisdiagnostik
1.3.4.1. Milchprobengewinnung
Für die ätiologische Mastitisdiagnostik ist auf Grund der weiten Verbreitung der potentiellen Mastitiserreger in der Umwelt der Kühe (auf der Haut der Kuh, auf der Haut des Melkers, im Staub und Dreck von Stall und Melkstand), die antiseptische Gewinnung von Viertelgemelksproben unabdingbar (DVG 2009). Wie in den Leitlinien der DVG zur Entnahme von Milchproben von 2009 und bei MAHLKOW- NERGE und Kollegen (2007) beschrieben, muss vor der Probengewinnung zunächst das Euterviertel trocken von grobem Schmutz befreit werden. Anschließend werden die ersten drei Strahlen aus jedem Viertel in einen Vormelkbecher ermolken und begutachtet. Hiermit wird sichergestellt, dass der Strichkanal gespült wird und in die anschließend gewonnene Milchprobe nur die aus dem Euterparenchym stammenden Keime enthält. Kurz vor Gewinnung der Milchproben werden die Zitzenkuppen und die Öffnung des Strichkanals so lange mit verschiedenen Stellen eines
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alkoholgetränkten Einwegtuchs gereinigt, bis das Tuch sauber bleibt. Die Proben werden mit Handschuhen gewonnen. Zur Vermeidung des Einfalls von Kontaminanten aus der Umgebung des Melkstandes oder des Stalles werden die Probenröhrchen erst unter der Kuh geöffnet und während der Probengewinnung möglichst horizontal gehalten. Die Zitzenspitze darf die Öffnung des Probenröhrchens nicht berühren. In der Regel wird ein Probenvolumen von 10 bis 13 ml gewonnen. Auch wenn nur ein Euterviertel klinisch auffällig ist, sollten immer alle sich in Laktation befindlichen Euterviertel beprobt werden, um subklinische Infektionen mit aufzudecken und eine Bewertung der Probenentnahmequalität durchführen zu können. Um den bakteriologischen Status zum Zeitpunkt der Probengewinnung zu fixieren, können die Proben gekühlt werden oder es werden Proberöhrchen verwendet, die ein für die Mastitisdiagnostik geeignetes Konservierungsmittel, zum Beispiel Borsäure, enthalten. Nach der Probengewinnung sollen die Proben möglichst schnell in das untersuchende Labor verbracht werden.
1.3.4.2. Ätiologischer Nachweis
Der Gold-Standard der Mastitisdiagnostik ist die kulturelle Untersuchung. Der Sachverständigenausschuss „Subklinische Mastitis“ der DVG Fachgruppe
„Milchhygiene“ hat 2009 eine Leitlinie in mittlerweile 3. Auflage herausgebracht, in der die Isolierung und Identifizierung von Mastitiserregern zusammenfassend beschrieben ist (DVG 2009). Nach dieser Leitlinie arbeiten viele Mastitisdiagnostiklabore wie zum Beispiel der Tiergesundheitsdienst (TGD) Bayern und die MBFG. Die Erregerisolierung bildet die Grundlage für die Antibiotika- Empfindlichkeitsprüfung (BTK 2015).
Nach der Probenvorbereitung werden in der Regel 10 µl der Milchprobe auf einem nichtselektiven bluthaltigen Nährboden, der häufig einen Zusatz von Äskulin enthält, ausgestrichen. Viele Mastitiserreger können auf diesem nichtselektiven Nährboden wachsen. Bei gezielten Fragestellungen können weitere selektive Nährböden, für Keime mit besonderen Nährstoffansprüchen wie Mykoplasmen oder für langsam
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wachsende Keime, eingesetzt werden. Die inokulierten Nährböden werden in der Regel bei 36 ± 1°C, in seltenen Fällen bei 30 oder 45°C für meist 24 bis 48 Stunden bebrütet. Zum Nachweis langsam wachsender Keime, wie zum Beispiel Mykoplasmen, werden die Nährböden bis zu 10 Tage bei 36 ± 1°C bebrütet. Die somatische Zellzahl der Milchproben sollte ermittelt werden, hierfür stehen indirekte Verfahren (z. B. Schalm-Test) oder direkte Verfahren (z. B. Kieler Sediment Ausstrich, elektronische Zellzählung oder fluoreszenz-optische Zellzählung) zur Verfügung. Die Kulturen werden nach 24 und 48 Stunden im Zusammenhang mit der ermittelten somatischen Zellzahl begutachtet. Neben guten Wachstumseigenschaften für viele Mastitiserreger ermöglicht der nichtselektive Nährboden eine Bewertung der Probenqualität. Wenn zu allen vier Viertelgemelksproben einer Kuh, unabhängig von der jeweiligen Zellzahl, eine ähnliche Mischkultur vorliegt, kann dies als eine Folge einer nicht ordnungsgemäß durchgeführten Probengewinnung interpretiert werden. Es sollte jeweils nur zu der Milchprobe aus dem klinisch auffälligen Euterviertel oder den Milchproben mit erhöhter somatischer Zellzahl eine Reinkultur von Keimen vorliegen. Mischkulturen erschweren oder verhindern die Mastitisdiagnostik. Mischinfektionen von zwei Keimen können in seltenen Fällen vorkommen. Mischinfektionen von drei oder mehr Keimen unterschiedlicher Spezies sind sehr unwahrscheinlich. Der tatsächlich ursächliche Erreger kann in Einzelfällen vermutet, aber nur durch eine erneute Beprobung bestätigt werden (DVG 2009).
Die kulturelle Mastitisdiagnostik hat einige Vorteile: Sie ist kostengünstig, die Qualität der Proben und somit die Sicherheit der Diagnose können beurteilt werden und es werden nur lebende vermehrungsfähige Keime nachgewiesen, die weiteren Untersuchungen, wie zum Beispiel der Antibiotika-Empfindlichkeitsprüfung, unterzogen werden können. Ein Nachteil liegt in der Bebrütungszeit von mindestens 24 Stunden. Des Weiteren können bereits abgetötete Keime oder durch eine Antibiotika-Therapie zumindest beeinträchtigte Keime nicht nachgewiesen werden.
Aus diesem Grund wird empfohlen bereits vor dem Beginn der Therapie eine Probe für die bakteriologische Diagnostik zu entnehmen (BTK 2015).
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Eine Mastitisdiagnostik kann auch mittels PCR durchgeführt werden, hier reichen Fragmente der Erreger für einen Nachweis. Dieses Verfahren ist aber momentan noch sehr teuer und es fehlen noch Erfahrungswerte zur Auswertung der ermittelten Daten.
1.3.4.3. Keimdifferenzierung
Die typischen Wachstumseigenschaften der einzelnen Keime lassen eine vorläufige Identifizierung anhand der Koloniemorphologie, der Hämolyseeigenschaften und der Fähigkeit zur Äskulinspaltung zu. Diese vorläufige Einordnung wird durch weiterführende Untersuchungen bestätigt. Im Folgenden ist nur die Diagnose der in der Studie enthaltenen Staphylokokken und Streptokokken näher beschrieben. Bei Staphylokokken und Streptokokken handelt es sich jeweils um Gram-positive Kokken, diese beiden Gruppen können aber anhand der Koloniemorphologie und mittels Katalasetest deutlich voneinander abgegrenzt werden.
Staphylokokken sind Gram-positive und Katalase-positive Bakterien aus der Familie der Mikrococcaceae. Sie sind typische Kommensalen der Haut und Schleimhäute.
Derzeit sind 52 verschiedene Spezies und 28 Subspezies bekannt (BACTERIO 2016). Staphylokokken bilden bei aerober Bebrütung in der Regel große glänzende, manchmal aber auch raue Kolonien in verschieden Abstufungen von weiß, grau und gelb. Sie können nicht hämolysierend sein, eine feine oder breite Hämolysezone aufweisen oder eine zweizonige Hämolyse aufweisen. Die zweizonige Hämolyse wird nur von S. aureus gebildet und besteht aus einer von α-Hämolysinen gebildeten klaren Zone vollständiger Hämolyse direkt um die Kolonie und einer weiteren Zone unvollständiger Hämolyse, die von β-Hämolysinen gebildet wird. Staphylokokken weisen eine Vielzahl von Toxinen und Enzymen auf, besonders wichtig für die Einteilung der Staphylokokken ist die Koagulase. Mit Hilfe der Koagulase kann im Bereich der Mastitisdiagnostik zwischen den Koagulase-positiven S. aureus und der großen Gruppe der Koagulase-negativen Staphylokokken unterschieden werden.
Diese Unterscheidung ist wichtig, da es hinsichtlich der Therapie und
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Bekämpfungsmaßnahmen Unterschiede gibt. Eine alleinige Einordnung anhand der Koloniemorphologie ist nur möglich, wenn eine typische zweizonige Hämolyse vorliegt. Alle Staphylokokken, die nicht eine solche Hämolyse aufweisen, sollten einem Koagulasetest unterzogen werden, da es S. aureus- und KNS-Isolate mit und ohne Hämolyse gibt. Im Labor der MBFG werden alle Staphylokokken, auch die mit typischer S. aureus-Hämolyse, routinegemäß einem Koagulase-Test unterzogen. Die große Gruppe der KNS wird in der Mastitisdiagnostik bisher, in der Regel, nicht weiter differenziert. KNS verursachen meist subklinische Mastitiden, klinische Mastitiden treten nur selten auf. S. aureus kann sowohl chronische, subklinische als auch akute Mastitiden verursachen, wobei die akuten Fälle seltener vorkommen.
S. aureus bereitet aufgrund verschiedener Abwehrmechanismen große Probleme bei der Therapie. Die in vitro als wirksam klassifizierten Antibiotika können die Staphylokokken teilweise nicht erreichen und bekämpfen, da S. aureus sich in Phagolysosomen von Makrophagen zurückziehen kann oder sich mittels Koagulase vor dem Zugriff durch Antibiotika schützt.
Streptokokken bilden in der Regel zarte kleine gräuliche durchscheinende Kolonien.
Derzeit sind 113 Streptokokken-Spezies mit 22 Subspezies bekannt (BACTERIO 2016). Sie sind Gram-positiv und Katalase-negativ. Sie können eine α- (=vergrünende), β- (=vollständige) oder γ- (=keine) Hämolyse aufweisen. Es werden Äskulin-positive und Äskulin-negative Streptokokken unterschieden. Äskulin-positive Streptokokken können Äskulin, einen Zucker der Rosskastanie, spalten. Wenn dem unselektiven Nährboden Äskulin zugesetzt wurde, fluoresziert der Nährboden unter UV-Licht. Liegen Äskulin-positive Streptokokken vor, spalten diese das Äskulin und der Nährboden fluoresziert im Bereich um die Kolonien nicht mehr. S. uberis und Enterokokken sind Äskulin-positiv. Sie können zum Beispiel durch Subkultur auf einen selektiven Nährboden mit Zusatz von Galle weiter unterschieden werden. Die Enterokokken tolerieren den Gallezusatz und wachsen auf dem Nährboden, S. uberis wird jedoch gehemmt. Auch eine Differenzierung mit Hilfe eines Latexagglutinationstest mit dem Gruppenantigen D ist möglich. Enterokokken reagieren mit der Lancefieldgruppe D positiv. Bei den Äskulin-negativen Streptokokken handelt es sich um S. agalactiae, S. dysgalactiae und S. canis. Diese
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können ebenfalls mittels eines Latexagglutinationstest mit den Gruppenantigenen B (S. agalactiae), C (S. dysgalactiae) und G (S. canis) unterschieden werden. S. uberis spielt als umweltassozierter Erreger eine große Rolle im Mastitisgeschehen, da er ubiquitär in der Umgebung der Kühe vorkommt und diese sich immer wieder neu anstecken können. S. agalactiae und S. canis werden den kuhassozierten Erregern zugeordnet und werden daher hauptsächlich während des Melkvorganges übertragen. Es kann hierbei zur seuchenartigen Ausbreitung auf den ganzen Bestand innerhalb von kurzer Zeit kommen. Da die Infektion häufig subklinisch verläuft, wird sie oft erst spät anhand eines plötzlichen Anstiegs der in der Milchleistungsprüfung (MLP) ermittelten Zellzahlen festgestellt. S. canis wird nur selten nachgewiesen. Bei S. dysgalactiae wird eine Übertragung sowohl über die Umwelt als auch über den Melkvorgang diskutiert.
1.4. Antibiotika-Empfindlichkeitsprüfung
Da jeder Einsatz von Antibiotika, unabhängig davon, ob er fachgerecht erfolgt, zu einer Entwicklung von Resistenzen führen kann, wurden Leitlinien für den sorgfältigen Umgang mit Antibiotika entwickelt (BTK 2015). Antibiotika dürfen nur dann eingesetzt werden, wenn eine Empfindlichkeit des ursächlichen Erreger gegenüber dem einzusetzenden Wirkstoff belegt oder mit hoher Sicherheit angenommen werden kann (SCHWARZ et al. 2003; BTK 2015). Ein geeignetes Instrument zur Feststellung der Wirksamkeit eines Antibiotikums ist die Antibiotika- Empfindlichkeitsprüfung. Für alle typischen Mastitiserreger sind bereits viele Resistenzen gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen bekannt, auch Resistenzen gegen Makrolide wurden nachgewiesen (LÜTJE u. SCHWARZ 2006; FEßLER et al.
2010a; LINDEMAN et al. 2013; PINTO et al. 2013). Da mit der Milch leicht eine Probe dieses Organsystems gewonnen werden kann, sollte vor oder in akuten Fällen parallel zu jeder Antibiotika-Therapie eine Mastitisdiagnostik inklusive Resistenztest eingeleitet werden.
30
1.4.1. Methoden der Antibiotika-Empfindlichkeitsprüfung
Die für die Antibiotika-Empfindlichkeitsprüfung zur Verfügung stehenden Methoden werden in zwei Gruppen eingeteilt. Man unterscheidet zwischen Diffusionsverfahren und Dilutionsverfahren.
Im Agardiffusionstest, der auch als Plättchentest bekannt ist, wird der zu testende antimikrobielle Wirkstoff in einer bestimmten Konzentration auf einem Trägerstoff, ein Papierplättchen, aufgebracht. Diese Testplättchen sind kommerziell erhältlich. Die Plättchen werden auf einen Nährboden, der zuvor homogen mit dem zu testenden Erreger beimpft wurde, aufgelegt und der Wirkstoff kann in den Nährboden diffundieren. Um das Testplättchen herum entsteht ein Wirkstoffgradient. Während der sich anschließenden Bebrütung können die Keime in Abhängigkeit von dem entsprechenden Wirkstoffgradienten auf diesem Nährboden wachsen. Um die Testplättchen herum können Zonen ohne Wachstum, sogenannte Hemmhöfe, entstehen, deren Hemmhofdurchmesser (HHD) gemessen und interpretiert werden.
Dieser Test stellt das aktuell preisgünstigste Verfahren der Resistenztestung dar. Ein Nachteil dieser Testmethode besteht darin, dass sie nicht dazu geeignet ist, minimale Hemmkonzentrationen (MHK-Werte) zu ermitteln (BUß et al. 2012).
Bei den Dilutionsverfahren handelt es sich um Reihenverdünnungstests. Von dem zu testenden Wirkstoff wird eine Reihenverdünnung, meist als zweifache Verdünnungsreihe, erstellt. Eine definierte Menge eines Erregers wird zugegeben und mit den so erstellten unterschiedlichen Konzentrationen inkubiert. Die niedrigste Wirkstoffkonzentration, bei der kein sichtbares Bakterienwachstum mehr feststellbar ist, gilt als MHK. Das Bouillon-Dilutionsverfahren unter Verwendung von flüssigen Nährmedien kann in Reagenzgläsern als Makrodilution oder auf einer Mikrotiterplatte als Mikrodilution durchgeführt werden. Es können aber auch feste Nährmedien verwendet werden und eine Agardilution durchgeführt werden. Die Dilutionsverfahren ermöglichen eine quantitative Aussage zum Grad der Empfindlichkeit von Erregern.
Diese Methode ist allerdings aufwendiger und teurer als der Agardiffusionstest (BUß et al. 2012). Mit Hilfe der MHK-Bestimmung kann im Rahmen von Studien die Verteilung der MHK-Werte innerhalb von Populationen verglichen werden. Zur
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besseren Vergleichbarkeit werden die MHK50- und MHK90-Werte bestimmt. MHK50 ist der MHK-Wert, bei dem mindestens 50% der untersuchten Isolate gehemmt oder abgetötet werden. MHK90 gibt den Wert an, bei dem mindestens 90% der Isolate gehemmt oder abgetötet werden. Wenn der MHK50- und MHK90-Wert weit auseinander liegen, ist der Abstand zwischen den vermeintlich resistenten und vermeintlich sensiblen Isolaten groß, dies spiegelt sich in einer bimodalen Verteilung der MHK-Werte nieder. Bei einer gleichmäßigen Verteilung der MHK-Werte ist der Abstand zwischen MHK50 und MHK90 klein, hier liegt meist eine unimodale Verteilung vor (SCHWARZ et al. 2010).
Der Epsilon-Test oder E-Test kombiniert Agardiffusionstest und MHK-Testung. Ein Kunststoffstreifen, der einen Wirkstoffgradienten enthält, wird auf einen beimpften Nährboden gelegt und inkubiert. Wenn sich ein Hemmhof gebildet hat, kann an dem Schnittpunkt des Streifens mit dem Hemmhof der MHK-Wert mit Hilfe der aufgedruckten Skala ausgewertet werden. Der Epsilon-Test gilt als zuverlässiger und robuster Test, dessen Ergebnisse gut mit den MHK-Ergebnissen aus dem Dilutionsverfahren korrelieren. Dieses Verfahren ist momentan allerdings sehr teuer und es gibt nur für wenige rein veterinärmedizinisch genutzte Wirkstoffe entsprechende Teststreifen (ALTREUTHER 1997; SCHWARZ et al. 2003).
Zwischen MHK-Werten und Hemmhofdurchmessern gibt es eine Korrelation. Je größer der HHD, desto niedriger ist der MHK und je kleiner der Hemmhof ist, desto höher ist der MHK-Wert. Minimale Hemmkonzentrationen und Hemmhofdurchmesser können in einem Scattergram, einem Streuungsdiagramm, gegeneinander aufgetragen und verglichen werden. Der für ein Isolat ermittelte MHK-Wert und der HHD-Wert sollten jeweils beide in dieselbe Bewertungsklasse fallen. Wenn ein Isolat für den einen Wert als intermediär und für den anderen als resistent oder sensibel gewertet wird, wird dies als geringfügiger Fehler („minor error“) bezeichnet. Wenn der MHK-Wert von einem Isolat als sensibel gewertet wird, während der HHD in die Kategorie resistent fällt, wird dies als großer Fehler angesehen und als „major error“
bezeichnet. Wenn aber ein Isolat anhand seines HHD-Wertes als sensibel gewertet wird und der MHK-Wert als resistent gilt, wird dies als größtmöglicher Fehler
32
gewertet und als „very major error“ eingestuft (JORGENSEN et al. 1999). Diese unterschiedliche Beurteilung ist darin begründet, dass die im Reihenverdünnungsverfahren ermittelten MHK-Werte als besser standardisiert und daher verlässlicher gelten. In vielen Diagnostiklaboratorien wird aber aus Kostengründen der Agardiffusionstest durchgeführt. Ein fälschlich als unwirksam gewerteter Wirkstoff würde nur die Auswahlmöglichkeiten für die Therapie einschränken. Ein falsch als wirksam gewerteter Wirkstoff hingegen kann erhebliche Konsequenzen für den Patienten haben und ein Therapieversagen beim Einsatz dieses Wirkstoffes nach sich ziehen (SCHWARZ et al. 2003)
1.4.2. Qualitätskontrolle
Wie von JORGENSEN und TURNIDGE (2003) beschrieben ist es unerlässlich, zur Validierung der Methoden Qualitätskontrollen durchzuführen. Zur Qualitätskontrolle gehört neben der Funktionskontrolle auch eine Sterilitätskontrolle der eingesetzten Nährmedien. Für die Qualitätskontrolle werden definierte und standardisierte Referenzstämme eingesetzt. Die Testung dieser Qualitätskontrollstämme darf nicht von den Bedingungen abweichen, die für das Untersuchungskollektiv genutzt werden. Die entsprechenden Qualitätskontrollbereiche sind jeweils spezifisch für die jeweilige Methode in Kombination mit einem bestimmten Referenzstamm. Eine Übertragung von Qualitätskontrollbereichen auf eine andere Spezies oder eine andere Methode ist nicht zulässig. Mit Hilfe der Qualitätskontrolle kann festgestellt werden, ob es im Verlauf der Durchführung der Empfindlichkeitsprüfung zu Abweichung gekommen ist. Weichen die ermittelten Werte von den vorgegeben Qualitätskontrollbereichen ab, müssen alle, zusammen mit der Qualitätskontrolle durchgeführten, Untersuchungen wiederholt werden. Mögliche Fehlerquellen bei der Empfindlichkeitsprüfung sind zum Beispiel kontaminierte Medien, zu alte Medien, Abweichungen in der Inkubationszeit oder der Bebrütungstemperatur, eine falsche Inokulumdichte oder nicht ordnungsgemäß aufgelegte Wirkstoffträger.
33 1.4.3. Klinische Grenzwerte
Um eine Voraussage in Hinblick auf einen zu erwartenden Therapieerfolg treffen zu können, werden klinische Grenzwerte verwendet. Diese sind jeweils spezifisch für die Anwendung eines bestimmten antimikrobiellen Wirkstoffs, in Kombination mit einer definierten Indikation (z. B. Mastitis) in einer bestimmten Zieltierart (z. B. Rind), in einem bestimmten Organ oder Gewebe (z. B. Euter), verursacht durch einen bestimmten Erreger (z. B. S. uberis). Diese klinischen Grenzwerte dürfen nicht übertragen werden, auch nicht auf ähnliche Wirkstoffe oder eine andere Tierart bei gleicher Indikation. Es kann aber vorkommen, dass die gleichen klinischen Grenzwerte für mehrere Bedingungen existieren. Zum Beispiel können gleiche klinische Grenzwerte für einen antimikrobiellen Wirkstoff zum Einsatz bei Mastitiden von Rindern hervorgerufen durch Staphylokokken, Streptokokken und coliforme Keime gelten (SCHWARZ et al. 2010).
Um klinische Grenzwerte festlegen zu können, müssen eine Reihe von Daten erhoben werden. BÖTTNER und Kollegen (2000) haben die benötigten Daten aufgelistet und erläutert. Neben der In-vitro-Empfindlichkeit eines bestimmten Erregers, werden zum Beispiel auch allgemeine Informationen wie Darreichungsform, Dosierung, chemische Struktur und Löslichkeit benötigt. Auch die Pharmakokinetik und klinische Wirksamkeit müssen ermittelt werden. Nur wenn alle Daten vorliegen, können klinische Grenzwerte ermittelt werden, eine Vereinfachung des Verfahrens ist nicht zulässig.
Bisher gibt es allerdings noch nicht für alle antimikrobiellen Wirkstoffe und Indikationen veterinärspezifische klinische Grenzwerte. Viele Grenzwerte wurden aus der Humanmedizin übertragen. Da es aber große Unterschiede zwischen Menschen und Tieren hinsichtlich des Erregerspektrums und der Pharmakokinetik gibt, ist eine Übertragung ohne Überprüfung nicht möglich oder wissenschaftlich vertretbar (BÖTTNER et al. 2000). Um gezielt Methoden und Interpretationskriterien für die Veterinärmedizin zu entwickeln, wurde 1993 im National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS, ab 2005 umbenannt in Clinical and Laboratory Standards Institute, kurz CLSI) das Subcommittee on Veterinary Antimicrobial
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Susceptibility Testing (VAST) gegründet (WATTS u. LINDEMANN 2006). Das CLSI verfügt über die größte Datenbank an veterinärspezifischen klinischen Grenzwerten und Methoden zur standardisierten Empfindlichkeitsprüfung. Daher wird empfohlen bei der Empfindlichkeitstestung von Tieren stammender Erreger die Durchführungsvorschriften des CLSI zu nutzen (SCHWARZ et al. 2003). In den veterinärspezifischen CLSI-Dokumenten befinden sich aber auch eine Reihe von klinischen Grenzwerten, die aus den humanspezifischen CLSI-Dokumenten übernommen wurden. Diese wurden nur in das Dokument übernommen, wenn es keine veterinärspezifischen Grenzwerte gab und die Werte geeignet erschienen. Es wird angestrebt die humanspezifischen Grenzwerte nach und nach durch veterinärspezifische Grenzwerte zu ersetzen. Zur besseren Unterscheidung sind die humanspezifischen Grenzwerte in den veterinärspezifischen CLSI-Dokumenten farblich gekennzeichnet (CLSI 2015a). Für Mastitiserreger stehen aktuell leider nur für drei Wirkstoffe (Pirlimycin, Ceftiofur und Penicillin/Novobiocin) vom CLSI anerkannte veterinärspezifische Grenzwerte zur Verfügung (CLSI 2015a), wobei in Deutschland lediglich Pirlimycin für die Mastitistherapie zugelassen ist (VETIDATA 2016). Weitere klinische Grenzwerte für Mastitis beim Rind wurden aber erarbeitet und publiziert, wie zum Beispiel die klinischen Grenzwerte für Ubrolexin (PILLAR et al. 2014) und Cefoperazon (FEßLER et al. 2012, 2016).
1.4.4. Interpretation der ermittelten Daten
Die mit Hilfe der Antibiotika-Empfindlichkeitsprüfung in vitro ermittelten MHK-Werte oder Hemmhofdurchmesser können mit Hilfe von klinischen Grenzwerten beurteilt werden. Dabei wird eine Einteilung in die Kategorien sensibel, intermediär und resistent vorgenommen. Die Einteilung erfolgt in Hinblick auf den zu erwartenden Therapieerfolg. Ein Keim wird in vitro als sensibel für einen bestimmten Wirkstoff eingeordnet, wenn zu erwarten ist, dass eine Therapie nach den üblichen Behandlungsvorgaben erfolgreich sein wird. Ein Keim gilt als resistent, wenn trotz Erreichen der höchst möglichen Konzentration am Wirkungsort bei üblicher Dosierung eines Wirkstoffs, ein Behandlungserfolg unwahrscheinlich ist. Als
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intermediär wird das Ergebnis interpretiert, wenn der Therapieerfolg zweifelhaft ist.
Der intermediäre Bereich stellt zudem eine Pufferzone zwischen sensibel und resistent da. Für eine Behandlung mit einer als intermediär einzustufenden Substanz ist eventuell eine höhere Dosierung notwendig. Eine Erhöhung der Dosis kann aber zu Problemen führen, da nur für die zugelassenen Dosierungen definierte Wartezeiten vorliegen oder höhere Dosierungen aufgrund einer geringen therapeutischen Breite nicht indiziert sein können (CLSI 2011).
Bei in vitro ermittelter Empfindlichkeit eines bestimmten Bakteriums gegenüber einem bestimmten Wirkstoff kann trotz korrekter Diagnostik und fachgerechtem Resistenztest, der Erreger in vivo für diesen Wirkstoff unempfindlich sein. Dies ist der Fall, wenn die Bakterien unter der Therapie Resistenzgene erwerben, das Medikament den Wirkungsort aufgrund besonderer Bedingungen nicht erreichen kann oder die Keime im Gewebe einen Biofilm bilden, den sie im Labor nicht gezeigt haben (RICHTER et al. 2006). Aber auch eine In-vitro-Unempfindlichkeit bei vorliegender In-vivo-Empfindlichkeit ist möglich, wenn sich der Wirkstoff in bestimmten Geweben oder Zellen anreichert. Die Konzentration kann dann im Vergleich zur Konzentration im Blut um ein vielfaches höher sein. Durch diese Anreicherung kann ein erhöhter Wirkstoffspiegel über längere Zeit bestehen bleiben.
Auch ist möglich, dass bei vorliegender In-vitro-Unempfindlichkeit die scheinbare In- vivo-Empfindlichkeit allein auf dem Erfolg des Immunsystems beruht. Generell sollte aber eine Substanz, gegen die der nachgewiesene Erreger in vitro eine Unempfindlichkeit zeigt, nicht zur Behandlung der entsprechenden Infektion eingesetzt werden (RICHTER et al. 2006; KROKER et al. 2007).
Eine andere Möglichkeit der Interpretation der mittels Antibiotika-Empfindlichkeits- testung ermittelten Werte, bieten die Epidemiologischen Cut-Off-Werte (ECOFFs).
Diese Werte sind nicht geeignet, die In-vitro-Empfindlichkeit mit der In-vivo- Empfindlichkeit in Bezug zu setzten. Mit den ECOFFs können Daten zur Verteilung von MHK- und HHD-Werten verglichen werden und zeitliche und regionale Änderungen verfolgt werden. Dies ermöglicht eine frühzeitige Erkennung von sich entwickelnden Resistenzen. Bei den ECOFFs wird zwischen „Wildtyp“ und „Nicht-
36
Wildtyp“-Populationen unterschieden. Als „Wildtyp“ wird die Populationen mit den größten Hemmhofdurchmessern bzw. kleinsten MHK-Werten bezeichnet. Von diesen wird angenommen, dass sie über keine Resistenzmechanismen verfügen. Bei der
„Nicht-Wildtyp“-Population dagegen werden erworbene Resistenzmechanismen vermutet, die sich in höheren MHK-Werten bzw. kleineren Hemmhöfen zeigen und die „Nicht-Wildtyp“-Population von der verbleibenden vermeintlich empfindlichen
„Wildtyp“-Population unterscheidet (SCHWARZ et al. 2014).
1.5. Ziele der Arbeit
Ziele der vorliegenden Studie waren:
(1) im Rahmen eines Ringversuchs QC-Bereiche für den Referenzstamm S. aureus ATCC® 25923 und mit 30 µg beladene Tylosin-Testplättchen für den Agardiffusionstest zu ermitteln,
(2) bovine Mastitiserreger der Gruppen S. aureus, KNS, S. agalactiae, S. dysgalactiae und S. uberis mittels Agardiffusion (30 µg Tylosin- Testplättchen sowie 15 µg Erythromycin-Testplättchen) und Bouillon- Mikrodilution für Tylosin und Erythromycin vergleichend zu untersuchen und (3) Erythromycin-resistente Isolate im Hinblick auf das Vorliegen von Makrolid-
Resistenzgenen zu überprüfen.
37
Kapitel 2
Quality control ranges for tylosin 30 µg and 15 µg discs applicable to
Staphylococcus aureus ATCC ® 25923
BUß, M.*, A. T. FEßLER*, J. TURNIDGE, T. PETERS and S. SCHWARZ
J. Antimicrob. Chemother. 2014 Jan; 69 (1): 277 - 280.
doi: 10.1093/jac/dkt309.
* These authors contributed equally to this study
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Kapitel 3
Tylosin susceptibility of staphylococci from bovine mastitis.
ENTORF, M., A. T. FEßLER, K. KADLEC, H. KASPAR, J. MANKERTZ, T. PETERS and S. SCHWARZ
Vet. Microbiol. 2014 Jul 16; 171(3 - 4): 368 - 373.
doi: 10.1016/j.vetmic.2013.12.014.
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Kapitel 4
Comparative erythromycin and tylosin susceptibility testing of streptococci
from bovine mastitis.
ENTORF, M., A. T. FEßLER, H. KASPAR, K. KADLEC, T. PETERS and S. SCHWARZ
Vet. Microbiol. 2015 (in press)
doi: 10.1016/j.vetmic.2015.12.003.
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Kapitel 5
Zusammenfassung der Ergebnisse und
übergreifende Diskussion
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Die Auswahl des im Einzelfall am besten geeigneten Antibiotikums ist für eine erfolgreiche Antibiotika-Therapie unerlässlich (SCHWARZ et al. 2003; BTK 2015) Hierfür muss die Antibiotika-Empfindlichkeitsprüfung standardisiert durchgeführt und interpretiert werden. Die Schwerpunkte der vorliegenden Arbeit stellen gleichzeitig die nachfolgenden Diskussionspunkte in den Kapiteln 5.1. - 5.3. dar.
5.1. Ermittlung von Qualitätskontrollbereichen für die Testung von mit 30 µg beladenen Tylosin-Testplättchen mittels Agardiffusionstest
Zu Beginn der Studie lagen für die Qualitätskontrolle im Rahmen der Empfindlichkeitsprüfung Tylosin-spezifische CLSI-anerkannte Qualitätskontroll- Bereiche für die Bouillon-Mikrodilution vor. Für die Qualitätskontrolle des Agardiffusionstest lagen nur für mit 60 µg beladene Tylosin-Testplättchen CLSI anerkannte Qualitätskontroll-Bereiche vor (CLSI 2008a). Diese wurden für S. aureus ATCC® 25923 und Streptococcus pneumoniae ATCC® 49619 ermittelt (ANDEREGG u. JONES 2003). Die mit 60 µg beladenen Testplättchen sind aber kommerziell nicht erhältlich. Im Handel gibt es jedoch mit 30 µg beladene Tylosin-Testplättchen. Daher wurde im Rahmen dieser Arbeit ein Ringversuch zur Ermittlung des Qualitätskontrollbereichs für S. aureus ATCC® 25923 und mit 30 µg beladenen Tylosin-Testplättchen durchgeführt (Kapitel 2).
Der Ringversuch wurde nach den Vorgaben des CLSI-Dokuments VET02-A3 (CLSI 2008b) durchgeführt. An diesem Ringversuch nahmen acht verschiedene deutsche Labore teil. Jedes Labor führte an zehn verschiedenen Tagen einen Agardiffusionstest auf jeweils drei Chargen Müller-Hinton-Agar verschiedener Hersteller mit zwei unterschiedlichen Chargen von 30 µg Tylosin-Testplättchen verschiedener Hersteller durch. Als Kontrolle wurden 15 µg-Plättchen des 14- gliedrigen Makrolid-Antibiotikum Erythromycin parallel mit untersucht (Kapitel 2). In diesem Ringversuch wurden auch QC-Bereiche für mit 15 µg beladene Tylosin- Testplättchen bestimmt. Da CLSI jedoch pro Wirkstoff nur QC-Bereiche für eine Beladung der Testplättchen akzeptiert und der VAST-Unterausschuss von CLSI sich
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für die 30 µg-Testplättchen entschieden hat, wird auf die Ergebnisse für die 15 µg Tylosin-Testplättchen nicht näher eingegangen.
In dem Ringversuch wurden je Nährbodencharge insgesamt 80 und je Tylosin- Testplättchen-Charge 240 Hemmhofdurchmesser ermittelt. Insgesamt ergaben sich daraus 480 Hemmhofdurchmesser. Es wurden die Daten für die verschiedenen Nährboden-Chargen miteinander verglichen und die Ergebnisse der beiden Tylosin- Testplättchen-Chargen gegenüber gestellt. Für die Medienchargen ergaben sich HHD-Werte von 18 - 26 mm, 18 - 27 mm und 19 - 26 mm, während die HHD-Werte für beide Plättchenchargen im Bereich von 18 - 27 mm lagen. Zusätzlich erfolgte eine Auswertung der Daten auf Laborebene, wobei die Verteilung innerhalb dieser Bereiche zwischen den einzelnen Laboren schwankte (Kapitel 2).
Die erhobenen Daten wurden mit Hilfe der RangeFinder-Software von TURNIDGE und BORDASH (2007) ausgewertet. Für die Antibiotika-Empfindlichkeitsprüfung mittels Agardiffusionstest wurden für die Testung des Qualitätskontrollstammes S. aureus ATCC®25923 mit 30 µg Tylosin-Testplättchen ein Qualitätskontrollbereich von 18 bis 26 mm ermittelt. ANDEREGG und JONES (2003) haben in einem Ringversuch ebenfalls einen Qualitätskontrollbereich für den Referenzstamm S. aureus ATCC® 25923 für 30 µg Tylosin-Plättchen ermittelt. Die Bedingungen für diesen Ringversuch waren ähnlich, es wurden ebenfalls drei verschiedene Chargen von Nährmedien eingesetzt und es nahmen acht Labore teil. Allerdings wurde nur eine Charge von 30 µg Tylosin-Testplättchen getestet. Der angegebene Qualitätskontrollbereich lag hier bei Hemmhofdurchmessern von 18 - 22 mm. Diese Ergebnisse zeigen eine gute Übereinstimmung zu dem im Rahmen der vorliegenden Studie entwickelten Qualitätskontrollbereich, der den gesamten Bereich der vorherigen Studie mit abdeckt.
Die in dieser Studie ermittelten Qualtätskontrolldaten wurden auf dem Treffen des VAST Unterausschusses des CLSI am 21 Juni 2013 vorgestellt, angenommen und ersetzen im CLSI-Dokument VET01-S 3rd ed., die bisher angegeben Qualitätskontrollbereiche für 60 µg-Testplättchen (CLSI 2015a).
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5.2. Vergleichende Untersuchung der Empfindlichkeit gegenüber Tylosin mittels Agardiffusion und Bouillon-Mikrodilution
Da es zur Empfindlichkeit der typischen Mastitiserreger gegenüber Tylosin kaum Daten gibt und auch wenig über die Korrelation der Hemmhofdurchmesser zu den MHK-Werten bekannt ist, wurden in dem zweiten Teil der Studie insgesamt 525 Staphylokokken- und Streptokokken-Isolate, die aus der Milch von an Mastitis erkrankten Kühen gewonnen wurden, hinsichtlich ihrer In-vitro-Empfindlichkeit gegenüber Tylosin und Erythromycin untersucht.
Die überwiegende Mehrzahl der Isolate wurde im Rahmen des nationalen Resistenzmonitorings GERM-Vet in den Jahren 2008 bis 2010 in Deutschland gesammelt. Einige der Isolate stammen aus der Routinediagnostik der MBFG. Es wurde jeweils nur ein Isolat pro Betrieb verwendet. Stämme dieser Kollektion wurden in der Vergangenheit auch schon weitgehend für Studien zur Oxacillin- Empfindlichkeit von KNS und zur Ermittlung klinischer Grenzwerte für Cefoperazon verwendet (FEßLER et al. 2010b, 2012, 2016). Dieses Kollektiv setzte sich zusammen aus 112 S. aureus, 110 KNS, 101 S. agalactiae, 100 S. dysgalactiae und 102 S. uberis.
Alle Isolate wurden mittels Bouillon-Mikrodilution und mittels Agardiffusionstest mit 30 µg Tylosin-Testplättchen untersucht. Die Testungen erfolgten gemäß den Vorgaben des CLSI-Dokuments VET01-A4 (CLSI 2013a). Zusätzlich wurde Erythromycin als Vergleichssubstanz in der Bouillon-Mikrodilution und der Agardiffusion unter Verwendung von 15 µg Testplättchen eingesetzt. Die ermittelten Daten für MHK und HHD wurden jeweils mit Hilfe eines Scattergrams analysiert (JORGENSEN et al. 1999). Pro Spezies wurden je ein Scattergram für Erythromycin und eines für Tylosin erstellt (Kapitel 3, Kapitel 4).
Da für die Testung von Erythromycin CLSI-anerkannte Grenzwerte zur Verfügung stehen, wurden die für Erythromycin ermittelten Werte entsprechend als sensibel, intermediär und resistent und „minor error“, „major error“ und „very major error“
eingestuft (CLSI 2013b; siehe Kapitel 1.4.1.)
