ISBN 978-3-86345-263-6
Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH 35392 Gießen · Friedrichstraße 17 · Tel. 0641 / 24466 · Fax: 0641 / 25375
E-Mail: info@dvg.de · Internet: www.dvg.de
Johanna Maria Rautmann Hannover 2015
Epigenetische Modulation boviner Monozyten und Makrophagen
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin
der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von Johanna Maria Rautmann
Heidelberg
Hannover 2015
Deutschen Nationalbibliografie;
Detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über http://dnb.ddb.de abrufbar.
1. Auflage 2015
© 2015 by Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH, Gießen
Printed in Germany
ISBN 978-3-86345-263-6
Verlag: DVG Service GmbH Friedrichstraße 17
35392 Gießen 0641/24466 info@dvg.de www.dvg.de
Epigenetische Modulation boviner Monozyten und Makrophagen
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin
der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae –
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von Johanna Maria Rautmann
Heidelberg
Hannover 2015
Tierärztliche Hochschule Hannover
1. Gutachter: Apl. Prof. Dr. med. vet. Hans-Joachim Schuberth 2. Gutachter: Apl. Prof. Dr. med. vet. Ralph Goethe
Tag der mündlichen Prüfung: 13.05.2015
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung und Zielsetzung ... 1
2 Literaturübersicht ... 3
2.1 Epigenetik ... 3
2.1.1 Organisation des Genoms ... 3
2.1.2 Epigenetische Histonmodifikationen ... 5
2.1.3 Epigenetische Modulatoren ... 7
2.1.4 Epigenetische Regulation in Monozyten und Makrophagen ... 15
2.1.5 Epigenetische Steuerung der Makrophagen-Differenzierung und -Polarisierung ... 17
2.1.6 Aktueller Kenntnisstand beim Rind ... 19
2.1.7 Peripartale Veränderungen des epigenetischen Musters von Immunzellen ... 21
2.1.8 Epigenetik und der Body Condition Score ... 22
2.2 Phänotypische und funktionelle Eigenschaften von bovinen Monozyten und Makrophagen ... 22
2.2.1 Bovine Monozyten ... 22
2.2.2 Bovine Makrophagen ... 23
2.3 Veränderungen des Immunsystems im peripartalen Zeitraum ... 24
3 Geräte, Material und Methoden ... 25
3.1 Geräte ... 25
3.2 Klinikbedarf ... 26
3.3 Laborbedarf ... 27
3.4 Kulturmedien, Puffer und Lösungen ... 28
3.5 Reagenzien ... 30
3.6 Mono- und Polyklonale Antikörper ... 32
3.6.1 Antikörper für die magnetische Zellseparation ... 32
3.6.2 Antikörper für die Membranimmunfluoreszenz ... 33
3.6.3 Antikörper für die intrazelluläre Immunfluoreszenz ... 33
3.7 Versuchstiere ... 34
3.8 Gewinnung von Blutproben ... 35
3.11 Gewinnung boviner Monozyten ... 36
3.12 Generierung von Makrophagen aus bovinen Monozyten ... 37
3.13 In-vitro-Stimulation von Monozyten ... 38
3.14 In-vitro-Generierung von Makrophagen unter dem Einfluss von CCL5 ... 38
3.15 Stimulation von Vollblut ... 38
3.16 Fixierung und Konservierung der gewonnenen Zellen ... 39
3.17 Durchflusszytometrie ... 40
3.18 Beurteilung der Zellvitalität ... 41
3.19 Membranimmunfluoreszenz ... 41
3.20 Intrazelluläre Immunfluoreszenz (ICIF) ... 43
3.21 Phagozytose ... 44
3.22 Extraktion von Histonproteinen ... 45
3.23 Bestimmung epigenetischer Marker mittels eines kolorimetrischen Tests ... 46
3.24 Statistische Auswertung ... 47
4 Ergebnisse ... 48
4.1 Methodische Vorarbeiten ... 48
4.1.1 Bindungsverhalten der Antikörper bei der intrazellulären Immunfluoreszenz ... 48
4.1.2 Vergleich der intrazellulären Immunfluoreszenz von Monozyten, Lymphozyten und Granulozyten ... 50
4.1.3 Vergleich der Histonmodifikationen von Monozyten und Makrophagen 53 4.1.4 Vergleich der intrazellulären Immunfluoreszenz mit einem kolorimetrischen Test ... 55
4.1.5 Beeinflussung der Funktion von Monozyten und Granulozyten durch Stimulation mit verschiedenen Substanzen ... 57
4.2 Epigenetische Modifikationen von Monozyten und Makrophagen während des peripartalen Zeitraums ... 58
4.2.1 Epigenetische Modifikationen von Monozyten und Makrophagen während des peripartalen Zeitraums in Abhängigkeit vom Body Condition Score der untersuchten Tiere ... 61
4.2.3 Epigenetische Modifikationen von Monozyten und Makrophagen während des peripartalen Zeitraums in Abhängigkeit vom Alter der untersuchten Tiere ... 67 4.2.4 Epigenetische Modifikationen von Monozyten und Makrophagen
während des peripartalen Zeitraums in Abhängigkeit vom Einfluss des
Zeitpunktes einer Impfung gegen BVD ... 69 4.3 Epigenetische Modifikationen bei Makrophagen ... 72 4.4 Der Einfluss verschiedener Stimulanzien auf Trimethylierungen und
Acetylierung an bestimmten Lysinresten des Histons 3 von Monozyten und Makrophagen ... 72
4.4.1 Der Einfluss verschiedener Histonmodulatoren auf die Acetylierung am H3K9 und die Trimethylierungen am H3K4 und H3K27 von Monozyten ... 73 4.4.2 Der Einfluss verschiedener Stimulanzien auf die Acetylierung am H3K9 und die Trimethylierungen am H3K4 und H3K27 bei Monozyten und
Makrophagen ... 75 4.4.3 Der Einfluss peripartaler Modulatoren auf die Acetylierung am H3K9 und die Trimethylierungen am H3K4 und H3K27 bei Monozyten ... 80 4.5 Der Einfluss verschiedener Stimulanzien auf die Entwicklung von
Monozytensubpopulationen ... 82 4.5.1 Der Einfluss der LPS-Stimulation auf die Anteile der
Monozytensubpopulationen ... 83 4.5.2 Der Einfluss der peripartalen Modulatoren auf die Anteile der
Monozytensubpopulationen ... 84 4.5.3 Der Einfluss von Histonmodulatoren auf die Anteile der
Monozytensubpopulationen ... 88 Abbildung 32: Einfluss verschiedener Stimulanzien auf die Expression von CD14 und CD16 von Monozyten. ... 89 5 Diskussion ... 91
5.1 Vergleich der intrazellulären Immunfluoreszenz mit einem kolorimetrischen Test ... 91 5.2 Vergleich des epigenetischen Profils von Monozyten, Lymphozyten und Granulozyten ... 92
5.4 Beeinflussung der Funktion von Monozyten und Granulozyten durch
Stimulation mit verschiedenen epigenetischen Modulatoren ... 97
5.5 Epigenetische Modifikationen von Monozyten und Makrophagen während des peripartalen Zeitraums ... 99
5.6 Der Einfluss verschiedener Stimulanzien auf Trimethylierungen und Acetylierung an bestimmten Lysinresten des Histons 3 bei Monozyten bzw. Makrophagen ... 103
5.7 Einfluss verschiedener Stimulanzien auf die Entwicklung von Monozytensubpopulationen ... 109
6 Zusammenfassung... 113
7 Summary ... 116
8 Literaturverzeichnis ... 118
9 Anhang ... 157
9.1 Abbildungsverzeichnis ... 157
9.2 Tabellenverzeichnis ... 160
9.3 Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen ... 161
9.4 Ergebnisse der ex-vivo Untersuchungen zu Lymphozyten und Granulozyten . ... 167
9.4.1 Epigenetische Modifikationen von Lymphozyten und Granulozyten während des peripartalen Zeitraums ... 167
9.4.2 Epigenetische Modifikationen von Lymphozyten und Granulozyten während des peripartalen Zeitraums in Abhängigkeit vom Body Condition Score der untersuchten Tiere ... 168
9.4.3 Epigenetische Modifikationen von Lymphozyten und Granulozyten während des peripartalen Zeitraums bei gesunden Tieren und Tieren mit einer postpartalen Infektionserkrankung ... 170
9.4.4 Epigenetische Modifikationen von Lymphozyten und Granulozyten während des peripartalen Zeitraums in Abhängigkeit vom Alter der untersuchten Tiere ... 172
9.4.5 Epigenetische Modifikationen von Lymphozyten und Granulozyten während des peripartalen Zeitraums in Abhängigkeit vom Einfluss des Zeitpunktes einer Impfung gegen BVD ... 173
9.5.1 LPS ... 175
9.5.2 Dexamethason und Hydrocortison ... 176
9.5.3 IFN, IL-4/IL-13, TSA, C646, GSK und 2-PCPA ... 178
Danksagung ... 180
1 Einleitung und Zielsetzung
Die Epigenetik, als in den letzten Jahren immer mehr an Bedeutung gewinnendem Feld der genetischen Forschung, beschäftigt sich mit vererbbaren Modifikationen an Chromosomen, wie an der DNA selbst oder den Proteinen des Chromatins, die jedoch nicht zu einer Änderung der DNA-Sequenz führen. Diese reversiblen und somit an die Umweltbedingungen anpassungsfähigen Modifikationen können dabei beeinflussen, ob ein Gen aktiv oder inaktiv ist (BRADBURY 2003).
Es besteht bereits ein umfangreiches Wissen über verschiedene epigenetische Modifikationen, ihre Detail-Lokalisationen und die damit verbundenen Wirkungen auf die Genexpression (KOUZARIDES 2007). Auch für epigenetisch modifizierend wirkende Enzyme weiß man vieles bezüglich ihrer Wirkung auf epigenetische Muster und der sich daraus ergebenden Bedeutung für die Genexpression. Zudem existieren viele Studien über die Wirkung verschiedenster Substanzen auf das epigenetische Profil einer Zelle durch Beeinflussung epigenetisch modifizierend wirkender Enzyme.
Dieses Wissen bezieht sich bis dato jedoch größtenteils auf die Spezies Mensch und Maus. Über die Epigenetik boviner Zellen – insbesondere der Immunzellen wie Monozyten und Makrophagen – ist noch vieles unbekannt.
Ziel dieser Arbeit war es die bisher wenig untersuchte Epigenetik boviner Immunzellen näher zu beleuchten. Hierfür wurden drei ausgewählte epigenetische Marker untersucht und ihre Ausprägung bei Monozyten, Lymphozyten und Granulozyten analysiert. Ein Teilaspekt bezog sich auf die Frage inwieweit epigenetische Modifikationen bei der Monozyten/Makrophagen-Differenzierung und der funktionellen Polarisierung von Makrophagen eine Rolle spielen. Ebenfalls von Interesse in dieser Arbeit war die Betrachtung der epigenetischen Marker in Monozyten während des peripartalen Zeitraums von Kühen, in dem es zu funktionellen Veränderungen im Immunsystem und einer erhöhten Infektanfälligkeit kommt. Um zu untersuchen, ob bestimmte epigenetische Muster in bovinen Monozyten mithilfe epigenetisch modulierend wirkender Substanzen erzeugt werden können, wurden verschiedene Stimulanzien auf ihre Wirkungen auf die epigenetischen Marker geprüft. Außerdem wurden sie hinsichtlich ihrer Wirkung auf die Funktion der stimulierten Monozyten und die Entwicklung der Monozytensubpopulationen untersucht.
Hintergrund der durchgeführten Untersuchungen war die Überlegung, dass epigenetische Regulatoren, die bestimmte Modifikationen an Histonproteinen vermitteln, eingesetzt werden können, um gezielt epigenetische Muster in Immunzellen zu erzeugen. Beispielsweise wäre eine Steuerung der Polarisierung von Makrophagen denkbar, um deren Funktionsfähigkeit im Peripartum zu verbessern, bzw. epigenetische Modifikationen, die sich ungünstig auf die Zellfunktion auswirken, zu inhibieren.
2 Literaturübersicht
2.1 Epigenetik
Unter dem Begriff Epigenetik versteht man das Feld, das sich mit Veränderungen an der DNA oder den Proteinen im Chromatin beschäftigt, die einen Einfluss auf die Expression von Genen haben. Vorgänge demnach, die mitbestimmen, ob ein Gen aktiv oder inaktiv ist - ohne dabei aber einen Einfluss auf die Sequenz der DNA zu haben. Diese Veränderungen können reversibel sein, aber auch von einer Zellgeneration zur nächsten weitergegeben werden. Die Epigenetik möchte all diese Modifikationen charakterisieren, will wissen wie sie festgelegt sind und wie die sie kontrollierenden Prozesse ablaufen. Unter einem Epigenom versteht man die Beschreibung aller Modifikationen am ganzen Genom, die nicht die DNA-Sequenz beeinflussen. Dabei verfügt ein Individuum im Gegensatz zum Genom über verschiedene Epigenome, da diese in unterschiedlichen Zelltypen variieren. Das Epigenom ist zudem keine statische Rahmenbedingung, sondern kann sich dynamisch den Gegebenheiten der Umwelt und der Zellfunktion anpassen (BRADBURY 2003).
Um diese Vorgänge zu verstehen ist es essentiell, sich den genauen Aufbau und die Struktur und Organisation des gesamten Chromatins im Zellkern zu den unterschiedlichen Phasen des Zellzyklus vor Augen zu führen.
2.1.1 Organisation des Genoms
Das Genom ist aus Platzgründen stark kondensiert. In eukaryotischen Zellen ist die DNA in Form des Chromatins organisiert (MOHRMANN u. VERRIJZER 2005). Das Chromatin besteht aus der DNA und verschiedenen chromosomalen Proteinen, an denen die Histone einen großen Anteil haben. Die Untereinheiten des Chromatins bilden die Nukleosomen (BLACK et al. 2012), wobei ein Nukleosom jeweils aus 145- 147 Basenpaaren der DNA, die sich knapp zweimal um ein Oktamer aus Histonproteinen windet, besteht. Das Oktamer der Histonproteine setzt sich aus vier verschiedenen Proteinen zusammen, H2A, H2B, H3 und H4. Je zwei der Proteine H3 und H4 bilden ein zentral liegendes Tetramer, an das sich zwei Dimere aus je einem H2A- und H2B-Protein anlagern. Zwischen zwei Nukleosomen liegt jeweils ein Abschnitt sogenannter Linker-DNA, die eine Länge von 10 bis 60 Basenpaaren hat
(PETERSON u. LANIEL 2004). Diese Anordnung der DNA wird noch weitergehend gefaltet und durch Linker-Histonproteine (H1), die mit der DNA assoziiert sind und die Nukleosome binden, stabilisiert, sodass spulenartige helikale Fasern mit einem Durchmesser von 30 nm entstehen (LUGER et al. 1997; FISCHLE et al. 2003).
Abbildung 1: Die Chromatinstruktur der DNA von Säugerzellen
Darstellung der Chromatinstruktur in unterschiedlichen Kondensationsstufen von dem sehr stark kondensierten Methaphasenchromosom bis zur Darstellung der Nukleosomen bestehend aus Histonproteinen (hier als rosa Kugel dargestellt) und sich darum windende DNA (www.scienceblogs.de).
Durch diese kompakte Chromatinstruktur ist die DNA nicht immer direkt zugänglich für Vorgänge wie Genexpression, DNA-Replikation, Reparaturen oder Rekombination. Sie muss zuerst restrukturiert und somit zugänglich für Folgeprozesse der Genexpression gemacht werden. Dies geschieht durch ATP- abhängige Remodelers, die auf verschiedene Weisen die Kontakte zwischen DNA und Histonen verändern können. Zum anderen gibt es Enzyme, die an der DNA selbst oder an nukleären Proteinen (Histonen) Modifikationen bewirken (BRADBURY 2003; FAN et al. 2003; MOHRMANN u. VERRIJZER 2005). Auch während des Zellzyklus kommt es zu Veränderungen der Chromatinstruktur. Der Zellzyklus ist ein
komplexer Prozess, der aus verschiedenen Phasen in einer bestimmten Reihenfolge besteht, und zur Mitose und der Entstehung zweier Tochterzellen führt (SCHAFER 1998). Während der Interphase des Zellzyklus ist die DNA in zwei verschiedenen Chromatinstadien – Heterochromatin und Euchromatin - organisiert, die sich in Dichte und Transkriptionsfähigkeit unterscheiden. Heterochromatin ist dichter als Euchromatin und kommt am Zentromer und an den Telomeren (genarme Regionen) vor, als Barr-Körperchen und in den Bereichen, die während der Genexpression inaktiv sind. Euchromatin ist dagegen weniger dicht und die DNA früher bereit zur Transkription, während der S-Phase wird Euchromatin schneller repliziert als Heterochromatin (ARNEY u. FISHER 2004; KOSAK u. GROUDINE 2004).
Die vorliegende Arbeit soll sich auf das Thema der Histone und deren Modifikationen beschränken.
2.1.2 Epigenetische Histonmodifikationen
Die bereits angesprochenen Modifikationen an den Histonproteinen können durch verschiedene Histon-modifizierende Enzyme verursacht werden. An den Histonen direkt kann es zu einer Vielzahl unterschiedlicher Veränderungen kommen, die unterschiedliche Lokalisationen der Histonproteine betreffen. Hierbei muss zwischen den verschiedenen Histonproteinen selbst unterschieden werden, den unterschiedlichen Aminosäuren innerhalb der Histonproteine wie Lysin, Histidin, Serin oder Arginin, und auch der genauen Lokalisation derselbigen. Die Art der Modifikation, ob Acetylierungen, Methylierungen, Phosphorylierungen oder Ubiquitinierungen spielt eine weitere Rolle. Diese durch die verschiedenen Enzyme angehängten Reste können ihrerseits wiederum in unterschiedlicher Anzahl vorhanden sein, sodass eine einfache Methylierung, aber auch eine Di- oder Trimethylierung an einem Basenrest eines Histonproteins vorliegen kann (DODD et al. 2007; KOUZARIDES 2007; SNEPPEN u. DODD 2012).
Die Differenzierung zwischen der Vielzahl der möglichen Modifikationen ist entscheidend, da die Wirkung von allen genannten Faktoren abhängig ist. So kann beispielsweise eine Trimethylierung je nach Lokalisation sich entweder hemmend oder fördernd auf die Expression von Genen auswirken (VERDONE et al. 2006;
SNEPPEN u. DODD 2012).
Acetylierungen an Lysinresten bewirken oft eine verstärkte Transkription, eine Methylierung an Lysinresten dagegen oft eine Hemmung (gene silencing). Beim
Vergleich von Eu- und Heterochromatin wird sichtbar, dass im Euchromatin vermehrt Acetylierungen an den Lysinresten der Histone drei und vier zu finden sind. Im Heterochromatin dagegen finden sich verstärkt Trimethylierungen an den Lysinresten 9 und 20 der Histone drei und vier. Ausnahmen von der Regel bestehen allerdings, z.B. durch die Anzahl der modifizierenden funktionellen Gruppen (LACHNER et al.
2003; QUINA et al. 2006; HAMON u. COSSART 2008).
Vom ‚Histon-Code‘ spricht man bei Betrachtung der Gesamtheit aller Histonmodifikationen, die die Zugänglichkeit für z.B. Transkriptionsfaktoren zur DNA steuern. Die Modifikationen sind nicht statisch, sondern reversibel und anpassungsfähig, und sie können Auskunft bezüglich der Regulation der Genexpression gebe (STRAHL u. ALLIS 2000; QUINA et al. 2006; LI et al. 2012).
Um für Histonmodifikationen festzustellen, ob sie eher eine fördernde oder eine hemmende Wirkung auf die Transkription von Genen haben, wurden Untersuchungen durchgeführt, wobei bestimmte Histonmodifikationen im gesamten Genom mit einem Transkriptionsprofil abgeglichen wurden. Aus solchen Untersuchungen ist bekannt, dass Trimethylierungen am Lysinrest 4 des Histons 3 (H3K4me3) eine stabilisierende aber auch aktivierende Wirkung, wohingegen Trimethylierungen an den Lysinresten 9 (H3K9me3) und 27 (H3K27me3) des Histons 3 eine hemmende Wirkung haben, und somit zum gene silencing führen (KOUZARIDES 2007; HAMON u. COSSART 2008). Es gibt Histonmodifikationen, die generell eine bestimmte Wirkung (Hemmung, Förderung oder Stabilisierung) auf die Genexpression haben. Dies ist oft der Fall, wenn die Modifikationen in direktem Kontakt zum Transkriptionsmechanismus stehen. Allerdings gibt es auch Histonmodifikationen, die die Gentranskription in kleineren Bereichen beeinflussen (VERMEULEN et al. 2007).
Wie schon erwähnt ist die Trimethylierung am H3K4 fast invariant mit einer aktivierenden oder zumindest stabilisierenden Wirkung auf die Transkription verbunden. Unterstützt wird dies z.B. auch dadurch, dass der Transkriptionsfaktor IID (TFIID), der für die Promotorerkennung durch die RNA-Polymerase II sehr wichtig ist, zum Teil durch Trimethylierungen am H3K4 nahe von Promotor-Regionen zu induzierbaren Genen rekrutiert wird. Dagegen ist die Trimethylierung am H3K27 eine Histonmodifikation, die nicht generell auf die Transkription einwirkt, sondern nur auf bestimmte Gene. Dadurch bestehen komplexere Möglichkeiten einer Einwirkung auf die Transkription. Dass die Wirkung der Trimethylierung am H3K27 vielfältiger ist als diese am H3K4, ist auch daran zu sehen, dass sie nicht nur in Promotorregionen zu
finden ist, sondern auch in Enhancerregionen. Eine Acetylierung am H3K9 hat wie die Trimethylierung am H3K4 eher eine aktivierende Wirkung auf die Transkription und kann sogar eine verstärkende Wirkung auf die Interaktion zwischen H3K4me3 und dem Transkriptionsfaktor IID ausüben.
Genomweite Studien an humanen Zellen haben gezeigt, dass das Muster, in dem Trimethylierungen am H3K4 aktive Promotorregionen kennzeichnen, dem der Acetylierungen am H3K9 sehr ähnlich ist. Die Lokalisation der H3K9ac ist allerdings wie die Trimethylierung am H3K27 sowohl an Promotor- als auch an Enhancerregionen zu benennen (BERNSTEIN et al. 2005; HEINTZMAN et al. 2007;
VERMEULEN et al. 2007; MEDZHITOV u. HORNG 2009; IVASHKIV 2013).
2.1.3 Epigenetische Modulatoren
Der im vorherigen Abschnitt angesprochene Histoncode, der durch die Gesamtheit der epigenetischen Modifikationen bestimmt wird, wird erzeugt und modifiziert durch verschiedene Enzyme. Zu diesen Enzymen gehören die an das Chromatin bindenden Histonacetyltransferasen (HAT), Histondeacetylasen (HDAC), Histonmethyltransferasen (HMT) und Histondemethylasen (HDM) und weitere Enzyme, die spezifische epigenetische Muster erzeugen (KLOSE et al. 2006; DODD et al. 2007; FALVO et al. 2013).
Regulatoren, die Modifikationen an den Histonen bewirken und so auch die Struktur des Chromatins beeinflussen können, können nach ihrer Wirkung in drei Gruppen eingeteilt werden. So gibt es zum einen diejenigen, die den Histonresten funktionelle Gruppen hinzufügen, und aufgrund dessen als Writer benannt werden. Hierzu gehören sowohl die HAT als auch die HMT. Als zweites kann die Gruppe der Eraser genannt werden, die entsprechende Gruppen wieder entfernen können und zu denen die HDAC und die HDM gehören. Die dritte und letzte Gruppe ist die Gruppe der Reader, die spezifische epigenetische Muster erkennen können. Die Reader binden und unterscheiden zwischen verschiedenen Histonmodifikationen und haben eine wichtige Rolle als Vermittler zwischen der Erkennung und den Effektormechanismen, die die Genexpression regulieren. Außerdem können sie andere Chromatin modifizierende Faktoren unterstützen oder auf Vorgänge der Transkription einwirken.
Zu dieser Gruppe der Reader gehören z.B. Proteine, die eine Bromodomäne oder eine Methyl-Lysine-bindende Domäne beinhalten (STRAHL u. ALLIS 2000;
ARROWSMITH et al. 2012; SNEPPEN u. DODD 2012).
Acetylierung durch Histonacetyltransferasen
Bei den Histonacetyltransferasen unterscheidet man die Enzyme des Typs A und des Typs B. Die beiden Typen dieses Enzyms unterscheiden sich voneinander durch ihre Lokalisation in der Zelle. Die Typ A Transferasen sind imZellkern zu finden und fungieren hauptsächlich über die Acetylierung N-terminaler Reste an den Histonen 3 und 4 und wirken so regulierend auf die Transkription ein. Im Unterschied dazu sind die Enzyme des Typs B im Zytoplasma zu finden und bewirken eine Acetylierung der Histonproteine direkt nach ihrer Translation um den Einbau in das Nukleosom zu fördern (RICHMAN et al. 1988; SOBEL et al. 1995; KUO et al. 1996; PARTHUN et al.
1996). Die HAT vom Typ A können noch weiter in drei Kategorien unterteilt werden:
Zum einen die GNAT-Superfamilie, zu der Gcn5 und PCAF gezählt werden, außerdem die MYST-Familie, sowie die CBP/p300-Protein-Familie (FALVO et al.
2013). Alle drei Kategorien können Acetylierungen an bestimmten Lokalisationen bewirken. So kann Gcn5/PCAF die Acetylierung am Lysinrest 9 des Histons 3, die in dieser Arbeit eine wichtige Rolle spielt, bewirken. Eine Acetylierung durch Enzyme dieser Familie steht auch in Verbindung zu einer spezifischen Rekrutierung von Transkriptionsfaktoren zu entsprechenden Zielgenen (MEDZHITOV u. HORNG 2009;
WILSON et al. 2009). Auch wenn die Enzyme jeweils nur bestimmte Reste der Histonproteine acetylieren können, ist ein Enzym nicht exklusiv an einer Lokalisation tätig. So kann eine Acetylierung am H3K9 auch durch Enzyme aus der CBP/p300- Protein-Familie verursacht werden (FALVO et al. 2013). Die Aktivität der verschiedenen Acetyltransferasen ist auch abhängig von verschiedenen anderen Faktoren wie z.B. Coaktivatoren nuklearer Rezeptoren, die modulierend auf die Transkription einwirken (CHEN et al. 1997; SPENCER et al. 1997). Für die Acetylierungen von Lysinresten sind Proteine mit sogenannten BRD-Modulen notwendig. Dieses sind Module einer bestimmten Form, die zu einer spezifischen Interaktion mit N-terminal acetylierten Lysinresten führen. Proteine, die über BRD- Module verfügen, sind zum einen Gcn5, PCAF, CBP und p300, aber auch eine Gruppe sogenannter BET-Proteine, sowie eine Anzahl verschiedener Transkriptionsregulatoren (DHALLUIN et al. 1999; HASSAN et al. 2007).
Deacetylierung durch Histondeacetylasen
Die Histondeacetylasen gehören zu den bereits angesprochenen Erasern. Sie haben die Aufgabe die Acetylierungen an den Histonresten 3 und 4, die die HAT bewirkt haben, wieder rückgängig zu machen (KOUZARIDES 2007; FALVO et al. 2013). Die HDAC können in fünf Klassen unterteilt werden. Zu Klasse I gehören die HDACs 1,
2, 3 und 8, zu Klasse IIa die HDAC 4, 5, 7 und 9, zu Klasse IIb die HDAC 6 und 10, zu Klasse III gehören die Enzyme SIRT 1-7 und zu Klasse IV wird die HDAC 11 gezählt (VILLAGRA et al. 2010; RAJENDRAN et al. 2011; SCHNEIDER et al. 2011).
Zu den klassischen HDAC gehören die Klassen I und II, von denen die HDAC der Klasse I überwiegend im Zellkern lokalisiert sind, die der Klasse II enthalten eine
„Shuttle-Sequenz“, die es ihnen erlaubt sich zwischen Kern und Zytoplasma zu bewegen (BUGGY et al. 2000; BERTOS et al. 2001). Die Spezifität der HDAC ist unterschiedlich. So können die Enzyme sehr spezifisch bestimmte Acetylierungen
„radieren“ wie verschiedene Enzyme der Klasse III. Die Spezifität kann aber auch abhängig sein von anderen Proteinen, mit denen die HDAC Komplexe bilden können (MEDZHITOV u. HORNG 2009; WILSON et al. 2009; FALVO et al. 2013).
Histonmethyltransferasen und Histondemethylasen
Die Spezifität der Histonmethyltransferasen ist wie auch die der Histondemethylasen strenger als die der HAT oder HDAC. Für die Methylierung sind also ganz bestimmte Enzyme für explizite Lokalisationen zuständig. Die Enzyme bestehen jeweils aus drei Strukturelementen und einer katalytischen Untereinheit (DOU et al. 2006) und gehören zur Familie der Proteine, die eine SET-Domain (suppressor of variegation- enhancer of zeste-trithorax) enthalten (JENUWEIN 2006). Für die in dieser Arbeit wichtigen Orte sind dies MLL1-5, SET1A, SET1B, und ASH1 für H3K4 und EZH2 für H3K27 (KOUZARIDES 2007; MEDZHITOV u. HORNG 2009; WILSON et al. 2009;
ARROWSMITH et al. 2012). Die HDM können in zwei Klassen unterteilt werden. Die Lysin-Demethylase-Familie (KDM) und die Jumonji-C-Familie (JmjC) (SHI et al.
2004; TREWICK et al. 2005; TSUKADA et al. 2006). Die HDM gehören zur Dioxygenase-Superfamilie und benötigen Sauerstoff, Eisen und Ascorbinsäure als essentielle Cofaktoren für die Demethylierung (KIM et al. 2008; PASINI et al. 2008).
Wie beschrieben sind diese Enzyme besonders spezifisch. Beispielhaft sollen die in dieser Arbeit wichtigen Lokalisationen genannt werden. So sind die Enzyme KDM1A, KDM1B, KDM2B, und KDM5A-D spezifisch für die Demethylierungen am H3K4.
Demethylierungen am H3K27 werden durch Enzyme wie JHDM1A, UTX, UTY, und JMJD3 verursacht (AGGER et al. 2007; KOUZARIDES 2007; FALVO et al. 2013).
Auch für andere Liganden oder Basen gibt es spezielle Enzyme, die zur Modifikation des Histoncodes beitragen. Allerdings soll auf diese hier nicht näher eingegangen werden, da sie für diese Arbeit von geringerer Bedeutung sind.
Beeinflussung der epigenetisch modifizierenden Enzyme
Epigenetisch modifizierend wirkende Enzyme können jedoch selbst auch beeinflusst werden. So gibt es Inhibitoren, bei denen es sich um kleine Moleküle handelt, die beispielsweise die HDAC hemmen können und so unterschiedliche Wirkungen erzielen. Sie werden unter anderem genutzt um die Rolle der Histonmodifikationen bei der Regulation der Genexpression zu untersuchen (ZHONG et al. 2007). Sie können z.B. über eine Suppression von Zytokinen und Stickoxiden anti- inflammatorische Aktivität besitzen (BLANCHARD u. CHIPOY 2005; CHOI et al.
2008). Verschiedene Studien, in denen der Einfluss von HDAC auf die TLR-regulierte Genexpression thematisiert wurde, fanden TLR-induzierbare Gene, die durch HDAC klassisch herunter reguliert wurden und die durch den Einsatz von HDAC-Inhibitoren (HDACi) üblicherweise herauf reguliert werden konnten. HDAC verringern die Expression verschiedener LPS-induzierbarer Gene in Makrophagen wie z.B. Cox-2 (AUNG et al. 2006). Ein weiteres Beispiel ist der IL-12p40-Promotor, der ebenfalls durch HDAC negativ reguliert wird (LU et al. 2005). Im Mausmodell zeigten HDACi bei verschiedenen Immunerkrankungen wie systemischem Lupus erythematosus, septischem Schock, Asthma und experimenteller autoimmuner Encephalomyelitis, dagegen anti-inflammatorische Effekte. Im Gegensatz zu der mittlerweile postulierten Annahme, dass HDAC als Repressoren der Genexpression fungieren, kam es in den Mausmodellen durch HDACi allerdings generell zu einer verringerten Produktion proinflammatorischer Zytokine (BODE et al. 2007). Jedoch konnten in Makrophagen und dendritischen Zellen auch TLR-induzierbare Gene gefunden werden, die durch HDACi verstärkt exprimiert werden. So kommt es scheinbar zu verschiedenen Wirkungen durch HDAC (HALILI et al. 2010), die von den eingesetzten TLR- Liganden abhängig sein könnten (BODE et al. 2007). Besonders beim oben erwähnten IL-12p40-Gen scheinen die HDAC für eine effiziente TLR-vermittelte Induktion notwendig (BODE et al. 2007).
Neben den genannten Enzymen und deren Inhibitoren, die das epigenetische Profil einer Zelle direkt modulieren, gibt es eine Reihe weiterer Faktoren die einen Einfluss auf das Profil haben. Diese Mediatoren können endogenen, aber auch exogenen Ursprungs sein, und umfassen unter anderem Zytokine und Chemokine, Hormone oder Glukose. Ein Beispiel ist CXCL1, ein Chemokin, das von Makrophagen, neutrophilen Granulozyten oder Epithelzellen gebildet wird. Das Chemokin bewirkt eine verstärkte Translokation des Transkriptionsfaktors NF-κB in den Kern, wo es dann zu einer Komplexbildung zwischen dem Transkriptionsfaktor und der HDAC1
kommt, was wiederum zu einer Histondeacetylierung führt (KUO et al. 2012). Das Hormon 17β-Östradiol hat einen Einfluss auf die Zellproliferation in humanen embryonalen Stammzellen, die bei einem erhöhten Spiegel des Hormons eine verringerte Proliferation zeigen, bei physiologischen Konzentrationen hingegen eine geförderte Proliferation. Dass dieser Einfluss über epigenetische Mechanismen stattfindet, wahrscheinlich über eine Beeinflussung der HDAC1, wird vermutet (WANG et al. 2011). Erhöhte Glukosewerte können epigenetisch modifizierend auf Epithelzellen wirken, sodass deren Genexpression auch bei nachfolgender Normoglykämie beeinflusst wird (EL-OSTA et al. 2008). Ebenfalls modulierend auf das Epigenom wirkt der Faktor Stress. So haben verschiedene Studien gezeigt, dass Stress sowohl im Menschen als auch im Tier persistente epigenetische Markierungen im Genom hinterlässt, die die Genexpression beeinflussen (WEAVER et al. 2004; MCGOWAN et al. 2009; MURGATROYD et al. 2009; MCGOWAN et al.
2011). Der direkte Einfluss von Stress auf das Epigenom kann in allen Lebensphasen Wirkung zeigen (HUNTER u. MCEWEN 2013).
2.1.3.1 In dieser Arbeit verwendete epigenetische Modulatoren
In dieser Arbeit wurden verschiedene Substanzen eingesetzt, um ihre Wirkung auf epigenetische Marker bei bovinen Monozyten und Makrophagen zu untersuchen.
Zu diesen Substanzen gehörten zum einen Stoffe mit bekannter histonmodulierender Wirkung wie Trichostatin A, C646, GSK und Trans-2-phenylcyclopropylamine.
Trichostatin A (TSA), ein Produkt von Streptomyces, wurde zuerst als Substanz mit fungistatischer und antibakterieller Wirkung erkannt (TSUJI et al. 1976; YOSHIDA et al. 1990). Es konnte aber gezeigt werden, dass TSA zu einer erhöhten Histonacetylierung und einer Hemmung einer HDAC der Klassen I und II führt (YOSHIDA et al. 1990). Der genaue Mechanismus, über den TSA seine Wirkung als HDACi ausübt, ist bis heute nicht bekannt. Man weiß aber, dass TSA als Breitspektrum-HDACi wirkt, die Zn-abhängigen Mechanismen der klassischen HDACs blockiert und eine hemmende Wirkung auf den Zellzyklus ausübt (YOSHIDA et al. 1990; SUN u. TANEJA 2000; VANHAECKE et al. 2004). Zudem hat TSA einen Effekt auf die Expression immunrelevanter Gene. Da es als HDACi einen hemmenden Einfluss auf die Zytokin-Genexpression, z.B. von TNF, IL-2 und IFN, hat, wird es als anti-inflammatorisch wirkende Substanz eingestuft (HALILI et al.
2010; SHUTTLEWORTH et al. 2010; ROGER et al. 2011).
C646 ist ein kleines Molekül, das spezifisch als kompetitiver Hemmer der p300 HAT wirkt (BOWERS et al. 2010; OIKE et al. 2014). Es inhibiert p300/cAMP response element binding (CREB)-proteins und antagonisiert Acetyl-CoA, das von p300 als Substrat für die Acetylierung genutzt wird (BOWERS et al. 2010). Der hemmende Effekt dieses Histonacetyltransferaseinhibitors (HATi) auf die p300 vermittelte Acetylierung wurde einer siRNA nachempfunden, die zur Aufgabe hat p300 zu senken (MIN et al. 2010).
Das in dieser Arbeit verwendete GSK-J4 ist ein Ethylesterderivat von GSK-J1, einem selektiven Jmjd3 Histondemethylaseinhibitor (HDMi). GSK-J4 wird in der Zelle recht schnell durch Esterasen zu GSK-J1 hydrolysiert (KRUIDENIER et al. 2012). GSK-J1 wirkt selektiv hemmend auf die am H3K27 wirkenden Demethylasen Jmjd3 und UTX indem es die Bindung der Demethylasen an das Histon verhindert und ist inaktiv gegenüber den anderen Demethylasen der Jmj-Familie (MACKEEN et al. 2010;
KRUIDENIER et al. 2012). Auf humane Makrophagen wirkt GSK-J4 u.a. hemmend auf die LPS induzierte proinflammatorische Zytokinproduktion, im Besonderen auf die Produktion von TNF α (KRUIDENIER et al. 2012).
Trans-2-phenylcyclopropylamine (2-PCPA) ist ein zeitabhängiger, irreversibler Inhibitor der LSD1 HDM und der Monoaminoxidasen A und B (MAO A und B). Die katalytischen Bereiche von MAO A und B und von LSD1 sind sich sehr ähnlich und alle Enzyme gehören zu den Flavin-Adenin-Dinukleotid (FAD)-abhängigen Aminooxidasen, weswegen davon ausgegangen wird, dass 2-PCPA sowohl das eine als auch das andere Enzym hemmen kann (YANG et al. 2007). In der Humanmedizin wird 2-PCPA auch als Antidepressivum bei Angstzuständen und Parkinson eingesetzt (RIEDERER et al. 2004; LEE et al. 2006; SCHMIDT u. MCCAFFERTY 2007; CHASE u. SHARMA 2013). In embryonalen Karzinomzellen konnte gezeigt werden, dass 2-PCPA zu einer Erhöhung der H3K4me führt. Im Vergleich zu anderen Inhibitoren der LSD1 hat 2-PCPA eine recht starke Wirkung (SCHMIDT u.
MCCAFFERTY 2007).
Des Weiteren wurden verschiedene andere Substanzen verwendet, zu denen Lipopolysaccharid (LPS), Interleukin (IL)-4, IL-13, Interferon (IFN) und CCL5 gehörten.
LPS ist ein Zellwandbestandteil gram-negativer Bakterien, der von TLR4-Rezeptoren erkannt wird und ein potentes Immunstimulanz darstellt (PALSSON-MCDERMOTT u.
O'NEILL 2004), das für viele Antworten auf eine Infektion mit gram-negativen Erregern verantwortlich ist. So kommt es über den TLR4 Rezeptorkomplex als Teil
des angeborenen Immunsystems und die Aktivierung verschiedener Transkriptionsfaktoren wie NFκB, MAPK und IRF zur Aktivierung oder Hemmung bestimmter Gene wie verschiedener Zytokingene (NEWTON u. DIXIT 2012;
DOHERTY et al. 2013). Eine Untersuchung, in der die Genexpression verschiedener epigenetisch wirksamer Enzyme nach LPS-Stimulation untersucht wurde, konnte zeigen, dass LPS unterschiedliche Auswirkungen auf die Expression verschiedener HDAC und einer DNA-Methyltransferase hatte (DOHERTY et al. 2013).
Die Interleukine 4 und 13 werden zu den antiinflammatorischen Zytokinen gezählt und werden unter anderem von T-Zellen (Th2) produziert (SHAO et al. 2008). IL-4 kann jedoch nach einer Gewebsverletzung auch von basophilen Granulozyten und Mastzellen sezerniert werden (BRANDT et al. 2000). Zu den Wirkungen des IL-4 zählt die Aktivierung von B-Zellen (L. CHEN et al. 2007), einem Switch der Antikörperklassen hin zu IgE und IgG4, und einer Hemmung der Th1-Zellen.
Außerdem trägt es zur Differenzierung von Th2-Zellen aus naiven T-Zellen bei. IL-13 stimuliert das Wachstum und die Differenzierung von B-Zellen, hemmt jedoch Th1- Zellen, sowie die Produktion proinflammatorischer Zytokine durch Makrophagen (JANEWAY et al. 2002). Beide Zytokine sind für Th2-Zellen für die Bekämpfung extrazellulärer Parasiten von Bedeutung (GLIMCHER u. MURPHY 2000) und spielen eine Rolle bei der Wundheilung (SHAO et al. 2008).
IFN ist ein proinflammatorisches Zytokin (TAYLOR et al. 2004), das hauptsächlich von T-Zellen (Th1) produziert wird, aber auch NK-Zellen können dieses Interferon sezernieren. IFN spielt also sowohl im Bereich der angeborenen als auch der adaptiven Immunabwehr eine Rolle (BIRON u. BROSSAY 2001; MURPHY u.
REINER 2002; ANSEL et al. 2003). Zu einer Produktion von IFN kommt es sowohl bei der Bekämpfung viraler, bakterieller als auch parasitärer Infektionen (TAYLOR et al. 2004). Wirkungen hat IFN dann auf sehr viele verschiedene Zellen, da nahezu alle Zellen über einen entsprechenden Rezeptor verfügen (TAYLOR et al. 2004):
unter anderem die Aktivierung von Makrophagen, aber auch die Regulation der Expression von über 1200 Genen (EHRT et al. 2001; MURPHY u. REINER 2002).
Das Chemokin CCL5 wird auch als RANTES (Regulated upon Activation Normal T cell Expressed and Secreted) bezeichnet. Es wird überwiegend in CD8+ T-Zellen produziert, aber auch Epithelzellen, Fibroblasten, Makrophagen oder Thrombozyten sind in der Lage dieses Chemokin zu sezernieren (APPAY u. ROWLAND-JONES 2001). Zu den vielfältigen Wirkungen dieses Chemokins gehören die Regulation der T-Zell-Differenzierung und eine Wirkung auf die Polarisierung von Th1 zu Th2
(LILLARD et al. 2001; LUTHER u. CYSTER 2001; MAKINO et al. 2002). Außerdem induziert CCL5 die Migration von Leukozyten wie T-Zellen, Monozyten, basophilen und eosinophilen Granulozyten, NK-Zellen, dendritischen Zellen und Mastzellen über eine Bindung an G-Protein-gekoppelte Rezeptoren wie CCR1 und CCR5, die auch auf Monozyten zu finden sind (SCHALL 1991; SAMSON et al. 1996). CCL5 können zudem antimikrobielle Eigenschaften zugeschrieben werden, da es die NO- Produktion in Makrophagen induziert (VILLALTA et al. 1998). Ist CCL5 während der Differenzierung von Monozyten zu Makrophagen anwesend, konnte gezeigt werden, dass die entstehenden Makrophagen hyporesponsiv gegenüber LPS sind (HUSSEN et al. 2014).
Als Stellvertreter peripartal einwirkender Mediatoren wurden Dexamethason und Hydrocortison eingesetzt.
Dexamethason, oder auch 9-Fluor-16α-methylprednisolon, gehört zur Gruppe der Glukokortikoide. Es ist ein langwirkendes Glukokortikoid, wird künstlich hergestellt und wirkt bis zu 25mal stärker als natürliche Glukokortikoide. Die Wirkung des Dexamethasons ist wie bei allen Glukokortikoiden entzündungshemmend und es wirkt dämpfend auf das Immunsystem, indem die Synthese verschiedener Chemokine und Zytokine inhibiert wird (CRINELLI et al. 2000; TSAO et al. 2004;
CLARK 2007; MARISCHLER 2007; JOHANNES et al. 2009). Unter anderem hat es eine regulierende Wirkung auf das Überleben, das Wachstum und die Differenzierung von T-Zellen, es wirkt sich hemmend auf die Bildung der NO- Synthase aus (MANSART et al. 2003) und es führt zu einer Sensitivierung von Blutgefäßen gegenüber Catecholaminen (D'EMMANUELE DI VILLA BIANCA et al.
2003).
Hydrocortison, oder auch Cortisol, ist ein primäres Glukokortikoid, das in der Nebennierenrinde gebildet wird. Hydrocortison wirkt aktivierend auf das katabole Stoffwechselgeschehen und hat wie auch das Dexamethason eine antiinflammatorische und immunsuppressive Wirkung (TSAO et al. 2004; CLARK 2007; JOHANNES et al. 2009). Außerdem hat es eine modulierende Wirkung auf den vasomotorischen Tonus kleiner Blutgefäße, indem es die Sensitivität der Gefäße gegenüber Angiotensin und Catecholaminen erhöht (TSAO et al. 2004).
Die Wirkungen des Dexamethasons und Hydrocortisons auf Monozyten und Markophagen sind in vielen Punkten sehr ähnlich, da sie als Vertreter der Glukokortikoide auch ähnliche Wirkmechanismen haben.
So werden bei Monozyten und Makrophagen die Wirkungen der Glukokortikoide über zytoplasmatische Glukokortikoidrezeptoren vermittelt, die in den Zellkern translozieren und dort als Transkriptionsfaktor Einfluss auf die Genexpression nehmen (BURNSTEIN u. CIDLOWSKI 1992; BAMBERGER et al. 1996; CLARK u.
LASA 2003). Dabei kann die Wirkung in einer positiven Regulation der Genexpression, einer Hemmung der Transkription oder auch einer post- transkriptionalen Hemmung liegen (SWANTEK et al. 1997; STEER et al. 1998;
STEER et al. 2000; CLARK u. LASA 2003). Ist der Hydrocortisonspiegel wie im Peripartum im Blut hoch (SMITH et al. 1973; GUIDRY et al. 1976) oder wie es durch andere Stressfaktoren der Fall sein kann, ist die Funktionalität mononukleärer Leukozyten beeinträchtigt (PREISLER et al. 2000). Überdies kann Hydrocortison die Bildung vieler inflammatorischer Mediatoren hemmen (BAYBUTT u. HOLSBOER 1990; CALDENHOVEN et al. 1995; SAUER et al. 1996; BLOTTA et al. 1997).
2.1.4 Epigenetische Regulation in Monozyten und Makrophagen
Die komplexen, das Immunsystem koordinierenden Vorgänge werden durch eine Vielzahl verschiedener Faktoren beeinflusst und gesteuert. Mechanismen, die die Prozesse im Rahmen einer Entzündung regulieren, können Zell-spezifischen (Rekrutierung und Aktivierung durch andere Zellen), Signal-spezifischen (NF-κB gesteuerte Aktivierung) oder Gen-spezifischen Ursprungs (transkriptionale Regulation) sein (MEDZHITOV u. HORNG 2009).
Bezüglich der epigenetischen Einflüsse ist vieles noch unbekannt. Es gibt jedoch einige Studien, die sich mit Histon-Modifikationen verschiedener Immunzellen wie T- Zellen, B-Zellen, dendritische Zellen und auch Makrophagen bei Maus und Mensch beschäftigen (BROGDON et al. 2007; NENCIONI et al. 2007; DE SANTA et al. 2009;
YAMAGUCHI et al. 2010).
Schon die Entstehung der Vorläuferzellen für Monozyten und Makrophagen im Knochenmark unterliegt epigenetischen Regulationen und wird u.a. durch die HDAC 1 und 2 beeinflusst (WILTING et al. 2010; ALVAREZ-ERRICO et al. 2014). Auch im Vergleich lymphoider und myeloider Vorläuferzellen lassen sich epigenetische Einflüsse feststellen (ALVAREZ-ERRICO et al. 2014). Im Vergleich von Monozyten und lymphoiden Zellen fällt auf, dass Monozyten über mehr hypomethylierte Regionen verfügen (ZILBAUER et al. 2013).
Für mononukleäre Zellen des Blutes scheinen HDAC für die Regulation der Immungen-Expression sehr wichtige Enzyme zu sein. Gezeigt werden konnte dies beispielsweise anhand einer Untersuchung, bei der nach LPS-Stimulation eine verstärkte Expression von HDAC 6, HDAC 7 und der DNA-Methyltransferase 3A, und durch den Einsatz von TSA eine verringerte Expression proinflammatorischer Enzyme gemessen wurde. Die Ursache für diesen Effekt wird in einer verstärkten Histonacetylierung durch TSA vermutet (DOHERTY et al. 2013).
Mikroarray-Analysen des gesamten Genoms demonstrierten, dass HDAC wichtig für die Expression von wirtsspezifischen Abwehrgenen sind wie Pattern recognition receptors (PRRs), Adaptormoleküle, Kinasen, Transkriptionsregulatoren, Komplementfaktoren, Zytokine, Chemokine und Wachstumsfaktoren (ROGER et al.
2011).
Sowohl Monozyten als auch Makrophagen können auf einen wiederholten β-Glucan- Stimulus schneller und stärker reagieren, was sich durch einen epigenetischen Mechanismus erklären lässt. An sogenannten latent enhancers kommt es während einer Stimulation zu Mono- und Trimethylierungen am H3K4 und Acetylierungen am H3K27, die bis auf die H3K4me nach der Stimulation wieder verschwinden. Die Methylierung am H3K4 persistiert für ungefähr 24 Stunden und trägt zu einer verstärkten Reaktion auf einen erneuten Stimulus bei (ALVAREZ-ERRICO et al.
2014).
Bei Makrophagen wird den epigenetischen Modifikationen eine wichtige Rolle bei der Beeinflussung von Phänotyp und Funktion beigemessen (BOWDRIDGE u. GAUSE 2010; GALLI et al. 2011). Ein bedeutsames Enzym ist hier die Jmjd3 Demethylase, die durch Demethylierungen am H3K27 zu einer M2-Polarisierung von Makrophagen beiträgt, worauf jedoch später noch einmal eingegangen werden soll (2.1.5.) (DE SANTA et al. 2007). Nach Gabe eines Jumonji-H3K27-Demethylase-Inhibitors konnte bei humanen Makrophagen eine verringerte Expression pro- inflammatorischer Zytokine nach einer Stimulation mit LPS nachgewiesen werden (KRUIDENIER et al. 2012).
Die Produktion proinflammatorischer Zytokine und Chemokine als Antwort von Makrophagen auf eine Stimulation mit LPS wird ebenfalls von epigenetischen Modulationen begleitet. So zeigten Untersuchungen ein verändertes Muster der H3- Acetylierung nach LPS-Stimulation, was hingegen nach Stimulation mit Zyto- oder Chemokinen nicht der Fall war (IGLESIAS et al. 2012). Die Produktion von IL-8 und CCL2 ist teilweise von einer Histonacetylierung und einer veränderten HDAC-
Expression abhängig. Durch Behandlung der Zellen mit einem HDACi konnte die Produktion dieser Substanzen negativ beeinflusst werden (AUNG et al. 2006;
BROGDON et al. 2007). Ähnlich sieht es auch mit der Produktion von IL-8 und TNFα durch humane Immunzellen (verwendet wurden hier eine Monozytenzelllinie sowie zwei Lymphozytenzelllinien) aus, die durch den HDACi TSA verringert werden kann (TSAPROUNI et al. 2007). Der direkte, steigernde Einfluss von LPS über den Transkriptionsfaktor NFκB auf die Expression der Jmjd3 konnte ebenfalls nachgewiesen werden (DE SANTA et al. 2007).
Auch das Auslösen einer LPS-Toleranz in murinen und humanen Makrophagen, die sich in einer verminderten Zytokinproduktion nach Stimulation zeigt, hängt mit epigenetischen Modifikationen zusammen. So konnten in Makrophagen, in denen eine LPS-Toleranz ausgelöst wurde, eine verminderte Acetylierung am H4 und eine verminderte Trimethylierung am H3K4, beides Marker, die für eine Aktivierung stehen, festgestellt werden (LYN-KEW et al. 2010; CARSON et al. 2011).
2.1.5 Epigenetische Steuerung der Makrophagen-Differenzierung und -Polarisierung
Monozyten, die im Blut zirkulieren, können sich in verschiedene Zelltypen wie Fibrozyten, dendritische Zellen oder Makrophagen differenzieren (PILLING et al.
2009; GEISSMANN et al. 2010).
Epigenetische Modifikationen sowohl an Histonen als auch an der DNA sollen an der Regulation der Phänotypen von Monozyten und Makrophagen beteiligt sein.
Allerdings sind die diesbezüglichen Daten noch sehr spärlich (ISHII et al. 2009;
TAKEUCH u. AKIRA 2011).
In einer Studie (SAEED et al. 2014) wurde das epigenetische Profil für die drei Histonmarker H3K4me3, H3K4me und H3K27ac für Monozyten und Makrophagen, und auch für Makrophagen nach LPS-Stimulation (tolerant cells) bzw. nach Stimulation mit β-Glucan (trained cells) bestimmt: H3K4me3 als Marker für Promotor, H3K4me als Marker für Enhancer und H3K27ac, was sowohl Promotor als auch Enhancer markiert (HEINTZMAN et al. 2009; RADA-IGLESIAS et al. 2011). In besagter Studie konnte bei Makrophagen festgestellt werden, dass es in Bezug auf die Acetylierung am H3K27, je nach betrachteter Genlokalisation sowohl Anstiege als auch Verminderungen im Vergleich zu den Monozyten gab. Die Trimethylierung am H3K4 zeigte sich dagegen konstant an den Promotorregionen, an denen es zu
Veränderungen am H3K27ac kam. An den Enhancerregionen kam es bei den Makrophagen je nach betrachtetem Gen ebenfalls zu einem Anstieg oder einer Verminderung der Acetylierung am H3K27. Die Methylierung am H3K4 stieg ebenfalls an, wenn es zu einer Zunahme der H3K27ac an Enhancerregionen kam.
Eine Deacetylierung am H3K27 ging aber nicht einher mit einer Demethylierung am H3K4. Nachdem auch untersucht wurde, wie die erkannten Histonveränderungen mit der Gentranskription zusammen hängen, konnte festgestellt werden, dass während der Differenzierung von Monozyten zu Makrophagen die Marker am Histon 3 positiv mit der Promotoraktivität korrelieren (H3K4me3 und H3K27ac).
Auch der Einfluss einer LPS-Stimulation wurde untersucht, da die Vermutung aufgestellt wurde, dass die dadurch entstehende LPS-Toleranz epigenetische Hintergründe hat (ähnlich wie die erhöhte Ansprechbarkeit nach Stimulation mit β- Glucan). Bei den mit LPS stimulierten Zellen konnte bei einem sehr kleinen Teil der Enhancerregionen eine verstärkte Acetylierung am H3K27 festgestellt werden. Eine Verminderung dieser Acetylierungen kam bei einigen Enhancerregionen vor.
Abschließend wurde jedoch gesagt, dass die Acetylierungen bei Monozyten an Promotor- oder Enhancerregionen mit niedrigen Levels an H3K4me3 bzw. H3K4me verbunden waren und die epigenetischen Marker eher eine Auskunft über die Transkriptionsaktivität lieferten als über den Chromatinstatus während der Differenzierung der verschiedenen Zellen.
Außerdem ist zum epigenetischen Aspekt der Differenzierung von Monozyten zu Makrophagen bekannt, dass es zu einer generellen Hochregulation der HDAC 5 kommt (BAEK et al. 2009).
Auch die Aktivierung und Polarisierung der Makrophagen nach ihrer Differenzierung aus Monozyten steht unter anderem unter dem Einfluss von Modulationen am Chromatin (VAN DEN BOSSCHE et al. 2014). Die Polarisierung auslösende Faktoren wie Infektionen, Stress, aber auch eine Entzündungsresolution oder Wundheilung können Signalkaskaden auslösen und epigenetische Mechanismen induzieren, dadurch die Genexpression und so auch Phänotypen und Funktionen der Makrophagen beeinflussen (IVASHKIV 2013). So werden beispielsweise durch IL-4 und -13, die eine Polarisierung zu antiinflammatorischen M2-Makrophagen bewirken, andere Transkriptionsfaktoren aktiviert als durch Auslöser einer M1-Polarisierung (VAN DEN BOSSCHE et al. 2014).
Für die Makrophagenpolarisierung werden unterschiedliche histonmodifizierende Enzyme verantwortlich gemacht. Unter anderem wird der H3K4 HMT MLL eine Rolle
bei der M1-Aktivierung zugesprochen (MEDZHITOV u. HORNG 2009; TAKEUCH u.
AKIRA 2011; KITTAN et al. 2013). Die Anwesenheit von IFN und LPS führt zu einer erhöhten Expression des genannten Enzyms. Eine Blockierung des Enzyms führt dagegen zu einer verminderten Induktion M1-spezifischer Gene. Jmjd3 Lysindemethylase 6B und die Histondeacetylase 3 (HDAC3) spielen im Zusammenhang mit der Makrophagenpolarisierung auch eine wichtige Rolle (VAN DEN BOSSCHE et al. 2014). Jmjd3 ist wichtig für die Regulation der M2- Polarisierung. So führt IL-4 als wichtiges Zytokin in der M2-Aktivierung zu einer Hochregulation des Transkriptionsfaktors STAT6, was wiederum zu einer verstärkten Jmjd3-Expression führt. Die Demethylase bewirkt eine verminderte Di- und Trimethylierung in den Promotorregionen für M2-Markergene, die anschließend stärker exprimiert werden. Dieser Einfluss des Jmjd3-Enzyms ist spezifisch in die M2- Polarisation involviert und es kommt nicht zu einer M1-Beeinflussung (ISHII et al.
2009; TAKEUCH u. AKIRA 2011). HDAC3 bewirkt verstärkte M1-Antworten indem viele (meist STAT1-abhängige) inflammatorische Gene aktiviert werden, bremst aber gleichzeitig auch die M2-Polarisation indem es zu Deacetylierungen in regulatorischen Regionen durch IL-4 induzierter Gene kommt und so die Aktivierung der M2-Makrophagen gehemmt wird (MULLICAN et al. 2011; CHEN et al. 2012).
Dagegen können jedoch auch Histonacetylierungen, die durch TLR-Liganden wie LPS induziert werden, die Expression verschiedener proinflammatorischer Zytokingene verstärken (TAKEUCH u. AKIRA 2011).
2.1.6 Aktueller Kenntnisstand beim Rind
Untersuchungen und wissenschaftliche Veröffentlichungen, die sich mit epigenetischen Markierungen, deren Auslösern und modifizierenden Faktoren beim Rind befassen, gibt es nur wenige.
Zum einen sind Publikationen zu erwähnen, die sich mit den ernährungsabhängigen epigenetischen Modulationen befassen wie der Hemmung von HDAC durch kurzkettige Fettsäuren (LI et al. 2008; SHIN et al. 2014). Andere befassen sich mit epigenetischen Veränderungen im Hinblick auf deren Einfluss auf die Expression von Milchproteingenen während Mastitiden oder der Euterentwicklung. Dabei wird nicht nur auf die „akute Epigenetik“ geblickt, sondern auch auf die nächste Generation der milchliefernden Tiere (transgenerationale Epigenetik) und die Einflüsse verschiedener Effekte während der Entwicklung in utero und die Leistung der Nachkommen (SINGH et al. 2010; SINGH et al. 2012; GUDEX et al. 2014). Neben
der Milchleistung wird auch die Fleischleistung unter epigenetischen Aspekten betrachtet, beispielsweise in einem Vergleich verschiedener Rinderrassen hinsichtlich ihres epigenetischen Polymorphismus und ihrer Fleischqualität (LIU et al.
2015). Und auch die Tierzucht beschäftigt sich mit epigenetischen Einflüssen und dem möglichen Nutzen von Kenntnissen darüber für den Fortschritt der Zucht, ganz konkret in einem Vergleich epigenetischer Muster in Spermatozoen mit der Fertilität der Bullen (GODDARD u. WHITELAW 2014; VERMA et al. 2014). Des Weiteren gibt es Studien, die sich mit Vergleichen der genomischen Prägung zwischen Mensch, Maus und Rind befassen. Bei diesem Imprinting handelt es sich um ein Phänomen, bei dem die Genexpression davon abhängt, ob das aktive Allel von der Mutter oder vom Vater stammt. Die genomische Prägung beruht auf epigenetischen DNA- Modifikationen im Genom der Keimzellen (KHATIB u. KIM 2008; ADALSTEINSSON u. FERGUSON-SMITH 2014). Außerdem sind Studien zu finden, die sich mit gen- spezifischen Methylierungen in Säuger-Plazenten beschäftigen (NG et al. 2010).
Sehr viel begrenzter ist die Anzahl der Veröffentlichungen in Bezug auf das Immunsystem, insbesondere auf bovine Monozyten und Makrophagen.
Eine Arbeit (CHANG et al. 2014) handelt über die verbesserte Expression von Genen in Leberzellen an E.-coli-Mastitis erkrankter Kühe, die in der Immunantwort von Bedeutung sind, und die durch epigenetische Mechanismen beeinflusst werden. Es wird auch vermutet, dass die klinischen Anzeichen und der Schweregrad der Erkrankung bei einer akuten Mastitis durch epigenetische Mechanismen moduliert werden.
Auch bovine Fibroblasten wurden betrachtet und tierindividuelle Unterschiede bei der Antwort auf eine Stimulation mit LPS in epigenetischen Einflüssen begründet (GREEN u. KERR 2014).
Eine Arbeit konnte zeigen, dass die Einwirkung verschiedener Mykotoxine von Penicillium auf bovine Makrophagen die Expression bestimmter epigenetisch regulierend wirkender Enzyme wie DNA Methyltransferasen oder der HDM Jmjd3 verändern kann (OH et al. 2013).
Eine wichtige Arbeit beschäftigte sich mit der epigenetischen Regulation der Reaktion boviner mononukleärer Zellen des Blutes auf LPS und sieht HDAC in einer wichtigen Rolle bei der Regulation der Genexpression in Bezug auf die angeborene Immunität (DOHERTY et al. 2013).
2.1.7 Peripartale Veränderungen des epigenetischen Musters von Immunzellen
Wissenschaftliche Veröffentlichungen, die sich mit dem Thema epigenetischer Veränderungen im Immunsystem während einer Trächtigkeit/Schwangerschaft beschäftigen, gibt es nur wenige.
Für Muttertiere ist bekannt, dass der Hormonstatus des Tieres während der Trächtigkeit zu einer Th2-Polarisierung führt (LIN et al. 1993; WEGMANN et al.
1993). Es wird vermutet, dass für diese Änderungen am Th1-Th2-Gleichgewicht auch epigenetische Modifikationen von Bedeutung sind.
Einflüsse auf das Epigenom des Ungeborenen können transgenerationalen Ursprungs oder auf Einflüsse auf die Mutter vor und während der Trächtigkeit zurückzuführen sein. So kann z.B. maternaler Stress zu Spätfolgen für den Nachwuchs führen und auch dessen Immunsystem beeinflussen (AERTS u. VAN ASSCHE 2006; GOTZ et al. 2007; MERLOT et al. 2008; POSTON 2010). Ein Zusammenhang von intrauterinem Stress, der durch emotionalen Stress der Mutter, Futtermangel, Hypoxie oder Strahlung bedingt sein kann, wurde in verschiedenen Untersuchungen in Zusammenhang mit späteren Erkrankungen gebracht (PRYCE et al. 2002; HANSON u. GLUCKMAN 2005; DOLINOY et al. 2007; FEINBERG 2007;
JANSSON u. POWELL 2007; JIRTLE u. SKINNER 2007; SZYF et al. 2007;
GLUCKMAN et al. 2008; HERTZ-PICCIOTTO et al. 2008).
Über die peripartale Phase, also die Zeit rund um die Geburt, die für diese Arbeit von besonderem Interesse ist, ist bezüglich epigenetischer Veränderungen und Einflüsse auf das Immunsystem ebenfalls wenig bekannt. In dieser Phase kommt es zu starken hormonellen Veränderungen des Muttertiers (KIMURA et al. 1999; WEBER et al. 2001; DOEPEL et al. 2002), womit sich die Frage stellt, ob hier ein Zusammenhang mit epigenetischen Modifikationen von Immunzellen besteht (MALLARD et al. 2010). Dass es in bovinen Lymphozyten zu epigenetischen Modifikationen an den Promotorregionen für die Zytokine IFN und IL-4 in der peripartalen Phase kommt, ist bekannt (MALLARD et al. 2010).
2.1.8 Epigenetik und der Body Condition Score
Die Ermittlung des Body Condition Score (BCS) ist ein Hilfsmittel, um den Ernährungszustand und den Anteil an Körperfett von Rindern beurteilen zu können (BROSTER u. BROSTER 1998).
Über Zusammenhänge zwischen dem BCS und der Epigenetik ist bisher noch nicht viel bekannt. Die Ernährung der Mutter vor und während der Trächtigkeit hat zumindest große Auswirkung auf das Wachstum des Nachwuchses. Es wird vermutet, dass der Fetus intrauterin „programmiert“ wird und die intrauterinen Verhältnisse somit Einfluss auf den späteren Umgang des Nachkommens mit Stressfaktoren haben (BARKER 1995; LANGLEY-EVANS 2006; OLIVER et al. 2007;
SINCLAIR et al. 2007; BERRY et al. 2008).
2.2 Phänotypische und funktionelle Eigenschaften von bovinen Monozyten und Makrophagen
2.2.1 Bovine Monozyten
Monozyten entstehen im Knochenmark und gelangen in den Blutkreislauf. Dort zirkulieren sie 1-2 Tage bevor sie in unterschiedliche Gewebe migrieren. Im Gewebe differenzieren sie sich weiter zu Makrophagen oder dendritischen Zellen (TIZARD 2004; ZIEGLER-HEITBROCK 2014).
Im Rahmen der Immunabwehr haben Monozyten unterschiedliche Aufgaben; sie sind phagozytierende Zellen und können über die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies antimikrobiell wirken (BRINKMANN et al. 2004; REVELO u. WALDRON 2012).
Monozyten nehmen über die Stimulus-induzierte Produktion von Zytokinen und Chemokinen Einfluss auf ein Entzündungsgeschehen (STOSSEL u. BABIOR 2003).
Monozyten können verschiedene Interleukine produzieren wie IL-1, IL-6 und IL-10, außerdem Tumornekrosefaktoren, Interferone wie IFN-α und IFN-β, sowie die Chemokine CCL3, CCL4 und CCL5 (SIEFF et al. 1998; WONG et al. 2011).
Monozytäre Subpopulationen unterscheiden sich sowohl bezüglich phänotypischer als auch funktioneller Eigenschaften. Sie lassen sich anhand der Expression der Oberflächenmoleküle CD14 und CD16 in klassische Monozyten (cM, CD14++
CD16−), die mit ca. 90% den größten Teil ausmachen, intermediäre (intM, CD14++
CD16+) und nicht klassische Monozyten (ncM, CD14+ CD16++) einteilen (ZIEGLER- HEITBROCK et al. 2010; HUSSEN et al. 2013). Es wird davon ausgegangen, dass die Monozyten das Knochenmark als cM verlassen, anschließend direkt ins Gewebe auswandern oder sich im Blut innerhalb weniger Tage zu intM und danach zu ncM weiter entwickeln (ZIEGLER-HEITBROCK 2014).
Die Übereinstimmung phänotypischer Merkmale von humanen und bovinen Monozytensubpopulationen lässt sich jedoch nicht komplett auf deren funktionelle Eigenschaften übertragen (HUSSEN et al. 2013). Bovine cM zeigen eine relativ starke Phagozytoseleistung, exprimieren mehr PMN-Chemokine CXCL8, CXCL1 und reagieren besser als intM und ncM auf CCL5 in der Migration. Bovine intM haben eine hohe ROS-Produktion nach Stimulation mit E. coli und produzieren am stärksten das proinflammatorische Zytokin IL-1 nach LPS/ATP-induzierter Inflammasom- Aktivierung (HUSSEN et al. 2013).
2.2.2 Bovine Makrophagen
Makrophagen sind professionelle Phagozyten und können nach ihrer Lokalisation im Gewebe oder ihrem funktionellen Phänotyp unterschieden werden (GORDON u.
TAYLOR 2005). Makrophagen kommen als gewebsspezifische Zellen vor wie z.B.
Alveolarmakrophagen, Langerhans-Zellen oder Osteoklasten. Es gibt aber auch zirkulierende Makrophagen, die bei Bedarf in ein bestimmtes Gewebe rekrutiert werden können (MURRAY u. WYNN 2011).
Funktionell lassen sich verschiedene Gruppen von Makrophagen unterscheiden.
Eine große Bedeutung haben die M1- und die M2-Makrophagen. Die M1- Makrophagen werden auch als klassisch aktivierte Makrophagen bezeichnet, entstehen unter Einfluss von Interferon- und werden durch Toll-like-Rezeptor- Liganden wie LPS aktiviert. M1-Makrophagen haben proinflammatorische Funktionen und sezernieren proinflammatorische Zytokine wie IL-1 und TNF-α. Außerdem sind M1-Makrophagen daran beteiligt eine Th1-vermittelte Immunreaktion zu fördern. M2- Makrophagen werden auch als alternativ aktivierte Makrophagen bezeichnet und entstehen unter dem Einfluss von Interleukin 4 und 13. Sie verfügen über anti- inflammatorische Funktionen und haben eine große Bedeutung bei der Wundheilung (SUTTERWALA et al. 1997; SUTTERWALA et al. 1998; MOSSER 2003; BENOIT et al. 2008; POLLARD 2009; GEISSMANN et al. 2010).
2.3 Veränderungen des Immunsystems im peripartalen Zeitraum
Im peripartalen Zeitraum finden vielfältige Veränderungen sowohl im angeborenen als auch im adaptiven Immunsystem statt, die auf viele verschiedene Einflüsse zurück zu führen sind. Diese Veränderungen sollen dazu beitragen eine sichere Trächtigkeit zu erhalten und die Gefahr eines Abortes zu minimieren.
Es zählen Metaboliten und Hormone wie β-Hydroxybutyrat, Glukokortikoide, Wachstumshormone und Glycoproteine (PAAPE et al. 2002; LIPPOLIS et al. 2006) zu diesen Einflüssen, aber auch Stress, Energie-Unterversorgung oder genetische Ursachen (SORDILLO u. STREICHER 2002; HAMMON et al. 2006; HERATH et al.
2009; SWANGCHAN-UTHAI et al. 2013).
Die Veränderungen, zu denen es kommt, finden sich in verschiedenen Bereichen des Immunsystems. So kommt es u.a. zu einer veränderten Zusammensetzung des Blutes indem der Anteil der B-Lymphozyten vor der Geburt stark ansteigt und direkt nach der Geburt wieder abfällt (VAN KAMPEN u. MALLARD 1997; VAN KAMPEN et al. 1999; ASAI et al. 2000). Der Anteil der T-Zellsubpopulationen fällt im Zeitraum um die Geburt stark ab, die Monozyten im Blut sind dagegen um die Abkalbung herum erhöht vorzufinden (KIMURA et al. 2002). Neutrophile Granulozyten zeigen eine verminderte Phagozytosekapazität und eine verminderte Migrationsfähigkeit ins Gewebe. Diese herab gesetzte Leistung der Zellen bleibt auch in der Frühlaktation bestehen (MALLARD et al. 1998; MEHRZAD et al. 2001; PAAPE et al. 2002;
LIPPOLIS et al. 2006). Im Peripartum ist auch eine Veränderung der IgG-Gehalte im Blut festzustellen. So kommt es ca. vier Wochen vor der Geburt durch hormonelle Einflüsse zu einem verminderten IgG1-Spiegel im Blut, da diese Antikörper verstärkt in die Milchdrüse transportiert werden und sich dort im Kolostrum ansammeln (PORTER 1973; LASCELLES 1979; TIZARD 2004; MAYER et al. 2005). Neben dem oben erwähnten Abfall der T-Zell-Subpopulationen im Peripartum kommt es zu einer Th2-Polarisierung. Die durch diesen Shift des Th1-Th2-Gleichgewichts eher anti- inflammatorische Ausrichtung des Immunsystems findet zugunsten des Embryos und dem Erhalt der Trächtigkeit statt, führt aber auch dazu, dass eindringende Pathogene nicht optimal bekämpft werden können (MAEDA et al. 2013). Dies wird generell als Ursache der erhöhten peripartalen Infektanfälligkeit von Kühen angesehen (CALDER 1995; SORDILLO et al. 1995; POLITIS et al. 1996; KIMURA et al. 1999; PREISLER et al. 2000; AITKEN et al. 2011).
3 Geräte, Material und Methoden
3.1 Geräte
Absorptions-Reader „ELx 800“ BioTek, Bad Friedrichshall Aqua dest. Aufbereitungsanlage Umkehr-
Osmose-Anlage, „Typ RO 50/14SMB Typ I“
Wasser- und Regenerierstation, Barsbüttel
Aqua tridest. Aufbereitungsanlage „SG Reinstwasser System Typ SG-RS90-4 UF“
Wasser- und Regenerierstation, Barsbüttel
Autoklav Typ GE406 Getinge AB, Getinge/Schweden
Brutschrank mit CO2-Begasung, Baureihe 5060
Heraeus, Hanau
Bunsenbrenner mit automatischer Zündung Wartewig (6.001.000), Göttingen Eismaschine Typ UBE 30-10 Ziegra, Isernhagen
Fluoreszenz-Durchflusszytometer, Modell Accuri C6, mit angeschlossenem Computer
BD Biosciences, Heidelberg
Fluoreszenzmikroskop „Eclipse 80i“ Nikon, Düsseldorf
Invertmikroskop Zeiss, Oberkochen
Kühlschrank mit Gefrierfach (-20°C) Einzelhandel Kühlzentrifuge Varifuge K mit Tragwinkelrotor,
Hochgeschwindigkeitsaufsatz und Mikrotiterplattenrotor
Heraeus Instruments, Osterode
Laborfeinwaage „TE 1249“ Sartorius GmbH, Göttingen
Laborwaage „BL310“ Sartorius GmbH, Göttingen
MACS® MultiStand Metallständer Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach Magnetrührer mit Heizplatte Janke und Kunkel, Staufen MIDI MACSTM Separations-Einheit Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach
Minishaker MS2 IKA, Staufen
Minizentrifuge National Labnet CO., Woodbridge, NJ, USA
Orbitalschüttler „Titramax 1000“ Heidolph, Schwabach Pipetten, einstellbar „pipetman” (1-20 µl, 10-
100 µl, 20-200 µl, 100-1000 µl)
Gilson, Villers Le Bel/Frankreich
Pipette, einstellbar „Transferpipette®“ (2- 20µL)
Brand, Wertheim
Pipettierhilfe „accu-jet®“ Brand, Wertheim Plastikbox mit Gittereinsatz Einzelhandel
Plattenzentrifuge mit Plattenrotor (UJ II KS) Heraeus-Christ. Osterode
QUADRO MACS Separationseinheit Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach Reinwerkbank Laminair HL2448 Heraeus, Hanau
Rüttler für Mikrotiterplatten „AM69 Microshaker“
Dynatec, Zug/Schweiz
Schüttelinkubator „RS 90-4 UF“ SG Barsbüttel
Tiefkühlschrank -80 °C Thermo Scientific, Osterode Tischzentrifuge „Hermle Z230M“
Zählkammer nach Bürker Brand, Wertheim
Zentrifuge Espresso Personal Microzentrifuge Thermo Scientific, Osterode Zentrifuge „Megafuge 1.0R“ Heraeus Instruments, Osterode Zentrifuge Multifuge 1 S-R Thermo Scientific, Osterode
3.2 Klinikbedarf
Kanülen 1,20 x 40 mm, steril „Hypodermic Needle“
Henry Schein, Hamburg
Staukette nach Witte Eickemeyer, Tuttlingen
Vacutainer Brand Luer Adapters Becton Dickinson, Heidelberg Vacutainerröhrchen, 10 ml, Heparin (170 IU) Becton Dickinson, Heidelberg
