Ätiologischer Nachweis

Der Gold-Standard der Mastitisdiagnostik ist die kulturelle Untersuchung. Der Sachverständigenausschuss „Subklinische Mastitis“ der DVG Fachgruppe

„Milchhygiene“ hat 2009 eine Leitlinie in mittlerweile 3. Auflage herausgebracht, in der die Isolierung und Identifizierung von Mastitiserregern zusammenfassend beschrieben ist (DVG 2009). Nach dieser Leitlinie arbeiten viele Mastitisdiagnostiklabore wie zum Beispiel der Tiergesundheitsdienst (TGD) Bayern und die MBFG. Die Erregerisolierung bildet die Grundlage für die Antibiotika-Empfindlichkeitsprüfung (BTK 2015).

Nach der Probenvorbereitung werden in der Regel 10 µl der Milchprobe auf einem nichtselektiven bluthaltigen Nährboden, der häufig einen Zusatz von Äskulin enthält, ausgestrichen. Viele Mastitiserreger können auf diesem nichtselektiven Nährboden wachsen. Bei gezielten Fragestellungen können weitere selektive Nährböden, für Keime mit besonderen Nährstoffansprüchen wie Mykoplasmen oder für langsam

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wachsende Keime, eingesetzt werden. Die inokulierten Nährböden werden in der Regel bei 36 ± 1°C, in seltenen Fällen bei 30 oder 45°C für meist 24 bis 48 Stunden bebrütet. Zum Nachweis langsam wachsender Keime, wie zum Beispiel Mykoplasmen, werden die Nährböden bis zu 10 Tage bei 36 ± 1°C bebrütet. Die somatische Zellzahl der Milchproben sollte ermittelt werden, hierfür stehen indirekte Verfahren (z. B. Schalm-Test) oder direkte Verfahren (z. B. Kieler Sediment Ausstrich, elektronische Zellzählung oder fluoreszenz-optische Zellzählung) zur Verfügung. Die Kulturen werden nach 24 und 48 Stunden im Zusammenhang mit der ermittelten somatischen Zellzahl begutachtet. Neben guten Wachstumseigenschaften für viele Mastitiserreger ermöglicht der nichtselektive Nährboden eine Bewertung der Probenqualität. Wenn zu allen vier Viertelgemelksproben einer Kuh, unabhängig von der jeweiligen Zellzahl, eine ähnliche Mischkultur vorliegt, kann dies als eine Folge einer nicht ordnungsgemäß durchgeführten Probengewinnung interpretiert werden. Es sollte jeweils nur zu der Milchprobe aus dem klinisch auffälligen Euterviertel oder den Milchproben mit erhöhter somatischer Zellzahl eine Reinkultur von Keimen vorliegen. Mischkulturen erschweren oder verhindern die Mastitisdiagnostik. Mischinfektionen von zwei Keimen können in seltenen Fällen vorkommen. Mischinfektionen von drei oder mehr Keimen unterschiedlicher Spezies sind sehr unwahrscheinlich. Der tatsächlich ursächliche Erreger kann in Einzelfällen vermutet, aber nur durch eine erneute Beprobung bestätigt werden (DVG 2009).

Die kulturelle Mastitisdiagnostik hat einige Vorteile: Sie ist kostengünstig, die Qualität der Proben und somit die Sicherheit der Diagnose können beurteilt werden und es werden nur lebende vermehrungsfähige Keime nachgewiesen, die weiteren Untersuchungen, wie zum Beispiel der Antibiotika-Empfindlichkeitsprüfung, unterzogen werden können. Ein Nachteil liegt in der Bebrütungszeit von mindestens 24 Stunden. Des Weiteren können bereits abgetötete Keime oder durch eine Antibiotika-Therapie zumindest beeinträchtigte Keime nicht nachgewiesen werden.

Aus diesem Grund wird empfohlen bereits vor dem Beginn der Therapie eine Probe für die bakteriologische Diagnostik zu entnehmen (BTK 2015).

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Eine Mastitisdiagnostik kann auch mittels PCR durchgeführt werden, hier reichen Fragmente der Erreger für einen Nachweis. Dieses Verfahren ist aber momentan noch sehr teuer und es fehlen noch Erfahrungswerte zur Auswertung der ermittelten Daten.

1.3.4.3. Keimdifferenzierung

Die typischen Wachstumseigenschaften der einzelnen Keime lassen eine vorläufige Identifizierung anhand der Koloniemorphologie, der Hämolyseeigenschaften und der Fähigkeit zur Äskulinspaltung zu. Diese vorläufige Einordnung wird durch weiterführende Untersuchungen bestätigt. Im Folgenden ist nur die Diagnose der in der Studie enthaltenen Staphylokokken und Streptokokken näher beschrieben. Bei Staphylokokken und Streptokokken handelt es sich jeweils um Gram-positive Kokken, diese beiden Gruppen können aber anhand der Koloniemorphologie und mittels Katalasetest deutlich voneinander abgegrenzt werden.

Staphylokokken sind Gram-positive und Katalase-positive Bakterien aus der Familie der Mikrococcaceae. Sie sind typische Kommensalen der Haut und Schleimhäute.

Derzeit sind 52 verschiedene Spezies und 28 Subspezies bekannt (BACTERIO 2016). Staphylokokken bilden bei aerober Bebrütung in der Regel große glänzende, manchmal aber auch raue Kolonien in verschieden Abstufungen von weiß, grau und gelb. Sie können nicht hämolysierend sein, eine feine oder breite Hämolysezone aufweisen oder eine zweizonige Hämolyse aufweisen. Die zweizonige Hämolyse wird nur von S. aureus gebildet und besteht aus einer von α-Hämolysinen gebildeten klaren Zone vollständiger Hämolyse direkt um die Kolonie und einer weiteren Zone unvollständiger Hämolyse, die von β-Hämolysinen gebildet wird. Staphylokokken weisen eine Vielzahl von Toxinen und Enzymen auf, besonders wichtig für die Einteilung der Staphylokokken ist die Koagulase. Mit Hilfe der Koagulase kann im Bereich der Mastitisdiagnostik zwischen den Koagulase-positiven S. aureus und der großen Gruppe der Koagulase-negativen Staphylokokken unterschieden werden.

Diese Unterscheidung ist wichtig, da es hinsichtlich der Therapie und

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Bekämpfungsmaßnahmen Unterschiede gibt. Eine alleinige Einordnung anhand der Koloniemorphologie ist nur möglich, wenn eine typische zweizonige Hämolyse vorliegt. Alle Staphylokokken, die nicht eine solche Hämolyse aufweisen, sollten einem Koagulasetest unterzogen werden, da es S. aureus- und KNS-Isolate mit und ohne Hämolyse gibt. Im Labor der MBFG werden alle Staphylokokken, auch die mit typischer S. aureus-Hämolyse, routinegemäß einem Koagulase-Test unterzogen. Die große Gruppe der KNS wird in der Mastitisdiagnostik bisher, in der Regel, nicht weiter differenziert. KNS verursachen meist subklinische Mastitiden, klinische Mastitiden treten nur selten auf. S. aureus kann sowohl chronische, subklinische als auch akute Mastitiden verursachen, wobei die akuten Fälle seltener vorkommen.

S. aureus bereitet aufgrund verschiedener Abwehrmechanismen große Probleme bei der Therapie. Die in vitro als wirksam klassifizierten Antibiotika können die Staphylokokken teilweise nicht erreichen und bekämpfen, da S. aureus sich in Phagolysosomen von Makrophagen zurückziehen kann oder sich mittels Koagulase vor dem Zugriff durch Antibiotika schützt.

Streptokokken bilden in der Regel zarte kleine gräuliche durchscheinende Kolonien.

Derzeit sind 113 Streptokokken-Spezies mit 22 Subspezies bekannt (BACTERIO 2016). Sie sind Gram-positiv und Katalase-negativ. Sie können eine α- (=vergrünende), β- (=vollständige) oder γ- (=keine) Hämolyse aufweisen. Es werden Äskulin-positive und Äskulin-negative Streptokokken unterschieden. Äskulin-positive Streptokokken können Äskulin, einen Zucker der Rosskastanie, spalten. Wenn dem unselektiven Nährboden Äskulin zugesetzt wurde, fluoresziert der Nährboden unter UV-Licht. Liegen Äskulin-positive Streptokokken vor, spalten diese das Äskulin und der Nährboden fluoresziert im Bereich um die Kolonien nicht mehr. S. uberis und Enterokokken sind Äskulin-positiv. Sie können zum Beispiel durch Subkultur auf einen selektiven Nährboden mit Zusatz von Galle weiter unterschieden werden. Die Enterokokken tolerieren den Gallezusatz und wachsen auf dem Nährboden, S. uberis wird jedoch gehemmt. Auch eine Differenzierung mit Hilfe eines Latexagglutinationstest mit dem Gruppenantigen D ist möglich. Enterokokken reagieren mit der Lancefieldgruppe D positiv. Bei den Äskulin-negativen Streptokokken handelt es sich um S. agalactiae, S. dysgalactiae und S. canis. Diese

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können ebenfalls mittels eines Latexagglutinationstest mit den Gruppenantigenen B (S. agalactiae), C (S. dysgalactiae) und G (S. canis) unterschieden werden. S. uberis spielt als umweltassozierter Erreger eine große Rolle im Mastitisgeschehen, da er ubiquitär in der Umgebung der Kühe vorkommt und diese sich immer wieder neu anstecken können. S. agalactiae und S. canis werden den kuhassozierten Erregern zugeordnet und werden daher hauptsächlich während des Melkvorganges übertragen. Es kann hierbei zur seuchenartigen Ausbreitung auf den ganzen Bestand innerhalb von kurzer Zeit kommen. Da die Infektion häufig subklinisch verläuft, wird sie oft erst spät anhand eines plötzlichen Anstiegs der in der Milchleistungsprüfung (MLP) ermittelten Zellzahlen festgestellt. S. canis wird nur selten nachgewiesen. Bei S. dysgalactiae wird eine Übertragung sowohl über die Umwelt als auch über den Melkvorgang diskutiert.