Vergleichende Untersuchung der Empfindlichkeit gegenüber Tylosin mittels Agardiffusion und Bouillon-Mikrodilution

Da es zur Empfindlichkeit der typischen Mastitiserreger gegenüber Tylosin kaum Daten gibt und auch wenig über die Korrelation der Hemmhofdurchmesser zu den MHK-Werten bekannt ist, wurden in dem zweiten Teil der Studie insgesamt 525 Staphylokokken- und Streptokokken-Isolate, die aus der Milch von an Mastitis erkrankten Kühen gewonnen wurden, hinsichtlich ihrer In-vitro-Empfindlichkeit gegenüber Tylosin und Erythromycin untersucht.

Die überwiegende Mehrzahl der Isolate wurde im Rahmen des nationalen Resistenzmonitorings GERM-Vet in den Jahren 2008 bis 2010 in Deutschland gesammelt. Einige der Isolate stammen aus der Routinediagnostik der MBFG. Es wurde jeweils nur ein Isolat pro Betrieb verwendet. Stämme dieser Kollektion wurden in der Vergangenheit auch schon weitgehend für Studien zur Oxacillin-Empfindlichkeit von KNS und zur Ermittlung klinischer Grenzwerte für Cefoperazon verwendet (FEßLER et al. 2010b, 2012, 2016). Dieses Kollektiv setzte sich zusammen aus 112 S. aureus, 110 KNS, 101 S. agalactiae, 100 S. dysgalactiae und 102 S. uberis.

Alle Isolate wurden mittels Bouillon-Mikrodilution und mittels Agardiffusionstest mit 30 µg Tylosin-Testplättchen untersucht. Die Testungen erfolgten gemäß den Vorgaben des CLSI-Dokuments VET01-A4 (CLSI 2013a). Zusätzlich wurde Erythromycin als Vergleichssubstanz in der Bouillon-Mikrodilution und der Agardiffusion unter Verwendung von 15 µg Testplättchen eingesetzt. Die ermittelten Daten für MHK und HHD wurden jeweils mit Hilfe eines Scattergrams analysiert (JORGENSEN et al. 1999). Pro Spezies wurden je ein Scattergram für Erythromycin und eines für Tylosin erstellt (Kapitel 3, Kapitel 4).

Da für die Testung von Erythromycin CLSI-anerkannte Grenzwerte zur Verfügung stehen, wurden die für Erythromycin ermittelten Werte entsprechend als sensibel, intermediär und resistent und „minor error“, „major error“ und „very major error“

eingestuft (CLSI 2013b; siehe Kapitel 1.4.1.)

63 5.2.1. Verteilung von MHK- und HHD-Werten

Die Ergebnisse aller fünf Bakteriengruppen waren bimodal verteilt.

A. Staphylococcus aureus

Die S. aureus-Isolate zeigten Tylosin-MHK-Werte von 1 µg/mL (n=46), 2 µg/mL (n=52), 4 µg/mL (n=3) und ≥256 µg/mL (n=11). Die S. aureus-Isolate mit MHK-Werten von ≥256 µg/mL wiesen keine Hemmhöfe auf. Die Hemmhöfe der anderen Isolate zeigten Durchmesser von 20 - 29 mm um die 30 µg Tylosin-Testplättchen.

Zwölf Isolate wurden mit beiden Methoden als Erythromycin-resistent beurteilt. Die sensiblen Isolate hatten MHK-Werte von 0,25 und 0,5 µg/mL und Hemmhofdurchmesser von 24 - 32 mm. Insgesamt zeigten die Isolate für Tylosin etwas höhere MHK-Werte und kleinere HHD-Werte. Allerdings war die Verteilung der Isolate ähnlich (Kapitel 3). Tylosin-Testplättchen. Es wurden 13 Isolate mit beiden Methoden als Erythromycin-resistent erkannt. Zwei der Isolate wiesen hierbei einen MHK von 32µg/mL auf, während die anderen elf Isolate einen MHK-Wert von ≥64 µg/mL zeigten. Für Erythromycin zeigten die mittels Agardiffusion als sensibel beurteilten Isolate, MHK-Werte von 0,25 - 2 µg/mL. Damit wurden sieben Isolate als „minor error“ klassifiziert (Kapitel 3).

Auch bei der Tylosin-Empfindlichkeitstestung zeigten die KNS-Isolate eine größere Spanne an MHK-Werten als die S. aureus-Isolate (Kapitel 3).

64 C. Streptococcus agalactiae

Die S. agalactiae-Isolate zeigten Tylosin MHK-Werte von 0,12 µg/mL (n=1), 0,25 µg/mL (n=4), 0,5 µg/mL (n=11), 1 µg/mL (n=65), 2 µg/mL (n=4), 4 µg/mL (n=1), 128 µg/mL (n=3) und ≥256 µg/mL (n=12). Alle Isolate mit einem Tylosin MHK-Wert von 128 µg/mL und höher zeigten keinen Hemmhof um das mit 30 µg beladene Tylosin-Testplättchen. Die anderen Isolate wiesen Hemmhofdurchmesser von 18 bis 27 mm auf. Fünfzehn Isolate konnten mittels beider Methoden als resistent für Erythromycin beurteilt werden. Insgesamt 17 Isolate wurden nur anhand ihrer Erythromycin-MHKs als resistent beurteilt, zwölf dieser Isolate wiesen einen MHK-Wert von ≥64 µg/mL auf, die anderen fünf hatten einen MHK-MHK-Wert von 4 µg/mL (n=4) bzw. 8 µg/mL (n=1). Die als sensibel beurteilten Isolate hatten Erythromycin-MHKs von 0,03 - 0,12 µg/mL und HHD-Werte im Bereich von 24 - 33 mm. Zwei der Isolate die anhand ihres mit Erythromycin-MHK-Werts von 4 µg/mL als resistent beurteilt wurden, wiesen einen Hemmhofdurchmesser von 16 mm auf, welcher als intermediär zu werten ist. Diese beiden Isolate wurden daher als „minor error“

eingestuft (Kapitel 4).

D. Streptococcus dysgalactiae

Die S. dysgalactiae-Isolate wiesen Tylosin-MHK-Werte von 0,25 µg/mL (n=57), 0,5 µg/mL (n=31), 1 µg/mL (n=2), 4 µg/mL (n=1), 64 µg/mL (n=1) und ≥256 µg/mL (n=8) auf. Keines der Isolate mit einem Tylosin MHK von ≥256 µg/mL wies einen Hemmhof um das mit 30 µg beladene Tylosin-Testplättchen auf. Die anderen Isolate zeigten Hemmhofdurchmesser von 16 bis 27 mm. Elf der Isolate wurden nur anhand ihres MHK-Werts von ≥64 µg/mL (n=10) oder 2 µg/mL (n=1) als resistent gegenüber Erythromycin beurteilt. Zehn dieser Isolate konnten mit beiden Methoden als resistent beurteilt werden. Die Erythromycin-sensiblen Isolate wiesen MHKs von 0,06 - 0,25 µg/mL und HHD-Werte von 24 - 30 mm. Ein Isolat wurde als „minor error“

eingestuft, da der Erythromycin-MHK von 2 µg/mL als resistent und der HHD von 18 mm als intermediär zu werten waren (Kapitel 4).

65 E. Streptococcus uberis

Die S. uberis-Isolate zeigten Tylosin-MHK-Werte von 0,25 µg/mL (n=1), 0,5 µg/mL (n=17), 1 µg/mL (n=74), 2 µg/mL (n=5) und ≥256 µg/mL (n=5). Alle Isolate mit einem Tylosin MHK von ≥256 µg/mL zeigten keinen Hemmhof um das mit 30 µg beladene Tylosin-Testplättchen. Die anderen Isolate hatten Hemmhofdurchmesser von 19 bis 28 mm. Sechs Isolate wurden mit beiden Methoden als Erythromycin-resistent beurteilt und hatten MHK-Werte von ≥64 µg/mL (n=5) und 8 µg/mL (n=1). Nur anhand des MHK-Wertes wurden insgesamt 18 Isolate als Erythromycin-resistent beurteilt. Zwölf dieser Isolate wiesen einen MHK-Wert von 2 µg/mL (n=1) oder 1 µg/mL (n=11) auf. Die MHK-Werte der Erythromycin-sensiblen Isolate lagen im Bereich von 0,03 - 0,12 µg/mL und hatten HHD-Werte von 26 - 35 mm. Vier Isolate wurden als „minor error“ klassifiziert und elf Isolate mit MHK 1 µg/mL und HHD-Werten von 21 - 23 mm fielen in die „very major error“-Kategorie (Kapitel 4).

5.2.2. Erythromcin-resistente Isolate

Insgesamt wurden von den untersuchten 525 Isolaten 71 Isolate anhand ihres MHK-Werts als resistent für Erythromycin bewertet. Mit beiden Methoden konnten 56 Isolate als resistent für Erythromycin beurteilt werden. Bei den Staphylokokken wurden zwölf S. aureus- (10,7%) bzw. 13 KNS-Isolate (11,8%) als resistent gegenüber Erythromycin gewertet, allerdings wurden dem Kollektiv jeweils zehn Makrolid-resistente MRSA bzw. MR-KNS-Isolate hinzugefügt. Wenn diese nicht mitbetrachtet werden, sinkt der Anteil der Erythromycin-resistenten Isolate auf zwei (2,0%) S aureus-, bzw. auf drei (3,0%) KNS-Isolate. Bei den Streptokokken wurden den zu untersuchenden Gruppen keine zusätzlichen resistenten Isolate hinzugefügt.

Fünfzehn S. agalactiae- (14,9%), zehn S. dysgalactiae- (10,0%) und sechs S. uberis-Isolate (5,9%) wurden mit beiden Methoden als resistent gegenüber Erythromycin beurteilt. Das entspricht 10,7% bzw. 7,1% (ohne die hinzugefügten resistenten Staphylokokken) aller im Rahmen dieser Studie untersuchten Isolate (Kapitel 3 u. 4).

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THOMAS und Kollegen (2015) geben bei einer Sammlung von Isolaten aus acht europäischen Ländern eine Resistenzrate von 0,8% für S. aureus und 18,8% für S. uberis an. HENDRIKSEN und Kollegen (2008) haben in Kollektionen die ebenfalls aus mehreren europäischen Ländern zusammengestellt wurden eine Resistenzrate von bis zu 22,2% für S. uberis und bis zu 17% für S. dysgalactiae ermittelt. In einer Studie über die Jahre 2002 bis 2010 ermittelten LINDEMAN und Kollegen (2013) in Nordamerika einen Anteil von Erythromycin-resistenten Isolaten von 2,0 - 18,8% für S. agalactiae, 1,6 8,1% für S. dysgalactiae, 10,8 27,9% für S. uberis und von 0,3 3,7% für S. aureus. LÜTHJE und SCHWARZ (2006) stellten bei KNS-Isolaten aus subklinischer Mastitis eine Resistenzrate von 7,4% fest.

5.2.3. Fehlerrate

Die Summe der „major-„ und „very major error“ sollte einen Wert von 1% nicht übersteigen, außerdem sollten nicht mehr als 5% der Isolate in die „minor error“-Kategorie fallen (BRUNDEN et al.1992). Bei S. aureus wurden alle Isolate mit beiden Methoden einheitlich beurteilt. Bei den KNS Isolaten wurden sieben Isolate in die Kategorie „minor error“ (6,4%). eingeteilt. Bei S. agalactiae lag die Anzahl der Fehler mit zwei Isolaten als „minor error“ bei 2,0%. Diese Rate lag mit einem Isolat bei S. dysgalactiae bei 1,0%. Die „minor error“ Rate für die S. uberis-Isolate gleicht mit vier Isolaten und 3,9% der Rate der anderen Streptokokken. Allerdings fielen hier mit elf Isolaten (10,8%) eine sehr hohe Anzahl an Isolaten in die „very major error“

Kategorie. Die Testung dieser Isolate wurde mehrfach wiederholt und die ermittelten Ergebnisse bestätigt.

5.2.4. MHK50- und MHK90-Werte

Um eine Resistenzentwicklung frühzeitig erkennen zu können werden in Monitoring-programmen häufig MHK50- und MHK90-Werte verwendet. Tabelle 5.2.4. zeigt die MHK50- und MHK90-Werte der im Rahmen der Studie untersuchten Isolate. Auffällig

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ist die Abweichung der MHK90-Werte für S. agalactiae von den anderen Isolaten, hier lag eine besonders deutliche bimodale Verteilung vor.

Tab. 5.2.4. MHK50- und MHK90- Werte für Tylosin und Erythromycin.

(MHK50- bzw. MHK90-Wert ohne die zugefügten MRSA- bzw. MR-KNS-Isolate).

Keim Wirkstoff MHK₅₀

5.3. Molekulare Untersuchungen zum Vorliegen von