Tierärztliche Hochschule Hannover
Einfluss von Zell- und Bakterienkulturüberständen auf die In-vitro-Differenzierung
boviner Makrophagen
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von
Christine Gesterding, geb. Schütz Heidelberg
Hannover 2015
I
Wissenschaftliche Betreuung: Apl. Prof. Dr. Hans-Joachim Schuberth Arbeitsgruppe Immunologie
Tierärztliche Hochschule Hannover
1. Gutachter: Apl. Prof. Dr. Hans-Joachim Schuberth
2. Gutachter: Apl. Prof. Dr. Ralph Goethe
Tag der mündlichen Prüfung: 13. Mai 2015
Gefördert mit Mitteln des Bundesministeriums für Bildung und Forschung (EMIDA ERA-Net: iPUD)
II
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung und Zielsetzung 1
2 Literaturübersicht 3
2.1 Mononukleäre Zellen und deren Rolle im Entzündungsgeschehen 3
2.1.1 Monozyten und Monozyten-Subpopulationen 3
2.1.2 Makrophagen und Makrophagenplastizität 4
2.1.3 Ausgewählte Oberflächenantigene von Monozyten und
Makrophagen 6
2.1.4 Das Chemokin CCL5 8
2.2 Bildung Reaktiver Sauerstoffspezies 9
2.3 Die Transitperiode 10
2.3.1 Monozytäre Zellen im graviden Uterus 12
2.3.2 E.-coli-Infektionen des Uterus 14
2.3.3 E.-coli-Mastitis 15
2.4 Das E.-coli-Sekretom 17
3 Material und Methoden 20
3.1 Versuchstiere 20
3.2 Gewinnung einzelner Leukozytenpopulationen des Blutes 21
3.2.1 Gewinnung von mononukleären Zellen 21
3.2.2 Gewinnung von Monozyten 21
3.2.3 In-vitro-Generierung von Makrophagen aus Blutmonozyten 22
3.2.4 In-vitro-Stimulation boviner Makrophagen 22
3.3 Durchflusszytometrie 24
3.3.1 Phänotypisierung boviner Makrophagen mittels
Membranimmunfluoreszenz 25
3.3.2 Messung reaktiver Sauerstoffspezies boviner Makrophagen 26
3.3.3 Intrazelluläre Kalziummessung 27
3.4 Quantitative real time Polymerasekettenreaktion 29 3.4.1 Aufbereitung von messengerRNA aus bovinen Makrophagen 29
III
3.4.3 Synthese von komplementärer DNA durch Reverse
Transkription 30
3.5 Prinzip der quantitativen real time Polymerasekettenreaktion 31
3.5.1 Probenmessung 32
3.6 Statistische Auswertung 34
4 Ergebnisse 36
4.1 Einfluss von Zell- und Bakterienkulturüberständen auf Monozyten 36 4.1.1 Induktion eines Kalziumeinstromes in Monozyten durch
Überstände von uterinen Zellkulturen 36
4.1.2 Induktion eines Kalziumeinstromes in Monozyten durch
Überstände verschiedener E.-coli-Isolate 38
4.2 Einfluss von Zell- und Bakterienkulturüberständen auf Phänotyp
und Funktionalität in-vitro-differenzierter Makrophagen 40
4.2.1 Zellkulturüberstände 40
4.2.2 E.-coli-Kulturüberstände 42
4.3 Einflüsse auf das Genexpressionsmuster in-vitro-differenzierter
Makrophagen 50
4.3.1 Reifung unter E.-coli-Kulturüberständen führte zu einer
verstärkten Genexpession 50
4.3.2 Reifung unter CCL5 führte zu einer verminderten
Genexpression 52
4.4 Eigenschaften in-vitro-differenzierter Makrophagen der
Transitperiode 53
4.4.1 Phänotypische Eigenschaften in-vitro-differenzierter
Makrophagen 53
4.4.2 Funktionelle Eigenschaften in-vitro-differenzierter Makrophagen 56
5 Diskussion 59
5.1 Induktion eines Kalziumeinstroms in Monozyten durch Bakterien-
und Zellkulturüberstände 59
5.2 Einfluss von Bakterien- und Zellkulturüberständen auf die
In-vitro-Differenzierung von Monozyten zu Makrophagen 62
IV
5.3 Einflüsse von CCL5 und E.-coli-Überständen auf die
Genexpression in-vitro-differenzierter Makrophagen 66 5.4 Eigenschaften in-vitro-differenzierter Makrophagen der
Transitperiode 68
6 Zusammenfassung 73
7 Summary 76
8 Literaturverzeichnis 78
9 Anhang 96
9.1 Geräte 96
9.2 Material 97
9.2.1 Klinikbedarf 97
9.2.2 Laborbedarf 97
9.2.3 Reagenzien 98
9.2.4 Antikörper 100
9.2.5 Kulturmedien, Puffer und Lösungen 100
9.2.6 Genspezifische Primer für die qPCR 102
9.3 Verzeichnis der verwendeten Abbildungen 103
9.4 Verzeichnis der verwendeten Tabellen 105
V
VI
Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen
°C Grad Celsius
µ Mikro (x 10-6)
µm Mikrometer
A. dest. Aqua destillata (destilliertes Wasser)
AE-Läsionen Attaching-and-effacing-Läsionen (typische, durch Anheftung verschiedener Escherichia-coli-Bakterien verursachte Läsionen des Darmepithels)
APC Antigen Presenting Cell (Antigenpräsentierende Zelle) APEC Aviär-pathogene Escherichia coli
Arg 1 Arginase 1
A. tridest. Aqua tridestillata (dreifach destilliertes Wasser) ANOVA Analysis of Variance (Varianzanalyse)
BCS Body Condition Score (Körperkonditionsindex)
bo Bovin
B. pertussis Bordetella pertussis BSA Bovines Serumalbumin bzw. Beziehungsweise
ca. Circa
Ca2+ Kalzium
CCL β-Chemokinligand mit zwei Cysteinmolekülen in Folge
CCR CC-Chemokinrezeptor
CD Cluster of Differentiation (Unterscheidungsgruppen) cDNA Complementary Desoxyribonucleic Acid (komplementäre
Desoxyribonukleinsäure)
cm Zentimeter
cM Klassische Monozyten
CMT California Mastitis Test CO2 Kohlenstoffdioxid
CR Complement Receptor (Komplementrezeptor)
Ct Cycle threshold, Beginn des exponentiellen Wachstums CXCL α-Chemokinligand mit zwei Cysteinmolekülen, die durch eine
beliebige Aminosäure getrennt werden DAEC Diffus-adhärente Escherichia coli
DAMP Damage-Associated Molecular Patterns (Zellschaden-assoziierte molekulare Muster)
DHR Dihydrorhodamin
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonucleic Acid (Desoxyribonukleinsäure) dNTPs Desoxynucleotide Triphosphates (Desoxyribonukleotid-
Triphosphate) DTT Dithiothreitol
EAEC Enteroaggregative Escherichia coli E. coli Escherichia coli
EDTA Ethylendiamintetraacetat
EHEC Enterohämorrhagische Escherichia coli
VII
Epi. LPS LPS-stimulierte Epithelzellüberstände Et al. Et alii (lateinisch: und andere)
ETEC Enterotoxische Escherichia coli
ExPEC Extraintestinal-pathogene Escherichia coli
FcR Fragment crystallisable Receptor (Immunglobulinrezeptor) FCS Fetal Calf Serum (fetales Kälberserum)
FFS Freie Fettsäuren
FITC Fluoresceinisothiocyanat
FL1, 2, 3, 4 Messkanäle des Durchflusszytometers für emittierte Fluoreszenz FL1 = Grünfluoreszenz, 530 ± 15 nm
FL2 = Orangefluoreszenz, 585 ± 20 nm, FL3 = Rotfluoreszenz, > 650 nm
FL4 = Violettfluoreszenz, 675 ± 12,5 nm Fluo-4 Acetoxymethyl Ester Kalzium Indikator FMLP N-formyl-methionyl-leucyl-methionin
FSC Forward Scatter (Vorwärtsstreulicht), Messparameter des Accuri C6®
g Gramm
GCSF Granulozyten-Kolonie stimulierender Faktor gDNA Genomic DNA (genomische DNA)
GH Growth Hormone (Wachstumshormon)
GMCSF Granulozyten-Makrophagen-Kolonie stimulierender Faktor
h Hora (Stunde)
HBSS Hank’s Balanced Salt Solution hCG Humanes Choriongonadotropin
hlyA Hämolysin α
HO- Hydroxylradikal
H2O2 Hydrogenperoxid
hu Human
IFN Interferon
Ig Immunglobulin
IGF Insulin-like Growth Factor (Insulinähnlicher Wachstumsfaktor)
IL Interleukin
intM Intermediäre Monozyten ITGAM Integrin alpha M
kDa Kilodalton, Einheit der Molekülmasse
L Liter
LEE Locus of Enterocyte Effacement, Pathogenitätsinsel LPS Lipopolysaccharid
m Milli (x 10-3)
MACS Magnetic Cell Separation (magnetische Zellseparation) MdM Monocyte derived Macrophages (Monozyten-gereifte
Makrophagen)
MFI Mittlere Fluoreszenzintensität
VIII
MHC Major Histocompatibility Complex (Haupthistokompatibilitätskomplex)
MIF Membranimmunfluoreszenz
Min. Minute(n)
MLEE Multi-Locus-Enzyme-Elektrophoresis MLST Multilokus-Sequenztypisierung
mm Millimeter
MNC Mononuclear Cells (mononukleäre Zellen, hier: des Blutes)
mol Mol
MPS Mononukleäres Phagozytosesystem mrc1 Mannose Rezeptor C Typ 1
mRNA Messenger Ribonucleic Acid (Boten-Ribonukleinsäure)
mu Murin
n Nano (x 10-9)
n = Fallzahl, Anzahl der Einzelbeobachtungen bei der Berechnung des Mittelwertes
NaCl Natriumchlorid
NADPH Nikotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat ncM Nicht-klassische Monozyten
NEB Negative Energiebilanz
NEFA Nonesterified Fatty Acids (unveresterte Fettsäuren) NK-Zelle Natürliche Killerzelle
NMEC Neugeborenenmeningitis-assoziierte E. coli
NO Stickstoffmonoxid
NOS Nitric Oxide Synthase (Stickstoffmonoxid Synthase)
O2 Sauerstoff
O22-
Peroxid-Anion O2-
Superoxid-Anion
p (-Wert) Probability Value, Irrtumswahrscheinlichkeit bei der Analyse der Ähnlichkeit zweier Datengruppen
PAI Pathogenitätsinsel
PAF Plättchenaktivierender Faktor
PAMP Pathogen-Associated Molecular Pattern (Pathogen-assoziierte molekulare Muster)
PBS Phosphate Buffered Saline (Phosphat-gepufferte Salzlösung) PCR Polymerase Chain Reaction (Polymerase-Kettenreaktion)
PJ Propidiumjodid
PMN Polymorphonuclear Leukocytes (polymorphkernige Leukozyten)
po Porzin
p.p. Post partum (nach der Geburt)
PRR Pattern Recognition Receptor (Mustererkennender Rezeptor) qPCR Quantitative real time PCR (quantitative Echtzeit-PCR)
R2 Determinationskoeffizient
RANTES Regulated upon Activation Normal T cell Expressed and Secreted (reguliert durch Aktivierung, von normalen T-Zellen exprimiert und sezerniert)
RNA Ribonucleic Acid (Ribonukleinsäure)
IX
S. uberis Streptococcus uberis
Sec Secretory Pathway (sekretorischer Weg)
Sek. Sekunde(n)
SepEC Sepsis-assoziierte Escherichia coli
SEM Standard Error ot the Mean, Standardfehler, errechnet sich aus der Standardabweichung geteilt durch die Quadratwurzel der Fallzahl (n) der Stichprobe
SN Supernatant (Überstand)
SOD Superoxiddismutase
sog. Sogenannt
SSC Side Scatter (Seitwärtsstreulicht), Messparameter des Accuri C6®
STB Eschrichia-coli-Enterotoxin B Str. Stromazellüberstände
Str. LPS LPS-stimulierte Stromazellüberstände TLR Toll-like Receptor (Toll-ähnlicher Rezeptor) Th-Zelle T-Helferzelle
TNF Tumornekrosefaktor T. pyogenes Trueperella pyogenes uNK-Zelle Uterine natürliche Killerzelle UPEC Uropathogene Escherichia coli
UXT Ubiquitously Expressed Transcript Protein (ubiquitär exprimiertes Transkriptionsprotein)
VF Virulenzfaktor
x g Multipliziert mit der Gravitationsbeschleunigung (9,81 m/s2)
z.B. Zum Beispiel
Einleitung und Zielsetzung
1
1 Einleitung und Zielsetzung
Nach der Geburt eines Kalbes entwickelt ein nicht unerheblicher Teil der Kühe eine Metritis, Endometritis oder Mastitis. Das Auftreten dieser klinisch oder subklinisch verlaufenden Entzündungserkrankungen korreliert mit diversen Faktoren wie Geburtsstress, einer Energieunterversorgung nach Einsetzen der Milchleistung und genetischen Dispositionen. Zudem wird angenommen, dass die für die Trächtigkeit erforderliche anti-inflammatorische Ausrichtung des Immunsystems einer adäquaten Antwort auf Pathogene, die post partum (p.p.) in die geöffnete Cervix und Strichkanäle einwandern können, im Wege steht. Die Folgen sind großzügige Antibiotikaeinsätze und Behandlungskosten sowie Begleitschäden wie verminderte Fruchtbarkeit, reduzierte Milchleistung und ein herabgesetztes Tierwohl. Die kritische Zeit, in der viele Faktoren zusammenspielen, die für die Entstehung postpartaler Infektionserkrankungen verantwortlich sind, nennt sich Transitperiode und wird zumeist definiert als die Zeitspanne von 21 Tagen vor bis 21 Tagen nach der Geburt.
Sind bakterielle Erreger in das Uterus- oder Euterlumen eingedrungen, erkennen Toll-like Rezeptoren (TLRs) auf den Gewebezellen des Wirtstieres pathogen- assoziierte Bestandteile wie bakterielle Desoxyribonukleinsäure (DNA), Lipide und Lipopolysaccharide (LPS) und sezernieren daraufhin Zytokine, die Entzündungszellen anlocken (SHELDON et al. 2009). Neben den neutrophilen Granulozyten sind Monozyten die ersten Zellen am Entzündungsort. Nach ihrer Bildung im Knochenmark zirkulieren sie einige Tage im Blut, bevor sie ins Gewebe einwandern und dort zu Makrophagen oder dendritischen Zellen reifen.
Makrophagen nehmen Schlüsselrollen in der Initialphase einer Entzündung aber auch für die Beendigung von Entzündungsreaktionen ein und sind für die Feinregulation des Entzündungsverlaufs verantwortlich. Je nach Stimulation können morphologisch und funktionell unterschiedliche Makrophagen entstehen, wobei über die genauen Mechanismen der Aktivierung und Steuerung der Differenzierung noch Unklarheit herrscht. Es ist bereits bekannt, dass die Einwanderung ins Gewebe sowie die Differenzierung in Makrophagen von Chemokinen gesteuert wird.
Ziel der vorliegenden Arbeit ist es zu prüfen, welchen Einfluss das umliegende Gewebe sowie bakterielle Erreger auf die Monozyten-Makrophagen-Differenzierung ausüben. So soll die unmittelbare Reaktion von Monozyten auf Überstände von Stromazell-Kulturen sowie von Escherichia coli (E. coli) in vitro erfasst werden.
Außerdem sollen unter diesen Überständen gereifte Makrophagen auf ihre phänotypischen und funktionellen Eigenschaften sowie ihre Genexpression untersucht werden. Ein Teilaspekt dieser Arbeit ist die Charakterisierung der Zusammensetzung myeloider Zellen bei Kühen in der Transitperiode. Es wird analysiert, ob die zu verschiedenen Zeitpunkten in der Transitperiode isolierten Monozyten zu phänotypisch und funktionell unterschiedlichen Makrophagen
2
heranreifen oder ob die Zellen eine unterschiedliche Reaktivität auf verschiedene E.-coli-Kulturüberstände aufweisen. Eine Analyse nach Zeitpunkt in der Transitperiode, dem Body Condition Score (BCS) der Tiere, der Laktationszahl und dem postpartalen Gesundheitsstatus sollen zeigen, ob diese Parameter einen prädiktiven Charakter für die Entstehung postpartaler Infektionserkrankungen darstellen. Langfristig soll diese Studie zu neuen Ansätzen der Metritis- und Mastitisprävention durch eine gezielte Modulation der Monozyten-Makrophagen- Differenzierung führen.
Literaturübersicht
3
2 Literaturübersicht
2.1 Mononukleäre Zellen und deren Rolle im Entzündungsgeschehen 2.1.1 Monozyten und Monozyten-Subpopulationen
Monozyten sind Vorläuferzellen von Makrophagen und entstehen im Knochenmark, wo sie aus Monoblasten über die Zwischenstufe der Promonozyten zu Monozyten reifen und anschließend in den Blutstrom gelangen. Dort zirkulieren sie für einige Tage und machen etwa 5 % der Leukozyten-Gesamtpopulation aus. Sie spielen eine wichtige Rolle als Effektorzellen, die Zelldebris und einwandernde Pathogene phagozytieren sowie als regulatorische Zellen, da sie die Fähigkeit besitzen Antigen zu präsentieren und die Immunantwort durch die Sekretion von Zytokinen (Interleukin (IL) 6, CXCL8, IL1β, Tumornekrosefaktor (TNF) α, Interferon (IFN) α, β) zu modulieren. Neben den neutrophilen Granulozyten sind auch Monozyten in der Lage, ganz früh im Rahmen einer Infektion ins Gewebe auszuwandern, wo sie unter dem Einfluss von Erregerbestandteilen und Zytokinen zu Makrophagen reifen (AUFFRAY et al. 2009). Anhand der Expressionsstärke der Oberflächenmarker Cluster of Differentiation (CD) 14 und 16 lassen sich humane (ZIEGLER-HEITBROCK et al.
2010; WONG et al. 2012) sowie bovine Monozyten in klassische (cM, CD14++/CD16), intermediäre (intM, CD14++/CD16+) und nicht-klassische (ncM, CD14+/CD16++) Subpopulationen unterteilen, wobei cM die größte Subpopulation darstellen (89 %).
Da bovine ncM eine reduzierte Phagozytosekapazität, eine geringere Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) sowie eine verminderte messengerRNA (mRNA) -Expression von CXCL8, CXCL1 und IL1B nach LPS-Stimulation aufweisen, werden ihnen überwiegend anti-inflammatorische Eigenschaften zugesprochen (HUSSEN et al. 2013).
Bei Menschen wurden bei vielen Erkrankungen wie Sepsis, Tuberkulose, Hepatitis, Rheuma und Asthma erhöhte Zahlen intermediärer und nicht-klassischer Monozyten im Blut festgestellt (SKRZECZYÑSKA et al. 2002; MONIUSZKOA et al. 2009;
CASTAÑO et al. 2011; ZHANG et al. 2011; ROSSOL et al. 2012). Zudem wiesen klinisch erkrankte Patienten besonders häufig erhöhte Konzentrationen nicht- klassischer Monozyten auf, während bei subklinisch erkrankten Patienten der Anteil intermediärer Monozyten erhöht war. Dies ließ WONG et al. (2012) vermuten, dass die Subpopulationen unterschiedliche Aufgaben erfüllen und dass humane intM möglicherweise Entzündungsreaktionen vorantreiben, während ncM an deren Regulation beteiligt sind. Bisher wurden nur wenige Studien an bovinen Zellen durchgeführt, jedoch wurden bei subklinisch an Endometritis erkrankten Kühen keine Unterschiede in der Zusammensetzung der Subpopulationen festgestellt (MAASS 2013).
4
2.1.2 Makrophagen und Makrophagenplastizität
Grundsätzlich beginnen Entzündungsreaktionen mit dem Erkennen molekularer Gefahrensignale. Dies können zum einen Zellkern- und Zytoplasmabestandteile sein, die bei Gewebeschäden aus nekrotischen Zellen freigesetzt werden und als Damage-Associated Molecular Patterns (DAMPs) bezeichnet werden; zum anderen können es Erreger sowie deren Bestandteile (z.B. LPS), sogenannte (sog.) Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs), sein. Die Gefahrensignale können das Komplementsystem direkt aktivieren oder von Pattern Recognition Receptors (PRRs) (u.a. Scavenger Rezeptoren, TLRs), die sich auf Makrophagen und vielen anderen Körperzellen befinden, erkannt werden. Eine Erkennung führt zur Freisetzung inflammatorischer Zytokine und dem Anstoß von Entzündungskaskaden.
Angelockt von Pathogenen und Entzündungsmediatoren wandern Monozyten ins Gewebe aus und differenzieren dort zu Makrophagen. Diese sind circa (ca.) 15 µm große, runde Zellen mit einem zentralen, runden bis bohnenförmigen Kern, einem hohen Zytoplasmagehalt sowie vielen Mitochondrien und Lysosomen. Häufig bilden sie Dendriten-ähnliche Zytoplasmaausläufer aus.
Als Bestandteile des Mononukleären Phagozytosesystems (MPS) haben Makrophagen zahlreiche Aufgaben wie Phagozytose, Entfernung von Zelldetritus, Antigenpräsentation, Initiation und Regulation von Entzündungsreaktionen und Wundheilung. Ermöglicht wird diese Fähigkeit zur Ausübung zahlreicher Funktionen durch die so genannte Makrophagenplastizität, also die Fähigkeit von ins Gewebe eingewanderten Monozyten, sich abhängig von Umgebungsfaktoren zu phänotypisch und funktionell unterschiedlichen Makrophagen-Subtypen zu entwickeln.
Umgebungsfaktoren können zum einen PAMPS, zum anderen körpereigene Substanzen wie Chemokine und Zytokine sein. Um einen Überblick über die verschiedenen Subtypen zu wahren, werden Makrophagen anhand der Aktivierung durch T-Helferzellen (Th) 1- und Th2-Zellen in klassisch aktivierte M1- und alternativ aktivierte M2-Makrophagen eingeteilt (GORDON 2003; DÜVEL et al. 2012). Da sich herausstellte, dass es unter den M2-Makrophagen wiederum unterschiedliche Subtypen gibt, bevorzugen andere Autoren ein Modell der Einteilung nach funktionellen Eigenschaften in Makrophagen der Wirtsabwehr (klassisch aktiviert) und Makrophagen der Wundheilung und Immunregulation (alternativ aktiviert) (EDWARDS et al. 2006; MOSSER u. EDWARDS 2008). Eine Unterteilung in klassisch und alternativ aktivierte Makrophagen haben beide Modelle gemeinsam.
2.1.2.1 Makrophagen der Wirtsabwehr
Ein Priming mit IFNγ und eine anschließende Stimulation mit bakteriellem Endotoxin (z.B. LPS) führen zu einer klassischen Aktivierung und Reifung zu M1-Makrophagen.
Diese zeichnen sich durch mikrobizide und tumorizide Eigenschaften aus sowie eine
Literaturübersicht
5
verstärkte Expression inflammatorischer Mediatoren wie IL1B, TNFα, IL12, Stickstoffmonoxid Synthase (NOS) 2, CXCL5 und CCL2 (O'SHEA u. MURRAY 2008;
DÜVEL et al. 2012). Sie weisen zudem eine erhöhte Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies und Calprotectin auf. IFNγ wird in vivo von Th1-Lymphozyten oder Natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) sezerniert (MOSSER u. EDWARDS 2008). Auch bestimmte TLR-Liganden sind durch Induktion von TNF und IFNβ direkt in der Lage Makrophagen klassisch zu aktivieren (YAMAMOTO et al. 2003). Aufgrund ihres inflammatorischen Zytokinprofils werden klassisch aktivierte Makrophagen als Makrophagen der Wirtsabwehr bezeichnet. So sind Menschen mit angeborenen Defekten der IL12/IFNγ-Achse beispielsweise sehr anfällig für bakterielle und virale Infekte sowie Protozoeninfektionen und sterben bereits im Kindesalter (FILIPE- SANTOS et al. 2006). Morphologisch unterscheiden sich bovine M1-Makrophagen durch einen runden bis spindelförmigen Zellkörper und einen nierenförmigen Kern von den größeren und komplexer gestalteten M2-Makrophagen, die mit einem runden, zentralen Kern und auffallenden Zytoplasmaausläufern ausgestattet sind.
Die unterschiedlichen Morphologien ließen DÜVEL et al. (2012) einen unterschiedlichen Metabolismus der Zellen vermuten.
2.1.2.2 Makrophagen der Wundheilung
Eine alternative Aktivierung zu M2-Makrophagen wird durch ein Priming mit IL4 oder IL13 erzielt und lässt Makrophagen entstehen, die große Mengen Arginase 1 (Arg 1) und IL10 produzieren und den Oberflächenmarker CD163 verstärkt exprimieren (GORDON 2003). In-vitro-differenzierte M2-Makrophagen besitzen eine geringere Fähigkeit T-Zellen Antigen zu präsentieren, produzieren weniger inflammatorische Zytokine, weniger toxische Sauerstoff- und Stickstoffradikale und töten intrazelluläre Bakterien weniger effizient als klassisch aktivierte Makrophagen (EDWARDS et al.
2006). Vielmehr sezernieren diese Zellen Komponenten der Extrazellulärmatrix, weshalb sie auch als Makrophagen der Wundheilung bezeichnet werden. Erhöhte IL4- und IL13-Konzentrationen kommen im Körper bei Th2-vermittelten Immunantworten zustande und sind Folgen von Gewebeverletzungen, Störungen der mukosomalen Oberflächen von Darm und Lunge sowie Wurm- und Pilzinfektionen (WILSON et al. 2006; KREIDER et al. 2007; REESE et al. 2007). Die Zytokine werden dabei von Th2-Lymphozyten, basophilen Granulozyten und Mastzellen freigesetzt (BRANDT et al. 2000; SICA u. MANTOVANI 2012). Die Wichtigkeit von M2-Makrophagen wird unter anderem von STIJLEMANS et al. (2010) beschrieben.
So kommt es nach einer Infektion mit Afrikanischer Trypanosomiasis zu einem Wechsel der anfänglichen M1- zu einer M2-Antwort, die die Tiere vor schwerwiegenden Anämien und Immunpathologien bewahrt (STIJLEMANS et al.
2010). Allerdings können Makrophagen der Wundheilung im Falle einer Dysregulation auch wirtsschädigend werden. Beispielsweise wird die bei chronischer
6
Schistosomiasis auftretende Gewebefibrose auf eine unkontrollierte Aktivierung von Makrophagen der Wundheilung zurückgeführt (HESSE et al. 2001).
Die Expression von CD163 und Calprotectin sowie von den Zytokinen IL10 und IL12 werden häufig zur Charakterisierung von Makrophagentypen herangezogen.
Allerdings konnten DÜVEL et al. (2012) den Anstieg der IL10-Expression bei alternativer Aktivierung für bovine Zellen nicht nachweisen. Bovine Makrophagen zeigten diesen Anstieg lediglich nach LPS-Stimulation. Ein Rückgang von Calprotectin und ein Anstieg der CD163-Expression wurden des Weiteren auch bei unstimulierten bovinen Makrophagen im Laufe der In-vitro-Reifung beobachtet (DÜVEL et al. 2012).
2.1.2.3 Regulatorische Makrophagen
Von MOSSER u. EDWARDS (2008) werden bei humanen Zellen weitere Subtypen, die regulatorischen Makrophagen, beschrieben. Diese können durch die Einwirkung verschiedener Stimuli induziert werden, wobei die Stimulation durch Glucocorticoide der am besten erforschte Weg ist. Glucocorticoide werden stressbedingt ausgeschüttet und vermindern die Makrophagen-vermittelte inflammatorische Wirtsabwehr durch Hemmung der Transkription inflammatorischer Zytokin-Gene und Verminderung der mRNA-Stabilität (STERNBERG 2006). Weitere Faktoren, die als Stimuli für eine Differenzierung zu regulatorischen Makrophagen diskutiert werden sind TLR-Agonisten bei gleichzeitigem Einfluss von Immunkomplexen (Typ-II-Aktivierung), Prostaglandinen oder apoptotischen Zellen. Auch wenn sich die Makrophagen abhängig von den Stimuli unterscheiden, haben sie eine erhöhte IL10-Produktion und eine verminderte IL12-Sekretion gemeinsam, weshalb ihnen anti-inflammatorische Funktionen zugeschrieben werden (GERBER u. MOSSER 2014). Im Unterschied zu Wundheilungsmakrophagen tragen sie nicht zur Produktion von Extrazellularmatrix bei, sondern sind durch die Expression von Haupt- histokompatibilitätskomplex (MHC) -Klasse-II-Molekülen und co-stimulatorischen Molekülen (CD80 und CD86) vermeintlich an der Antigenpräsentation beteiligt (EDWARDS et al. 2006). Somit bestehen sowohl auf funktioneller wie auch auf biochemischer Ebene klare Unterschiede zwischen regulatorischen und Wundheilungsmakrophagen.
2.1.3 Ausgewählte Oberflächenantigene von Monozyten und Makrophagen CD163
Der Rezeptor CD163 gehört zur cysteinreichen Klasse B der Scavenger Rezeptoren und wird spezifisch nur von Monozyten und Makrophagen exprimiert. Allgemein stellen Scavenger Rezeptoren eine sehr heterogene Gruppe von Oberflächenrezeptoren dar, die geladene Liganden, low density lipoproteins,
Literaturübersicht
7
Antikörper und mikrobielle Bestandteile (z.B. LPS) sowie körpereigene modifizierte Strukturen erkennen können. Sie übernehmen vielschichtige Aufgaben im Körper und wirken bei der Zelladhäsion und Antigenpräsentation mit. Eine der Hauptfunktionen von CD163 liegt in der Bindung von Hämoglobin-Haptoglobin- Komplexen, wodurch freies Hämoglobin nach Traumata oder aus Entzündungsgebieten von Makrophagen entfernt werden kann (AKILA et al. 2012). In der Immunabwehr spielt CD163 ebenfalls eine große Rolle. Es bindet an TLRs, ist jedoch auch in der Lage bakterielle Strukturen direkt zu erkennen (CANTON et al.
2013). Zusammen mit CD68 wird CD163 zur Identifizierung von Makrophagentypen verwendet und auf M2-Makrophagen besonders stark exprimiert. CD163-positiven Makrophagen werden anti-inflammatorische Funktionen zugeschrieben, da sie in großer Zahl im Wundheilungsgewebe und bei chronischen Erkrankungen aufgefunden wurden, während frisch ins entzündliche Gewebe infiltrierte Zellen überwiegend CD163-negativ waren (FABRIEK et al. 2008). Eine Stimulation von Makrophagen mit LPS führt zu einer proteolytischen Abspaltung der CD163- Rezeptoren von der Zelloberfläche und Abgabe in den Überstand. Eine Langzeitinkubation mit LPS führt hingegen zu einem Anstieg der Rezeptorexpression (SULAHIAN 2004).
CD16
Die Gruppe der CD16-Rezeptoren besteht aus zwei Untergruppen. Auf der einen Seite den FcgRIIIa-Rezeptoren, die auf NK Zellen, T-Lymphozyten, Monozyten und Makrophagen exprimiert werden. Auf der anderen Seite den FcgRIIIb-Rezeptoren, die auf neutrophilen Granulozyten zu finden sind. Auf eosinophilen Granulozyten können FcgRIIIb ebenfalls induziert werden. CD16 fungieren als Rezeptoren für die Fc-Region von Immunglobulin (Ig) G Antikörpern, die die Zelle bei Kontakt aktivieren und zur Phagozytose anregen. Da CD16-Rezeptoren auf Monozyten- Subpopulationen unterschiedlich stark exprimiert werden, werden sie zu deren Klassifizierung verwendet (2.1.1).
MHCII
Moleküle der MHC-II-Klasse sind Proteinkomplexe, die vorwiegend auf der Oberfläche professioneller Antigenpräsentierender Zellen (APCs) wie Dendritischen Zellen, Makrophagen und B-Lymphozyten zu finden sind. Sie präsentieren Peptide von extrazellulären, durch Phagozytose in die Zelle aufgenommenen Proteinen und werden von CD4-Rezeptoren der T-Helferzellen erkannt (HERRERO et al. 2001). In inflammatorischem Milieu und im Besonderen durch das Zytokin IFNγ werden Monozyten und Makrophagen aktiviert und die MHC-Klasse-II-Expression hochreguliert. Daher kann sie als Kennzeichen für den Aktivierungszustand von Immunzellen verwendet werden (KAMPHORST et al. 2010).
8
CD11b
Das Protein CD11b (auch CR3a, ITGAM, Integrin αM) wird von vielen Leukozyten des angeborenen Immunsytems, wie Monozyten, Makrophagen, Granulozyten und NK-Zellen exprimiert. Es bildet zusammen mit CD18 (auch Integrin β2) das Integrin αMβ2 (auch Mac1, Komplementrezeptor (CR) 3, CD11b/CD18 genannt). Während Integrin αMβ2 in viele immunologische Funktionen wie Chemotaxis, Zellaktivierung, Adhäsion, Migration, Phagozytose und Chemotaxis involviert ist, wird vermutet, dass das Molekül CD11b allein nur an der Steuerung der Zelladhäsion und dem Zellwachstum beteiligt ist. Werden Makrophagen durch neutrophile Granulozyten aktiviert, führt dies zu einer gesteigerten CD11b/CD18 Expression und verstärkten Adhärenz (MAZZONE u. RICEVUTI 1995). Als Rezeptor für Fibrinogen γ, Faktor X sowie Komplementfaktor 3b vermittelt CD11b die Aufnahme komplementgebundener Partikel in die Zelle. Weitere Liganden sind Faktor x, ICAM-1, E. coli und LPS.
Werden bovine Makrophagen mit LPS stimuliert, wird der CD11b-Rezeptor auf deren Oberfläche verstärkt exprimiert (WERLING et al. 1998).
2.1.4 Das Chemokin CCL5
CCL5, auch bekannt als RANTES (Regulated upon Activation Normal T cell Expressed and Secreted) ist ein Chemokin, das aus 68 Aminosäuren besteht und ein Molekulargewicht von 7 kDa besitzt (APPAY u. ROWLAND-JONES 2001). Es wird überwiegend von CD8+ T-Zellen gebildet, kann aber auch von Epithelzellen, Fibroblasten und Thrombozyten sezerniert werden. CCL5 gilt als inflammatorisches Chemokin, da es zum einen die Stickstoffmonoxid (NO) -Produktion in Makrophagen induziert und zum anderen die Leukozytenmigration von T-Lymphozyten, Monozyten, Mastzellen, NK-Zellen, dendritischen Zellen und Granulozyten über die Bindung an G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (CC-Chemokinrezeptoren (CCR) 3, 4 und 5) auslöst (SCHALL 1991; SAMSON et al. 1996; VILLATA et al. 1998). CCR1 und CCR5 sind Rezeptoren, die auf Monozyten exprimiert werden. In humanem Fettgewebe spielt CCL5 durch die Rekrutierung von Monozyten und anti- apoptotische Einflüsse auf Gewebsmakrophagen eine wichtige Rolle (KEOPHIPHATH et al. 2009). Doch hat das Chemokin aufgrund der Rekrutierung von Immunzellen und Förderung entzündlicher Prozesse auch schädigende Eigenschaften. So wurden erhöhte Konzentrationen bei allogenen Transplantatabstoßungen und Überempfindlichkeitsreaktionen vom verzögerten Typ sowie bei Erkrankungen wie Atherosklerose, Arthritis, atopischer Dermatitis, Glomerulonephritis und Asthma beschrieben (ROSSI u. ZLOTNIK 2000; APPAY u.
ROWLAND-JONES 2001). Zudem soll es in der frühen Phase für die Induktion und Promotion von Tumoren und in der späten Phase für die Stimulation der Angiogenese und Metastasierung verantwortlich sein (APPAY u. ROWLAND-JONES 2001). Auch Einflüsse auf Viruserkrankungen werden beschrieben, wobei manche
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Autoren positive Funktionen in der Virusbekämpfung aufführen (CULLEY et al.
2006), während andere von einer Förderung viraler Infekte berichten (YE et al.
2004).
Bei der Untersuchung der Einflüsse von CCL5 auf bovine monozytäre Zellen zeigte sich, dass insbesondere die Migration von klassischen Monozyten von CCL5 gesteigert wird und dass das Chemokin in der Lage ist, die Überlebensrate von Makrophagen währen der In-vitro-Differenzierung zu erhöhen. Der Phänotyp CCL5- gereifter Makrophagen wird verändert und es kommt zu einer LPS-Hyporesponsivität der Zellen (HUSSEN et al. 2014).
2.2 Bildung Reaktiver Sauerstoffspezies
Ein wichtiger antimikrobieller Mechanismus von mononukleären Phagozyten, neutrophilen und eosinophilen Granulozyten ist die Produktion großer Mengen reaktiver Sauerstoffspezies. Die ROS-Bildung erfolgt während der Phagozytose oder bei Stimulation mit verschiedenen Substanzen und wird auch oxidativer burst oder respiratory burst genannt, da explosionsartig große Mengen Sauerstoff aufgenommen, Glukose umgewandelt und ROS produziert werden. Die toxischen Sauerstoffmetaboliten tragen zum Abtöten eingedrungener Mikroorganismen bei, können aufgrund ihrer Reaktivität aber auch körpereigene Strukturen zerstören. Das Schlüsselenzym für die ROS-Bildung ist die membranständige Nikotinsäureamid- Adenin-Dinukleotid-Phosphat-Oxidase (NADPH-Oxidase), die die Reduktion von molekularem Sauerstoff (O2) zum Superoxid-Anion (O2-
) katalysiert, welches zum Teil spontan, zum Teil mithilfe des Enzyms Superoxiddismutase (SOD) mit sich selbst und mit Wasserstoff reagiert und zusätzlich Hydrogenperoxid (H2O2) bildet (EL-BENNA et al. 2008). Diese beiden Substanzen sind Ausgangsprodukte für eine Reihe verschiedener Reaktionen, deren mikrobizide Endprodukte in zwei Gruppen eingeteilt werden können: oxidierte Halogene und Sauerstoffradikale (BABIOR 1983). Halogenionen wie Chlorid, Jodid oder Bromid reagieren zusammen mit H2O2
mithilfe des Enzyms Myeloperoxidase zu oxidierten Halogenen, die die Membran von Pathogenen schädigen. Sauerstoffradikale wie Hydroxylradikale (HO˙) und Peroxid- Anionen (O22-
) entstehen durch eine von Metallsalzen (in der Regel Eisen oder Kupfer) katalysierte Oxidation aus H2O2 und sind hochreaktive keimtötende Agenzien, die Enzyme oder Membranbestandteile oxidieren und somit inaktivieren können (MURPHY et al. 2009).
Da Neutrophile die mit Abstand größte Kapazität zur Bildung reaktiver Sauerstoffspezies aufweisen, wurden die meisten Studien an ihnen durchgeführt. So sind neben der Phagozytose zahlreiche Mediatoren beschrieben, die in der Lage sind, die NADPH-Oxidase zu aktivieren: das Komplementfragment C5a, der chemotaktische Faktor N-formyl-methionyl-leucyl-methionin (FMLP), die bioaktiven
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Peptide Plättchenaktivierender Faktor (PAF) und Leukotrien B4 sowie das Chemokin IL8 (GOODMAN et al. 1995; RUIZ et al. 1995). Die inflammatorischen Zytokine TNFα, Granulozyten-Kolonie stimulierender Faktor (GCSF) und Granulozyten- Makrophagen-Kolonie stimulierender Faktor (GMCSF) sind wie LPS indirekt an der Induktion reaktiver Sauerstoffspezies beteiligt durch ein Priming der Zellen für eine nachfolgende Stimulation (HALLETT u. LLOYDS 1995; SAYEED 2000). Auch eine Bindung an Fc- und Komplementrezeptoren (FcR, CR) auf polymorphkernigen Leukozyten (PMN) aktiviert die NADPH-Oxidase (MIRONOVA 2004).
Die Bedeutung der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies für den Körper wird z.B.
anhand der Septischen Granulomatose deutlich, einer humanen Erbkrankheit, bei der Neutrophile aufgrund einer Fehlenden Komponente der NADPH-Oxidase nicht in der Lage sind ROS zu bilden. Die Patienten leiden unter ständigen Bakterien- und Pilzinfektionen, was zu einer Bildung zahlreicher Granulome und zum frühen Tod führt (EL-BENNA et al. 2008). Doch auch Bakterien haben Schutzmechanismen entwickelt um der Eliminierung durch bakterizide Sauerstoffmetaboliten zu entgehen, wie beispielsweise die von E.-coli-Spezies gebildeten Enzyme Cytochrom-C-Nitrit- Reduktase, Flavohämoglobin und Flavorubredoxin, die in der Lage sind Sauerstoffradikale zu schwächen (BAPTISTA et al. 2012).
2.3 Die Transitperiode
Die Transitperiode wird definiert als der Zeitraum von drei Wochen vor bis drei Wochen nach der Kalbung der Kuh. In dieser Zeit treten bei hochleistenden Milchkühen besonders häufig so genannte „Produktionskrankheiten“ auf, deren Folgen sich noch bis in die nächste Laktationsperiode und die folgende Fruchtbarkeit ziehen können. Zu den häufigsten Produktionskrankheiten zählen Infektions- krankheiten wie Mastitis, Metritis und Endometritis sowie Stoffwechselerkrankungen wie Milchfieber, Nachgeburtsverhaltung, Pansenazidose, Ketose, Labmagen- verlagerung und Leberverfettung. Häufig treten mehrere Erkrankungen gleichzeitig auf. Zwar sind die Krankheiten multifaktoriell bedingt, stehen jedoch in engem Zusammenhang mit einer nicht genügenden Anpassung des Stoffwechsels, Hormonsystems und Immunsystems der Hochleistungskuh an die besonderen Gegebenheiten um die Geburt herum (MULLIGAN u. DOHERTY 2008). Im Folgenden sind die wichtigsten Veränderungen in diesem Zeitraum aufgeführt.
In den letzten drei Wochen vor der Geburt zeigen Kühe eine reduzierte Futteraufnahme, obwohl ihr Energieverbrauch durch das Wachstum des Fötus gegen Ende der Trächtigkeit zunimmt. Bereits vor der Geburt stellt sich daher eine negative Energiebilanz (NEB) im Stoffwechsel der Kuh ein, die mit Einsetzen der immensen Milchleistung noch verstärkt wird und ihren Höhepunkt in der ersten Woche der Laktation erreicht (GRUMMER 1995). Als Folge der katabolen Stoffwechsellage
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werden im Körper vermehrt freie Fettsäuren (FFS) aus den Adipozyten freigesetzt und zusammen mit Aminosäuren, die durch den Abbau von körpereigenem Protein gewonnen werden, in der Leber verstoffwechselt (BELL 1995). Während der Trächtigkeit ist das Immunsystem vor die Herausforderung gestellt, eine Abstoßung des semi-allogenen Fetus zu verhindern und gleichzeitig ausreichenden Schutz für Muttertier und Fetus gegenüber Pathogenen zu bieten. So werden Teile des Immunsystems gehemmt, während andere modifiziert oder auf eine lokale Immunabwehr beschränkt werden (2.3.1). Mit dem Geburtsvorgang gelangen Keime in die Gebärmutter, auf die das modifizierte Immunsystem reagieren muss. So sind bei 80 – 100 % der Tiere in den ersten beiden Wochen nach der Kalbung Bakterien im Uterus nachweisbar, bei 40 % der Tiere noch nach drei Wochen (SHELDON et al.
2008). Nekrose und Ablösung der Karunkel bei der Involution des Uterus bieten zusätzlich einen optimalen Nährboden für Pathogene und mit Einsetzen der Milchleistung und Öffnung der Zitzenkanäle stellt die Milchdrüse eine weitere Eintrittspforte für Keime dar. Mit der Milch werden schützende Immunglobuline und Lactoferrin ausgewaschen und die Funktionalität von Phagozyten durch gebildete Fettsäuren und Kaseine reduziert (BURVENICH et al. 2007). Die durch die negative Energiebilanz und hormonellen Veränderungen geschwächten Tiere sind häufig nicht in der Lage die Keime zu eliminieren.
Endokrinologische Veränderungen wie die Abnahme der Insulinkonzentration in den letzten beiden Wochen vor der Geburt potenzieren den katabolen Stoffwechsel (BELL 1995). Auch erhöhte Cortisolkonzentrationen um den Geburtszeitraum wirken immunsupprimierend und induzieren die Entwicklung regulatorischer Makrophagen (KINDAHL et al. 2004). Während der katabolen Stoffwechsellage kommt es zu einer Resistenz des Gewebes gegenüber dem im Hypophysenvorderlappen gebildeten Wachstumshormon (GH) was eine verminderte Produktion des Insulinähnlichen Wachstumsfaktor I (IGF-I) zur Folge hat. Dieser Umstand wird in der Literatur als
„Entkopplung der Somatotropen Achse“ beschrieben (HOLZHAUSEN 2012;
PIECHOTTA et al. 2012). Da IGF-I insulinähnliche Einflüsse auf den Stoffwechsel hat, verschlimmert sich die katabole Situation durch seine Regression zusätzlich.
Im zirkulierenden Blut verändert sich der Anteil von Immunzellen peripartal, was mutmaßlich auch Einfluss auf die uterine Immunität hat. Im Laufe der Trächtigkeit steigt die Gesamtleukozytenzahl tendenziell an und fällt kurz nach der Geburt wieder ab. Demgegenüber sinkt der Anteil an totalen T-Zellen (CD3), T-Helfer (CD4) und zytotoxischen T-Zellen (CD8) zur Geburt hin ab und steigt nach der Geburt wieder signifikant an. Die Monozytenzahl zeigt tägliche Schwankungen und keine tendenziellen Veränderungen (KIMURA et al. 1999).
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2.3.1 Monozytäre Zellen im graviden Uterus
Die Gebärmutter schützt sich mithilfe verschiedener Mechanismen vor eindringenden Pathogenen. Eine erste Barriere bildet der anatomische Aufbau der Vulva, die kollagenen Zervixringe sowie der zähe, sich im Verlauf des Zyklus verändernde Zervikovaginalmukus. Die längs und quer verlaufende Uterusmuskulatur erleichtert zudem eine mechanische Austreibung von Partikeln und Erregern (BONDURANT 1999).
Haben Erreger die anatomischen und funktionellen Barrieren überwunden, können sie auf vielfältige Weise vom Immunsystem erkannt und eliminiert werden. Da in dieser Arbeit Monozyten und Makrophagen im Mittelpunkt stehen, wird im Folgenden schwerpunktmäßig auf die zelluläre Abwehr und insbesondere auf monozytäre Zellen eingegangen. Endometriale Epithel- und Stromazellen exprimieren den TLR4-CD14- MD2-Komplex, einen Rezeptor, der bakterielles Lipopolysaccharid identifiziert und die Zellen zu einer vermehrten Sekretion der Mediatoren IL8, IL6 und Prostaglandin E anregt. Diese wiederum locken Monozyten und neutrophile Granulozyten an (SHELDON et al. 2014). So konnte im Endometrium infizierter Tiere eine verstärkte Genexpression der Zytokine IL1, IL6, TNF, der Chemokine CXCL8, CXCL5, CCL5 sowie der Rezeptoren TLR1 und TLR4 nachgewiesen werden (FISCHER et al. 2010). Den eingewanderten neutrophilen Granulozyten wird dabei die größte Rolle bei der Selbstreinigung des Uterus zugesprochen. Sie können bakterielle Erreger durch Phagozytose, Freisetzung antimikrobieller Substanzen (Degranulation) und Bildung reaktiver Sauerstoffspezies eliminieren. Die größte Anzahl neutrophiler Granulozyten befindet sich während des Östrus und puerperal im Uterus (BONDURANT 1999).
Doch auch die in großer Zahl einwandernden Monozyten spielen eine Rolle bei der Immunabwehr, da sie zu Makrophagen reifen, die vielschichtige Aufgaben in der Immunabwehr, aber auch in der Resolution von Entzündungen übernehmen. Im gesunden Uterus sind Makrophagen diffus im Stratum Spongiosum und in etwas geringerer Zahl im Stratum Compactum verteilt, während im luminalen Epithel kaum Phagozyten zu finden sind (SHELDON et al. 2009). Auch während der verschiedenen Zyklusphasen verändert sich ihre Zahl nicht (COBB u. WATSON 1995). Während im nichtgraviden uterinen Gewebe kaum Makrophagen auftreten, wandern diese besonders in der mittleren und späten Trächtigkeit ins Uteruslumen ein und reifen dort vorwiegend zu M2-Makrophagen mit anti-inflammatorischen, angiogenetischen und Gewebe-remodellierenden Funktionen (OLIVEIRA et al.
2010). Als Ursache hierfür wird der so genannte ‚Th2-switch‘ angesehen, was bedeutet, dass die T-Zellaktivität in der Gebärmutter zugunsten einer regulatorischen Th2-Antwort verschoben wird (MAEDA et al. 2012). Auf diese Weise wird der Fetus vor einer Abstoßung geschützt und vermehrt trächtigkeitsprotektive Chemokine wie
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IL4 und IL10 produziert. Induziert wird der ‚Th2-switch‘ durch die Sekretion von IL3, IL4, IL5 und IL10 von Zellen der Plazenta (HEIKKINEN et al. 2003; MENZIES et al.
2011).
Die Plazenta des Rindes wird als Plazenta epitheliochorialis bezeichnet, was bedeutet, dass während der Trächtigkeit alle Gewebeschichten der Gebärmutter erhalten bleiben. Die Plazenta fetalis, das Chorion, bildet Zottenfelder, die Kotyledonen, die mit Karunkeln der Gebärmutterschleimhaut verankert sind. Die übrigen Chorionteile sind zottenfrei (SCHNORR 2001). Dass Lymphozyten und Makrophagen überwiegend im interkarunkulären Endometrium zu finden sind, weist darauf hin, dass sich bestimmte immunologische Reaktionen in der Trächtigkeit auf einzelne Areale beschränken. Die Lymphozytenfraktion im graviden wie im nicht graviden Uterus wird von B-Zellen, T-Zellen und NK-Zellen gebildet (CROY et al.
2013). Beim Menschen wird angenommen, dass spezialisierte uterine natürliche Killerzellen (uNK-Zellen) eine große Rolle spielen, da sie während der Schwangerschaft bis zu 70 % der uterinen Lymphozytenpopulation ausmachen und in der Lutealphase des Zyklus sowie zu Beginn der Schwangerschaft stark ansteigen. Beim Rind gibt es einen ähnlichen Peak gegen Tag 16 des Zyklus. Im graviden Uterus bleibt die Zahl an uNK-Zellen jedoch konstant, weshalb deren Bedeutsamkeit noch diskutiert wird (CROY et al. 2013).
Das vom Gelbkörper und in geringen Mengen von Plazenta und Nebennieren gebildete Progesteron hält die Trächtigkeit aufrecht. Ab dem 250. Trächtigkeitstag sinkt die Plasmakonzentration konstant, da die erhöhten Cortisolwerte über Enzymaktivierungen zu einer Umsetzung von Progesteron in Östrogene führen.
Nach erfolgter Luteolyse ca. 24 Stunden vor der Geburt fällt die Plasmakonzentration erneut stark ab. Aufgrund seiner Fähigkeit, die NO-Produktion sowie die Expression von IL12, IL17 und IFNγ von Makrophagen zu reduzieren und die IL4-Expression bei trächtigen Tieren zu steigern, wird angenommen, dass Progesteron Makrophagen in Richtung von M2-Subtypen polarisiert und immunsupprimierend wirkt (SHELDON et al. 2009; MAEDA et al. 2012). Dass aber auch die Expression von IL10, Arg 1 sowie des mit einer alternativen Aktivierung assoziierten Gens mrc1 reduziert werden, zeigt, dass in der Gebärmutter gereifte Makrophagen eine Plastizität besitzen, die nicht eindeutig einer M2-Antwort zugeordnet werden kann (MENZIES et al. 2011).
Geringe Progesteron- und IL-6-Konzentrationen im peripheren Blut prä partum wurden bei Kühen mit anschließender Nachgeburtsverhaltung gemessen, während Tiere mit hohen IL6-Konzentrationen vermehrt an Endometritis erkrankten (ISHIKAWA et al. 2004).
Östrogene werden zum Großteil von der Plazenta gebildet. Die Östrogenkonzentration steigt zur Geburt hin an und sorgt für die Geburtsvorbereitung, unter anderem durch Vermehrung von Oxytozinrezeptoren,
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Erhöhung der Uteruskontraktilität und Stimulation der Freisetzung von Prostaglandin F2α. Nach der Geburt sinken die Östrogenwerte rapide (KINDAHL et al.
2004; HOLZHAUSEN 2012). Zwar geht man davon aus, dass die Einwanderung von Monozyten zu Beginn der Trächtigkeit östrogenvermittelt ist, jedoch wird der direkte Einfluss des Hormones auf Immunzellen noch diskutiert und es werden sowohl immunsupprimierende als auch immunstimulierende Effekte beschrieben. So steigern Östrogene die humane B-Zell-Proliferation und IgM-Synthese, stimulieren die IL5, IL2 und IL3-Synthese humaner T-Zellen und hemmen die humane Lymphozytenproliferation und murine NK-Zell-Aktivität (MILLER u. HUNT 1996).
BONDURANT (1999) beschreibt außerdem eine östrogenvermittelte Steigerung der Fähigkeit von uterinen Zellen zur Antigenpräsentation und MHC-Klasse-II- Expression.
Neben Progesteron wird das in der Frühträchtigkeit kurzzeitig vom Trophoblasten gebildete IFN-τ als Hauptregulator für die immunologischen Veränderungen angenommen (MANSOURI-ATTIA et al. 2012). Als Inhibitor der Prostaglandin-F2α- Sekretion verhindert IFN-τ die Luteolyse und ermöglicht somit das Einnisten des Trophoblasten (MARTAL et al. 1998). Doch auch immunsupprimierende Einflüsse auf Makrophagen wie die Reduktion der Phagozytosekapazität, der induzierten ROS-Bildung sowie eine verminderte IL1β-Sekretion nach Priming der Zellen mit IFN-τ werden beschrieben (HARA et al. 2014).
2.3.2 E.-coli-Infektionen des Uterus
Bei gesunden Kühen löst sich die Nachgeburt innerhalb von sechs Stunden nach der Geburt ab, die Gebärmutter zieht sich in den folgenden Wochen zusammen und Geburtsverletzungen verheilen. Nach sechs Wochen hat die Gebärmutter Ihre ursprüngliche Funktionalität und Größe erreicht und ein regelmäßiger Zyklus stellt sich ein. Die bei der Kalbung eingedrungenen Keime lösen einen Einstrom von Neutrophilen aus, die die Pathogene zügig eliminieren. Ein ungestörter Ablauf ist jedoch nur bei 50 % der Kühe zu beobachten. Viele Tiere schaffen es nicht, die Keime aus dem Uterus zu eliminieren und leiden unter unregelmäßigen Zyklen, schlechten Konzeptionsraten und entwickeln eine klinisch oder subklinische Gebärmutterentzündung (SHELDON et al. 2009).
Grundsätzlich ist zu unterscheiden zwischen Metritis und Endometritis. Eine Metritis tritt in den ersten 21 Tagen nach der Kalbung auf und wird je nach klinischen Krankheitszeichen in drei Grade unterteilt. Mehr als 20 % der Kühe entwickeln nach der Kalbung eine Metritis, die wiederum bei mehr als 20 % der erkrankten Tiere in eine Endometritis führt, d.h. länger als 21 Tage, beziehungsweise (bzw.) 26 Tage p.p. andauert (GALVÃO et al. 2012). Unter subklinischer Endometritis versteht man eine Inflammation des Endometriums fünf Wochen post partum, bei welcher der
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Anteil an PMN bei über 10 % der intrauterinen Zellen liegt und keine klinischen Symptome vorliegen (KASIMANICKAM et al. 2004).
SHELDON et al. (2009) beschreiben Escherichia coli und Trueperella pyogenes (T. pyogenes) als die am häufigsten aus dem Uterus erkrankter Tiere isolierten Keime. Seltener sind die anaerobier Prevotella species, Fusobacterium necrophorum und Fusobacterium nucleatum. Für eitrigen Ausfluss, der unter Feldbedingungen das deutlichste und oftmals einzige sichtbare Anzeichen für eine Gebärmuttererkrankung ist, sorgt vor allem T. pyogenes, häufig in Kombination mit Fusobacterium necrophorum und P. melaninogenicus (WILLIAMS et al. 2005). Während E. coli in den ersten Tagen nach der Kalbung den Uterus vieler, auch nicht klinisch erkrankter Kühe besiedelt, kommt T. pyogenes seltener vor und verursacht schwere eitrige Endometritiden. Da ein statistischer Zusammenhang zwischen hohen E.-coli- Keimzahlen an Tag 7 und hohen T. pyogenes- Keimzahlen an Tag 14 p.p. besteht, wird vermutet, dass E. coli als Wegbereiter für spätere pathogene Keimbesiedlung mit klinischen Erkrankungen fungiert (WILLIAMS et al. 2007). Zudem sind E.-coli- Bakterien in der Lage die Menge der vom Endometrium sezernierten Hormone Prostaglandin-F2α und Prostaglandin-E2 zu modulieren und so die Lutealphase zu verkürzen (HERATH et al. 2006). Die bei E.-coli-Infektionen verzögerte Follikelreifung, geringere Progesteronproduktion und verspätete Luteolyse haben zudem Einfluss auf die folgende Fruchtbarkeit. Erhöhte Akute-Phase-Protein- Konzentrationen im Blut zeigen Einflüsse auf das Immunsystem (WILLIAMS et al.
2007).
Neben pathogenen Keimen besiedeln auch nicht-pathogene Bakterien wie Koagulase-negative Staphylokokken und α-hämolysierende Streptokokken die Gebärmutter. Da Ihre Anwesenheit mit einer verringerten Anfälligkeit für klinische Endometritiden einhergeht wird vermutet, dass ihr Einsatz in Zukunft eine Rolle in der Endometritisprophylaxe spielt (WILLIAMS et al. 2005; SHELDON et al. 2009).
Infusionen von E.-coli-LPS in die Gebärmutter induzierten einen Einstrom von PMN und führten somit zu einer schnelleren Abheilung von Endometritiden. Daher wurde auch LPS als mögliche alternative Endometritistherapie diskutiert (HUSSAIN u.
DANIEL 1992; DHALIWAL et al. 2001).
2.3.3 E.-coli-Mastitis
Mit Einsetzen der Milchleistung und Öffnen der Strichkanäle wird die Milchdrüse zu einer potenziellen Eintrittspforte für Erreger. Um dies zu verhindern verfügt sie über verschiedene Schutzmechanismen im anatomischen Aufbau und in der Zellzusammensetzung. Die erste Barriere bildet der Strichkanal, dessen Durchmesser von der spiralig angeordneten glatten Muskulatur bestimmt wird, die über das autonome Nervensystem gesteuert wird. Er ist mit Keratin ausgekleidet,
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welches in Verbindung mit freien und veresterten Fettsäuren (Myristinsäure, Palmitolensäure, Linolsäure) bakteriostatisch wirkt und während der Zwischenmelkzeit sowie der Zeit des Trockenstehens einen schützenden Keratinpfropf bildet (SORDILLO u. STREICHER 2002). Weiter proximal in Richtung der Fürstenberg’schen Rosette nimmt die Anzahl der im Gewebe eingebetteten Immunzellen stetig zu. Durch den regelmäßigen Milchfluss werden einwandernde Erreger immer wieder aus dem Euter gespült, weshalb der Beginn des Trockenstellens mit einer gehäuften Inzidenz von Mastitiden einher geht.
Aufgrund ihres häufigen Auftretens, der Reduktion der Milchleistung und der damit verbundenen hohen Kosten werden Euterentzündungen als die wichtigsten Erkrankungen bei Milchkühen angesehen. Verursacht werden können sie von einer Vielzahl grampositiver (Staphylococcus, Streptococcus, Corynebacterium bovis) und gramnegativer (E. coli, Klebsiella, Enterobacter, Pseudomonas, Proteus) Keime, wobei E. coli, Staphylococcus aureus (S. aureus) und Streptococcus uberis (S. uberis) die am häufigsten isolierten Erreger darstellen. Im klinischen Erscheinungsbild unterscheiden sich E.-coli-Mastitiden durch eine kurze Dauer, hohe Erregerzahlen, ausgeprägte klinische Symptome und eine massive Immunantwort von den eher langwierigen, oft subklinisch verlaufenden, S. aureus- und S. uberis- Mastitiden (SCHUKKEN et al. 2011). E.-coli-Bakterien gehören zu den umweltassoziierten Keimen, die sich in der kotverschmutzten Umgebung und auf den Liegeflächen der Tiere befinden und insbesondere nach dem Melken über die noch geöffneten Strichkanäle ins Euter gelangen. Inwieweit es spezielle an die Milchdrüse angepasste Stämme gibt, wird in der Literatur diskutiert. Während einige Autoren von Euter-adaptierten Keimen berichten (DOGAN et al. 2006; SHPIGEL et al. 2008), sind andere der Meinung, dass alle E.-coli-Stämme gleichermaßen in der Lage sind Mastitiden auszulösen (BURVENICH et al. 2003; SUOJALA et al. 2011). Aufgrund ihrer Fähigkeit Milchbestandteile wie Laktose als Energiequelle zu nutzen, sind E. coli perfekt an die Bedingungen in der Milchdrüse angepasst.
Die Stärke der Immunantwort auf E.-coli-Bakterien korreliert positiv mit der Anzahl der eingedrungenen Erreger. Dies beschreiben GÜNTHER et al. (2010), welche die Expression von TNFα und IL8 von Epithelzellen des Euters zur Messung der Immunantwort heranzogen. Hauptverantwortlich für die ausgeprägte Immunreaktion ist das Endotoxin LPS, das während der Vermehrung, aber auch beim Zelltod nach Aktivierung der Immunantwort, in großen Mengen freigesetzt wird (GÜNTHER et al.
2010). Als TLR4-Ligand induziert es die Freisetzung inflammatorischer Zytokine, insbesondere IL1β und TNFα, die wiederum die Genexpression von weiteren inflammatorischen Mediatoren wie Zytokinen, Enzymen für die Eikosanoidsynthese, Akute-Phase Proteinen sowie solchen für die Zellproliferation und Apoptose steuern (SCHUKKEN et al. 2011). Neben LPS werden jedoch auch weitere TLR-Liganden wie Flagellin, Cytosin-Phosphatidyl-Guanin-DNA oder Curli von E.-coli-Bakterien
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freigesetzt (KARCZMARCZYK et al. 2008). Hauptverantwortlich für die Initiierung der Immunantwort und die Freisetzung der Zytokine sind die hochkompetenten Euterepithelzellen sowie Makrophagen und neutrophile Granulozyten. Die genauen Aufgabengebiete der Phagozyten wurden anhand verschiedener Mausmodelle untersucht, wobei sich herausstellte, dass neutrophile Granulozyten die Bakterien beseitigen, während Makrophagen LPS erkennen und ein Eindringen der Bakterien ins Eutergewebe verhindern (ELAZAR et al. 2010; SCHUKKEN et al. 2011).
2.4 Das E.-coli-Sekretom
Die Spezies Escherichia coli wurde erstmals 1885 von Theodor Escherich als physiologischer Bewohner der Dickdarmflora beschrieben und als „Bacterium coli commune“ bezeichnet. Im Jahr 1958 erhielt sie ihren heutigen Namen.
E. coli gehört zur Familie der Enterobacteriaceae und ist ein gramnegatives, stäbchenförmiges, fakultativ anaerobes Bakterium mit einer Größe von durchschnittlich 1,3 µm x 4 µm. Die meisten Stämme sind opportunistische Erreger, die überwiegend im Darm angesiedelt sind. Jedoch gibt es auch darmpathogene Stämme, die schwere Enteritiden verursachen können. Zusätzlich sind die Bakterien häufiger Auslöser für Harnwegsinfekte, Meningitiden, Mastitiden, Metritiden, Pneumonien, Septikämien und andere Krankheiten und entsprechend dieser Krankheitsbilder benannt. So werden die intestinal-pathogenen Erreger in sechs Kategorien unterteilt: enterohämorrhagische E. coli (EHEC), enteropathogene E. coli (EPEC), enterotoxische E. coli (ETEC), enteroaggregative E. coli (EAEC), enteroinvasive E. coli (EIEC) und diffus adhärente E. coli (DAEC). Extraintestinal- pathogene E. coli (ExPEC) werden weiterhin entsprechend ihres Krankheitsbildes gegliedert in uropathogene E. coli (UPEC), sepsis-assoziierte E. coli (sepEC), neugeborenenmeningitis-assoziierte E. coli (NMEC) sowie aviär-pathogene E. coli (APEC) (KAPER et al. 2004). In den letzten Jahren kam zusätzlich die Gruppe der endometrium-pathogenen E. coli (EnPEC) hinzu, Isolate, die als im Endometrium besonders adhärent und invasiv auffielen (SHELDON et al. 2010).
Neben der Einteilung in kommensale und pathogene Stämme lassen sich E. coli serologisch anhand ihrer O-Antigene (hitzestabile Bestandteile des Lipopolysaccharid-Komplexes der Membran), K-Antigene (Polysaccharide der Kapsel) und H-Antigene (Geißeln) unterscheiden. Die Kombination der einzelnen Antigene ermöglicht die Klassifizierung einer großen Zahl verschiedener Serotypen.
Eine weitere Form der Klassifizierung ist die phylogenetische Gruppierung.
Verschiedene Verfahren wie die Multilokus-Enzym-Elektrophorese (MLEE), die Multilokus-Sequenztypisierung (MLST) und Polymerase-Kettenreaktion (PCR) -basierte Methoden teilen E. coli anhand Strukturen ihrer DNA in verwandtschaftliche Gruppen ein (HOMEIER-BACHMANN 2009). Diese Gliederung
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klassifiziert E.-coli-Stämme in die Phylogruppen A, B1, B2 und D, bzw. nach neueren Erkenntnissen werden auch die Phylogruppen C und E diskutiert (ESCOBAR- PARAMO 2004). Davon ausgehend, dass es im Genom von Bakterien Bereiche gibt, die nur sehr langsam fortschreitenden Veränderungen ihrer Nukleotidsequenz unterliegen und als Kerngenom und Housekeeping-Gene (=Loki) bezeichnet werden, werden beispielsweise mithilfe der MLST mehrere Loki eines Isolates sequenzanalysiert und das Isolat so den Phylogruppen zugeordnet. Zwar steht die Phylogruppierung eines Isolates nicht im Zusammenhang mit bestimmten Eigenschaften oder der Virulenz, doch gibt es Untersuchungen, nach denen kommensale E. coli häufig den Phylogruppen A und B1 angehören, während extraintestinale Keime vor allem in Phylogruppe B2 und D zu finden sind (GORDON et al. 2008). Isolate aus Uteri von an Metritis erkrankten Tieren gehörten häufig (> 65 %) der Phylogruppe B1 (GOLDSTONE et al. 2014), bzw. den Phylogruppen A und B1 (SHELDON et al. 2010) an.
Die Virulenz von Isolaten lässt sich hingegen durch die Sequenzanalyse ihres Genoms ermitteln. Neben dem konservativen Kerngenom verfügen die Bakterien über einen flexiblen Genpool, der durch horizontalen Gentransfer über Plasmide, Phagen, Transposons, Integrons und genomische Inseln zwischen den Bakterien verbreitet wird. Genomische Inseln, die zur Pathogenität eines Bakteriums beitragen werden Pathogenitätsinseln (PAI) genannt und verfügen über die Eigenschaften virulenzassoziierte Gene zu beinhalten, eine Größe von mehr als 10 kb zu besitzen, in nicht-pathogenen Stämmen nicht vorhanden zu sein, sich vom Kerngenom zu unterscheiden sowie über Mobilitäts- und Insertionselemente zu verfügen (OELSCHLAEGER u. HACKER 2004).
Über die Rolle von E. coli in der Pathogenese von Metritis und Endometritis bei der Kuh herrscht trotz intensiver Forschung noch Unklarheit. Bei der Isolation verschiedener E. coli aus dem postpartalen Uterus konnten SILVA et al. (2009) Gene von 15 Virulenzfaktoren (VF) isolieren, jedoch keinen Zusammenhang mit einer Erkrankung darstellen, während SHELDON et al. (2010) 17 VF fanden, von denen die Gene fimH sowie fyuA mit einer Gebärmutterentzündung in Zusammenhang standen. Eine Studie von BICALHO et al. (2010) hingegen bezeichnete die Gene fimH, hlyA, cdt, kpsMII, ibeA und astA als signifikant mit Metritis und Endometritis assoziiert, wobei fimH die bedeutendste Rolle spielte (SILVA et al. 2009; BICALHO et al. 2010; SHELDON et al. 2010).
Mit dem Begriff Sekretom wird das gesamte Repertoire der löslichen Proteine, das eine Zelle in den Extrazellularraum sezerniert einschließlich der Proteine, die direkt und indirekt an der Sekretion beteiligt sind bezeichnet. Die Sekretion kann über verschiedene Sekretionssysteme erfolgen wie beispielsweise Typ I (ABC-Transporter), Typ III (T3SS), Typ 4 (konjugationsassoziierter Typ),
Literaturübersicht
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Autotransporter, Tat-Transporter und ESAT-6 sowie den am häufigsten vorkommenden Sec-abhängigen Sekretionsweg (Sec) (TJALSMA et al. 2000; SONG et al. 2009). Da Sec und T3SS in fast allen Bakterien vorkommen und mit Abstand den größten Anteil des Sekretoms sezernieren sind sie die am weitesten erforschten Sekretionssysteme (ECONOMOU 2002). Bakterien, die in der Lage sind sog.
Attaching-and-Effacing- (AE-) Läsionen des Darmepithels zu bilden wie z.B. EHEC und EPEC verfügen über ein stark entwickeltes T3SS-Sekretionssystem, welches von Genen der Pathogenitätsinsel „locus of enterocyte affacement“ (LEE) kodiert wird und die Sekretion wichtiger Virulenzfaktoren durchführt. Nach Analysen von DENG et al. (2012) werden beispielsweise alle 25 bisher entschlüsselten EPEC- Proteine vom T3SS sezerniert, unter anderem die Toxine und Adhäsine LifA, ToxB, Efa1 und Z4332 (DENG et al. 2012).
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3 Material und Methoden
3.1 Versuchstiere
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit bovinen Monozyten und den daraus reifenden Makrophagen im Allgemeinen sowie während der so genannten Transitperiode. Daher stammten die Versuchstiere aus zwei verschiedenen Tiergruppen. Für die Messungen des Einflusses von Zellkulturüberständen auf Monozyten wurde Blut von nicht tragenden und nicht laktierenden Holsteinkühen verwendet. Die Tiere stammten aus einem Gruppenlaufstall der Rinderklinik der Tierärztlichen Hochschule Hannover und wurden mit Heu und Maissilage gefüttert.
Die Gruppengröße betrug 10 Tiere, das Durchschnittsalter lag bei 4 Jahren.
Die Blutproben zur Messung der Differenzierung von Monozyten zu Makrophagen in der Transitperiode wurden von Tieren des Institutes für Tierernährung des Friedrich- Loeffler-Institutes in Braunschweig im Rahmen des Tierversuches:
33.9-42502-04-11/0444 entnommen. Hierbei wurden 32 gesunde Holsteinkühe im Alter von zwei bis acht Jahren an den Tagen 42 und 14 vor der Geburt, sowie 7, 21 und 56 Tage nach der Geburt für die Blutentnahme herangezogen. Im Rahmen von dort stattfindenden Fütterungsversuchen wurden die Tiere zu Beginn der Versuche zusätzlich gemäß ihres BCS in zwei Gruppen eingeteilt. Kühe mit einem hohen BCS (BCShigh, Durchschnittswert 3,2) wurden 42 Tage vor der Kalbung mit einem hohen Kraftfutteranteil (60 %) gefüttert, der nach der Kalbung reduziert (30 %) und nur langsam an den abschließenden Wert (50 %, 21 Tage p.p.) angehoben wurde.
Demgegenüber wurden Tiere mit einem niedrigen BCS (BCSlow), Durchschnittswert 2,6) vor der Kalbung mit einem niedrigen Kraftfutteranteil (20 %) versorgt, der nach der Geburt auf 30 % und bereits 14 Tage p.p. auf 50 % angehoben wurde. Die Inzidenz einer subklinischen Ketose betrug mithilfe dieses Modelles > 90 % bzw.
< 10 %.
Die Skala zur Vergabe des BCS reicht von 1 bis 5. Hierbei sind ein BCS von 1 mit einer hochgradigen Unterernährung und ein BCS von 5 mit einer hochgradigen Verfettung gleichbedeutend. Zur Bestimmung werden 8 Körperteile (Dornfortsätze der Lendenwirbelsäule, Verbindung zwischen den Dorn- und Querfortsätzen, Enden der Querfortsätze, Übergang von den Dornfortsätzen zur Hungergrube auf der rechten Seite, Hüfthöcker, Sitzbeinhöcker, Beckenausgangsgrube) hinsichtlich ihrer Fettauflagen beurteilt und eine Durchschnittsnote vergeben. Bei dem BCS-Wert 3 erscheint die Wirbelsäule beispielsweise als abgerundeter Kamm, Wirbel- und Wirbelfortsätze sind visuell nicht mehr voneinander abzugrenzen, Hüft- und Sitzbeinhöcker sowie Knochen und Bänder im Bereich des Schwanzansatzes sind abgerundet, Anzeichen von Fettablagerungen sind jedoch keine erkennbar (MANSFELD et al. 2000).
