Die Induktion von Immun-Training und -Toleranz in bovinen Monozyten und Makrophagen durch Mikroorganismen-assoziierte molekulare Muster
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von
Lisa-Marie Schünemann Bielefeld
Hannover 2020
Arbeitsgruppe Immunologie
1. Gutachter: Apl. Prof. Dr. H.-J. Schuberth
2. Gutachter Prof. Dr. M. Hewicker-Trautwein
Tag der mündlichen Prüfung 29. Oktober 2020
Émilie du Châtelet
Für die, die ich Familie nennen darf
1 Einleitung und Zielsetzung ... 9
2 Literaturübersicht ... 11
2.1 Das Konzept des immunologischen Gedächtnisses ... 11
2.2 Gedächtnis des angeborenen Immunsystems ... 12
2.3 Gedächtnisinduktion im angeborenen Immunsystem ... 13
2.4 Rezeptoren, über die Gedächtnis induziert wird ... 13
2.4.1 Gedächtnis-Induktoren ... 15
2.4.2 Wirtseigene Faktoren als Gedächtnis-Induktion ... 17
2.4.3 Gedächtnis-fähige angeborene Immunzellen ... 19
2.5 Mechanismen des Gedächtnisses des angeborenen Immunsystems ... 25
2.5.1 Epigenetische Modifikationen ... 25
2.5.2 Metabolische Modifikationen ... 26
2.5.3 Sekretorische Modifikationen... 27
2.5.4 Beeinflussung der Monozyten-Makrophagen-Differenzierung ... 30
2.6 Das Gedächtnis des angeborenen Immunsystems bei Nutztierspezies ... 31
3 Methoden ... 34
3.1 Gewinnung von leukozytären Subpopulationen aus dem peripheren Blut ... 34
3.1.1 Gewinnung von bovinem, venösen Blut ... 34
3.1.2 Separation mononukleärer Zellen ... 34
3.1.3 Magnetische Zellseparation ... 35
3.2 Durchflusszytometrie ... 39
3.3 Induktion eines Gedächtnisses des angeborenen Immunsystems ... 40
3.3.1 Induktion eines Gedächtnisses in bovinen, Plastik-adhärenten Monozyten ... 40
3.3.2 Gedächtnisinduktion in CD14-positiven, bovinen Monozyten ... 44
3.3.3 Induktion von Gedächtnis in monozytären Subpopulationen ... 45
3.3.4 Induktion von Gedächtnis in Gesamt-Monozyten ... 46
3.4 Deduktion des Gedächtnisses auf einzelne Zellpopulationen mittels CellTraceTM FarRed und intrazellulärer TNF--Detektion ... 47
3.4.1 Proliferation boviner, CellTraceTM FarRed-markierter Lymphozyten ... 47
3.5 TNF--Nachweis mittels intrazellulärer Immunfluoreszenz (ICS) ... 50
3.6 Membranimmunfluoreszenz ... 51
3.7 Enzyme-linked immunosorbent assay ... 54
3.8 Statistische Auswertung ... 56
4 Ergebnisse ... 58
4.1 Toleranz durch LPS-Konditionierung von mononukleären Zellen ... 58
4.1.1 Einfluss der Konditionierung mit LPS auf die Zytokin-Sekretion ... 58
4.1.2 Einfluss der Konditionierung auf den Phänotyp boviner toleranter Makrophagen . 63 4.2 Training durch -Glucan-Konditionierung von mononukleären Zellen ... 66
4.2.1 Einfluss der Konditionierung mit -Glucan auf die Zytokin-Sekretion ... 66
4.2.2 Einfluss der Konditionierung auf den Phänotyp boviner trainierter Makrophagen . 76 4.3 Induktion von Gedächtnis in bovinen CD14+-Monozyten ... 79
4.4 Korrelation zwischen einzelnen Zellpopulationen & dem Gedächtnis des angeborenen Immunsystems ... 83
4.5 Induktion eines Gedächtnisses in einzelnen bovinen Monozyten- Subpopulationen ... 86
4.6 Induktion einer Toleranz in Gesamt-Monozyten ... 88
4.7 Training durch -Glucan-Konditionierung von Gesamt-Monozyten ... 93
4.7.1 Einfluss der Konditionierung mit Glucan auf die Zytokinsekretion ... 93
4.7.2 Einfluss der Konditionierung mit Glucan auf den Phänotyp boviner Makrophagen ... 98
4.8 Induktion von Gedächtnis in FR-markierten Monozyten ... 101
4.8.1 Toleranz durch LPS-Konditionierung in FR-markierten Monozyten ... 101
4.8.2 Induktion von Training in FR-markierten Monozyten ... 104
5 Diskussion ... 108
5.1 Bovine mononukleäre Zellen reagieren auf Konditionierung mit LPS und 10 µg G ... 109
5.3 Nur klassisch-aktivierte Makrophagen sezernieren signifikante Mengen an
TNF- in Reaktion auf 10 ng LPS ... 111
5.4 Toleranz benötigt die Anwesenheit lymphoider Zellen ... 113
5.5 Training ist von nicht-klassischen Monozyten abhängig ... 117
5.6 Ausblick ... 121
6 Zusammenfassung ... 123
7 Summary ... 126
8 Literaturverzeichnis ... 129
9 Anhang ... 156
9.1 Keine Beeinflussung der Proliferation boviner Lymphozyten durch CellTraceTM FarRed ... 156
9.2 Laborgeräte ... 158
9.3 verwendete Software ... 160
9.4 Labormaterial ... 160
9.4.1 Klinikbedarf ... 160
9.4.2 Laborbedarf ... 160
9.4.3 Reagenzien und Kits ... 162
9.4.4 Antikörper ... 165
9.4.5 Lösungen, Puffer und Kulturmedien ... 165
9.5 Versuchstiere ... 169
9.6 Abbildungsverzeichnis ... 169
9.7 Tabellenverzeichnis ... 171
9.8 Abkürzungsverzeichnis ... 171
1 E INLEITUNG UND Z IELSETZUNG
Jede Infektion des Körpers wird als Erstes durch Zellen und lösliche Stoffe des angeborenen Immunsystems bekämpft. Das angeborene Immunsystem hat aufgrund der Schnelle seiner Reaktion und seiner weiten Verbreitung innerhalb des Organismus das Potential, Infektionen zu kontrollieren, sodass es nicht zu einer klinischen Ausprägung der Infektion kommt. Je besser die Funktionsweise dieses Systems verstanden wird, desto zielgerichteter kann dieser Teil des Immunsystems beeinflusst werden.
Das angeborene Immunsystem ist in der Lage, unterschiedliche Erreger-Klassen zu erkennen und jeweils adäquat auf diese zu reagieren. Dabei wird in letzter Zeit wiederholt die Hypothese geprüft, ob Zellen des angeborenen Immunsystems dazu gebracht werden können, auf unterschiedliche, effektivere Weise auf ein und denselben Erreger zu reagieren. Für verschiedene humane und murine Zellen konnte diese Hypothese bereits durch detaillierte Erkenntnisse gestützt werden und das Phänomen wird inzwischen verbreitet als Gedächtnis des angeborenen Immunsystems bezeichnet (QUINTIN et al. 2012). Um Zellen des angeborenen Immunsystems dazu zu veranlassen, anders zu reagieren, werden entweder native, attenuierte oder tote Erreger sowie Erregerbestandteile eingesetzt (KLEINNIJENHUIS et al. 2012; QUINTIN et al. 2012).
Wenn nun Zellen des angeborenen Immunsystems mit solchen Erregern oder Erregerbestandteilen konditioniert werden, reagieren sie anders auf einen späteren Kontakt mit einem Erreger als solche Zellen, die nicht konditioniert wurden. Inwiefern sich die Reaktion konditionierter von nicht-konditionierten Zellen unterscheidet, ist abhängig von der Art und der Konzentration des Erregers, der zur Konditionierung eingesetzt wird. So führen geringe Konzentrationen später tendenziell zu einer stärkeren pro-inflammatorischen Reaktion, die als Training des angeborenen Immunsystems oder Immun-Training bezeichnet wird (IFRIM et al.
2014). Training des angeborenen Immunsystems kann außerdem oft durch Konditionierung mit Pilzen oder Pilzbestandteilen ausgelöst werden (QUINTIN et al. 2012). Hohe Konzentrationen führen tendenziell zu einer geringer ausgeprägten pro-inflammatorischen Reaktion, die als Toleranz der angeborenen Immunsystems oder Immun-Toleranz bezeichnet wird (IFRIM et al.
2014). Um eine Toleranz des angeborenen Immunsystems auszulösen, kann eine Konditionierung mit dem Endotoxin gram-negativer Bakterien durchgeführt werden (NOVAKOVIC et al. 2016).
Im Zuge der Definition des Gedächtnis-Begriffes wurden gewisse Kriterien bestimmt, die für eine Bezeichnung als Gedächtnisses des angeborenen Immunsystems erfüllt sein sollten. Beim Rind wurde auf Grundlage dieser Kriterien bislang erst für einen Erreger die Fähigkeit nachgewiesen, ein Training des angeborenen Immunsystems auszulösen (HAMON u. QUINTIN 2016; GUERRA-MAUPOME et al. 2019). In dieser Arbeit sollte darum ein anderer Erregerbestandteil auf seine Trainings-induzierende Wirkung geprüft werden. Zudem sollte eine Toleranz des angeborenen Immunsystems bei Einhaltung der gegebenen Kriterien nachgewiesen werden. Ein weiterer Bestandteil dieser Arbeit war, das Gedächtnis des angeborenen Immunsystems auf einzelne Zellpopulationen zurückzuführen. Dabei sollte analog zu Erkenntnissen im humanen Bereich ein Fokus auf den Monozyten liegen. Da die Gruppe der Monozyten nicht homogen ist, war die Überprüfung der Beteiligung einzelner Monozyten- Subpopulationen Bestandteil dieser Arbeit. Unabhängig von der Subpopulation entstehen aus Monozyten Makrophagen, welche eine Zellpopulation von hoher Plastizität bilden. Makrophagen können sich in unterschiedliche funktionelle Richtungen entwickeln. Dementsprechend sollte hier geprüft werden, ob die Konditionierung von Monozyten einen Einfluss auf die Entwicklung der Makrophagen nimmt. Zugleich sollte der Zusammenhang zwischen Makrophagen- Entwicklung und Gedächtnis von einer weiteren Seite beleuchtet werden, indem Makrophagen aktiv in eine vorgegebene Richtung differenziert wurden und die Entwicklung von Gedächtnis unter diesen Umständen untersucht wurde.
Übergeordnetes Ziel ist es, die Funktionsweise des Gedächtnisses des angeborenen Immunsystems weiter aufzuklären, um dieses im klinischen Bereich fundiert beeinflussen zu können. Dadurch kann das angeborene Immunsystem in die Lage versetzt werden, sein volles Potential zu Verhinderung und Eindämmung von Infektionen bei gleichzeitig minimaler Schädigung des Organismus durch enge Regulation der Immunreaktion auszuschöpfen.
2 L ITERATURÜBERSICHT
In human- wie veterinärmedizinischen Kontexten hat die Vermeidung von Erkrankungen eine höhere Qualität als die Bekämpfung derselben. Im Rahmen von Infektionserkrankungen kommt neben der Meidung möglicher Pathogene der Prophylaxe eine bedeutende Rolle zu. Die Impfung war historisch der erste erfolgreiche immunprophylaktische Ansatz, den Organismus gegen bestimmte Krankheiten in einen unempfindlichen Status zu versetzen (MCVEY u. SHI 2010).
Die zugrungeliegenden Mechanismen dieses zunächst rein empirischen Ansatzes wurden nachfolgend sukzessive aufgeklärt. Heute führt man den durch eine Impfung vermittelten Schutz auf den adaptiven Teil des Immunsystems zurück, der nach abgeschlossener Immunisierung schneller und stärker auf eine belastende Infektion reagiert, da er sich an den geimpften Erreger erinnert (VETTER et al. 2018). Klinisch gewünscht ist ein Zustand, der eine solche Infektion nicht erkennen lässt, die Infektion also klinisch inapparent verläuft (DOHERTY et al. 2016).
In Abgrenzung zum adaptiven Immunsystem wurde dem angeborenen Immunsystem ein solches Gedächtnis bislang abgesprochen und die Rolle eines schnell, jedoch immer gleich reagierenden Teils des Immunsystems zugewiesen. In den letzten zehn Jahren wurde jedoch auch für das angeborene Immunsystem nachgewiesen, dass es sich an einen zurückliegenden Pathogenkontakt erinnert und auf einen weiteren Kontakt in einer anderen Art als zuvor reagiert, wobei dieses Gedächtnis sich von dem Gedächtnis des adaptiven Immunsystems unterscheidet (HAMON u.
QUINTIN 2016).
2.1 D AS K ONZEPT DES IMMUNOLOGISCHEN
G EDÄCHTNISSES
Wird das Thema des immunologischen Gedächtnisses betrachtet, so ist zumeist die Gedächtnisfunktion des adaptiven Immunsystems gemeint. Das Gedächtnis des adaptiven Immunsystems besitzt drei entscheidende Eigenschaften: Es ist spezifisch für ein antigenes Epitop und führt sowohl zu einer schnelleren, als auch zu einer adäquateren Reaktion (PRADEU u. DU PASQUIER 2018). Die hohe Spezifität ist dabei auf die beteiligten Zellen zurückzuführen.
B- und T-Lymphozyten besitzen einen B- beziehungsweise T-Zell-Rezeptor, der durch Gen- Rekombination eine hohe Diversität besitzt und für ein Epitop spezifisch ist (SANDRA C. A.
NIELSEN u. BOYD 2018). Gedächtnis-B-Zellen reagieren zum Beispiel deswegen schneller,
weil sie sich im Gegensatz zu ihren naiven Pendants in mukosalen Oberflächen und damit näher an der Eintrittsstelle von Pathogenen befinden (ZINKERNAGEL 2002). Da bei einem Teil der B-Gedächtniszellen bereits ein Antikörper-Klassenwechsel erfolgt ist und bei Reaktivierung Immunglobulin G oder Immunglobulin A sezerniert wird, ist die Reaktion außerdem adäquater für das betreffende Pathogen (TAYLOR et al. 2012). Gedächtnis-T-Zellen lassen sich in verschiedene Gruppen einteilen, befinden sich zum Teil ähnlich wie B-Zellen bereits im Gewebe und können dort direkte Effekte wie eine zytolytische Aktivität vermitteln. Eine andere Gruppe von Gedächtnis-T-Zellen befindet sich weiterhin in der Zirkulation und hat gegenüber naiven T- Zellen einen Vorteil bei der Interaktion mit dendritischen Zellen (SALLUSTO et al. 1999).
2.2 G EDÄCHTNIS DES ANGEBORENEN I MMUNSYSTEMS
Das Gedächtnis des angeborenen Immunsystems hat zwei Grundeigenschaften. Die erste besteht in einer Antigen-Unspezifität des entstehenden Gedächtnisses. Unspezifität heißt in diesem Zusammenhang, dass sich der Schutz durch das Gedächtnis des angeborenen Immunsystems auf andere Erreger als den initial verabreichten erstreckt, ja sogar Schutz gegen eine andere Erregerklasse vermittelt werden kann (QUINTIN et al. 2012).
Die zweite Eigenschaft besteht darin, dass die Gedächtnisfunktion nicht zwangsläufig in einer Steigerung von Immunfunktionen besteht, sondern auch eine Verminderung zur Folge haben kann. Die Verminderung wird dabei als Immuntoleranz des angeborenen Immunsystems, die Steigerung als Immuntraining des angeborenen Immunsystems bezeichnet (HAMON u.
QUINTIN 2016).
Seit Längerem bekannt und erforscht ist eine spezielle Form der Immuntoleranz des angeborenen Immunsystems, welche als Lipopolysaccharid- (LPS) oder Endotoxin-Toleranz bezeichnet wird. Dabei führt eine Konditionierung mit LPS zu einer verringerten Reaktivität gegenüber einer Stimulation mit LPS oder einer E. coli-Infektion. Eine solche Immuntoleranz des angeborenen Immunsystems wird auch für das Vorkommen einer Immunparalyse nach überstandener Sepsis beim Menschen verantwortlich gemacht (BISWAS u. LOPEZ-COLLAZO 2009). Neben dieser spezifischen Form lässt sich nach Konditionierung mit bestimmten Mikroorganismen-assoziierten molekularen Mustern auch eine Toleranz des angeborenen Immunsystems gegenüber anderen Erregern oder Erregerklassen nachweisen (IFRIM et al. 2014).
Hinweise auf das Vorhandensein eines Trainings des angeborenen Immunsystems ergaben sich zuerst aus der Analyse von Metadaten bezüglich der Impfung mit dem Bacillus Calmette-Guérin (BCG), einem Impfstoff gegen Tuberkulose (HIGGINS et al. 2016). Den dort beschriebenen unspezifischen Schutz konnte man im Mausmodell replizieren, in dem nach einer Konditionierung durch BCG-Impfung ein Schutz gegen diverse Erregerklassen nachgewiesen wurde (SHER et al. 1975). Auch in vitro lässt sich dieser Effekt an verschiedenen Zellpopulationen nachweisen (HAMON u. QUINTIN 2016).
2.3 G EDÄCHTNISINDUKTION IM ANGEBORENEN
I MMUNSYSTEM
Damit ein Gedächtnis des angeborenen Immunsystems induziert werden kann, muss eine Zelle des angeborenen Immunsystems mit einem Gedächtnis-induzierenden Stoff in Kontakt kommen. Diese Kontaktaufnahme erfolgt von Seiten der Zelle über Rezeptoren, die im Folgenden beschrieben werden.
2.4 R EZEPTOREN , ÜBER DIE G EDÄCHTNIS INDUZIERT WIRD
Körperfremde Organismen werden durch das angeborene Immunsystem anhand molekularer Muster erkannt, welche für verschiedene Mikroorganismen spezifisch sind (microbe-associated molecular patterns, MAMPs) (AUSUBEL 2005). Hierfür existiert eine Reihe von Mustererkennungsrezeptoren (pattern recognition receptor, PRR), die von diversen professionellen und nicht-professionellen Zellen exprimiert werden. Diese Rezeptoren sind in der Lage, nicht nur MAMPs, sondern auch körpereigene Gefahrenmoleküle (danger associated molecular patterns, DAMPs) zu erkennen (CARTY u. BOWIE 2011). Die Bindung von Liganden an solche Rezeptoren löst in aller Regel die Transkription von Genen aus, welche pro-inflammatorische Substanzen wie Zytokine, Chemokine und antimikrobielle Peptide kodieren (AUSUBEL 2005).
Lokalisiert sind PRRs entweder in Membranen oder zytoplasmatisch (TAKEUCHI u. AKIRA 2010).
Toll-like-Rezeptoren (TLRs) bilden eine Gruppe der Transmembran-PRRs. Zehn verschiedene TLRs in Menschen und zwölf verschiedene TLRs in Mäusen können sowohl Bakterien, als auch Viren und Protozoen erkennen. Dabei befinden sich PRRs, welche virale molekulare Muster
erkennen, zumeist in der Membran von Endolysosomen, während solche, die Bakterien erkennen, vor allem in der Plasmamembran vorkommen (AKIRA et al. 2006). Die unterschiedliche Reaktion auf Liganden ist unter anderem auf die Regulation der Expressionsdichte dieser Rezeptoren zurückzuführen, so hat Übergewicht im Tiermodell eine erhöhte TLR-Expression zur Folge, welche durch Bewegung herunterreguliert werden kann (JIALAL et al. 2014; RADA et al. 2018). Auch beim Menschen korreliert die TLR-Expression positiv mit metabolischen Größen wie der Insulin-Resistenz, wohingegen der Effekt von Bewegung hier nicht eindeutig ist (KÖNNER u. BRÜNING 2011; RADA et al. 2018).
Eine weitere Gruppe der Transmembran-PRRs bilden die C-Typ-Lektin-Rezeptoren (CLRs), welche anhand von Sacchariden Viren, Bakterien, parasitische Würmer und Pilze erkennen und entweder in der Plasmamembran zu finden sind oder in seltenen Fällen proteolytisch abgespalten werden (ZELENSKY u. GREADY 2005; GEIJTENBEEK u. GRINGHUIS 2009). Auch die Expression von CLRs wird reguliert, wobei für CLRs wie DEC-205 beschrieben ist, dass es bei Aktivierung von Zellen vermehrt exprimiert wird, wohingegen andere CLRs wie CD206 auf reifen dendritischen Zellen vermindert exprimiert werden (KATO et al. 2000).
Agonisten an PRRs vermitteln nicht nur inflammatorische Wirkungen, sondern auch Gedächtnis in den Zellen des angeborenen Immunsystems. Dies wurde zuerst in Form der Toleranz des angeborenen Immunsystems als Reaktion auf LPS-Konditionierung beschrieben, welche unter anderem über TLR 4 vermittelt wird und unten weiter besprochen wird. Training des angeborenen Immunsystems wurde zuerst auf Liganden von Dectin-1, einem C-Typ-Lektin- Rezeptor, zurückgeführt (QUINTIN et al. 2012). Ifrim et al. untersuchten dann eine Vielzahl von PRR-Liganden und konnten für Agonisten an TLR 2, 3, 4, 5 und 7/8, jedoch nicht für Agonisten an TLR 9 eine induzierende Wirkung bezüglich des Gedächtnisses des angeborenen Immunsystems nachweisen. Ob dabei Training oder Toleranz des angeborenen Immunsystems induziert wurde, zeigte sich in dieser Arbeit abhängig von der Konzentration der Agonisten, wobei höhere Konzentrationen Toleranz des angeborenen Immunsystems und niedrigere Konzentrationen Training desselben auslösten (IFRIM et al. 2014). Zu den Agonisten an PRRs, welche ein Gedächtnis des angeborenen Immunsystems auslösen können, zählen sowohl MAMPs wie LPS als auch DAMPs wie oxidierte Phospholipide (IFRIM et al. 2014) (VAN DER VALK FLEUR et al. 2016).
Auch Rezeptoren für körpereigene Moleküle wie Zytokine oder Wachstumsfaktoren, die nicht zu den DAMPs zählen, können ein Gedächtnis des angeborenen Immunsystems vermitteln. Da hierbei jedoch nur einzelne Rezeptoren und nicht Rezeptor-Gruppen untersucht wurden, werden diese Rezeptoren bei der Besprechung ihrer Agonisten erläutert.
2.4.1 GEDÄCHTNIS-INDUKTOREN
Zur Induktion eines Gedächtnisses des angeborenen Immunsystems wurden zuerst akzidentiell Impfstoffe oder Mikroorganismen verwendet (BURGESS et al. 2014; HIGGINS et al. 2016). Als das Prinzip des Gedächtnisses dahinter erkannt wurde, untersuchte man diese Induktoren und weitere Substanzen eingehender auf ihre Fähigkeit, ein Gedächtnis des angeborenen Immunsystems zu induzieren (IFRIM et al. 2014; KLEINNIJENHUIS et al. 2014; R. J. ARTS et al. 2015). Inzwischen ist bekannt, dass sowohl diverse molekulare MAMPs, Viren-spezifische Moleküle als auch Zytokine ein Gedächtnis des angeborenen Immunsystems vermitteln können (IFRIM et al. 2014; BORRIELLO et al. 2017). Im Folgenden werden die am besten untersuchten Liganden für CLRs und TLRs als Induktoren eines Trainings des angeborenen Immunsystems oder einer Toleranz desselben vorgestellt.
Beta-Glucane
Beta-Glucane (G) sind verzweigte Polysaccharide, die vor allem in der Zellwand von Pilzen, aber auch in jener von Pflanzen vorkommen (MIHAI G. NETEA et al. 2008; MIYAMOTO et al. 2018). Da G nicht in tierischen Geweben vorkommen, werden sie als Mikroorganismen- assoziierte molekulare Muster definiert (AUSUBEL 2005). Diese werden von diversen Zellen des Immunsystems, darunter Makrophagen und natürliche Killerzellen (NK-Zellen), durch verschiedene Rezeptoren erkannt (BOHN u. BEMILLER 1995). Neben dem Komplementrezeptor CR3, Laktosylzeramid, scavenger Rezeptoren und dem von Langerhans- Zellen exprimierten Langerin spielt Dektin-1 eine herausragende Rolle (ROSS et al. 1987; SATO et al. 2006; VERA et al. 2009; DE JONG et al. 2010). Dektin-1 ist ein C-Typ-Lektin-Rezeptor, welcher unter anderem auf Makrophagen und dendritischen Zellen exprimiert wird (GANTNER et al. 2003). Bei Bindung von G an Dektin-1 werden über die Aktivierung des NFB- Signalweges Phagozytose, ROS- und Zytokin-Produktion verstärkt (BROWN et al. 2003;
HERRE et al. 2004; UNDERHILL et al. 2005). Inwieweit Dektin-1 mit Toll-like- oder Komplement-Rezeptoren kooperiert, ist noch nicht geklärt und hängt mutmaßlich von der
Reinheit der verwendeten G-Präparation und der Löslichkeit des verwendeten G ab (HARADA u. OHNO 2008).
Im Rahmen der Gedächtnisinduktion im angeborenen Immunsystem wurden G als in-vitro- Analoga zu Pilzinfektionen verwendet, welche Mäuse im Sinne eines Trainings des angeborenen Immunsystems vor einer Candida albicans-Infektion zu schützen. In solchen in-vitro-Versuchen führte die Konditionierung mit G zu einer erhöhten Reaktivität gegenüber den TLR-Agonisten LPS und Pam3CSK4 sowie gegenüber den Mikroorganismen Candida albicans und Mycobakterium tuberculosis (QUINTIN et al. 2012). Dieser Effekt von G wurde für Plastik-adhärente und CD14-positive Monozyten nachgewiesen und konnte durch Blocken von Dektin-1 vollständig und durch Blocken der Komplementrezeptors 3 partiell aufgehoben werden (QUINTIN et al.
2012 ). Von Ifrim et al. wurde 1 µg G bereits als Positivkontrolle für ein Training des angeborenen Immunsystems in humanen Plastik-adhärenten Monozyten eingesetzt (IFRIM et al.
2014). Im Weiteren wurde die Kinetik der G-Konditionierung mit dem Ergebnis untersucht, dass ein Effekt des Gedächtnisses des angeborenen Immunsystems dann am deutlichsten war, wenn die Konditionierung mit G vierundzwanzig Stunden und die Ruhezeit bis zur Stimulation mit LPS oder Pam3CSK4 sechs Tage andauerte (S. BEKKERING et al. 2016).
Lipopolysaccharid
Das Lipopolysaccharid ist ein Bestandteil der Zellwand gramnegativer Bakterien, der meist zu pathologischen Reaktionen des Organismus führt (GLAUSER et al. 1991). LPS ist zwar ein hoch-konserviertes Molekül innerhalb gramnegativer Bakterien, unterscheidet sich aber in seiner Wirkung dennoch zwischen den Gattungen. So ist das LPS der Art Escherichia coli (E. coli) einer der potentesten Agonisten des humanen angeborenen Immunsystems, während das LPS von Helicobacter pylori als antagonistisch gilt, da es pro-inflammatorische Reaktionen hemmt (STEIMLE et al. 2016). LPS wird durch einen Komplex aus MD-2, Toll-like Rezeptor 4 und CD14 erkannt, jedoch nicht wie zunächst berichtet durch TLR 2 (WRIGHT et al. 1990; YANG et al. 1998; TAKEUCHI et al. 1999; HIRSCHFELD et al. 2000; SCHROMM et al. 2001). Dabei ist MD-2 ein kleines, extrazelluläres Protein, welches sich an TLR 4 anlagert und deswegen nicht von der LPS-responsiven Zelle selbst exprimiert werden muss (SCHROMM et al. 2001). CD14 wird vornehmlich von Monozyten und Makrophagen exprimiert, kann aber auch auf Granulozyten, B-Zellen und mammären Zellen gefunden werden (H. W. L. ZIEGLER-
HEITBROCK u. ULEVITCH 1993). TLR 4 wird auf einem breiten Spektrum von Zellen exprimiert, darunter Monozyten, Makrophagen, dendritischen Zellen und Endothelzellen, wobei spezies-spezifische Unterschiede existieren (VAURE u. LIU 2014). Inzwischen ist ersichtlich, dass zuerst die Rekrutierung von vier Toll/Interleukin-Rezeptor-Domänen-enthaltenden Adaptermolekülen erfolgt, welche dann den Signalweg über NFB oder jenen über den Interferon-regulatorischen Faktor IRF3 aktivieren (FITZGERALD et al. 2004).
Schon 1946 wurde berichtet, dass bei mehrmaligen Gaben von abgetöteten Typhus-Bakterien nach der vierten Injektion kein Fieber mehr ausgelöst wurde (BEESON 1946). Das heute als Endotoxin-Toleranz bezeichnete Phänomen wird in den letzten Jahrzehnten vor allem im Kontext erhöhter Mortalität nach überstandener Sepsis betrachtet (BOMANS et al. 2018). Erst mit Postulierung der Gedächtnisfunktion des angeborenen Immunsystems wurden auch andere, nicht-gramnegative Pathogene und Pathogenbestandteile auf ihre Fähigkeit hin geprüft, eine Toleranz zu induzieren, die Pathogenklassen-übergreifend ist. So beschränkt sich die durch LPS- Konditionierung entstandene Toleranz des angeborenen Immunsystems nicht auf Stimulation mit LPS, sondern ist auch bei Stimulation mit Pam3CSK4 nachzuweisen. Außerdem wurde festgestellt, dass eine hohe Dosis sowohl des TLR 3-Agonisten Poly I:C als auch des TLR 1/TLR 2-Agonisten Pam3CSK4 zu einer Toleranz von Plastik-adhärenten Monozyten gegenüber LPS und Pam3CSK4 führt (IFRIM et al. 2014).
2.4.2 WIRTSEIGENE FAKTOREN ALS GEDÄCHTNIS-INDUKTION
Zellen kommunizieren untereinander über Botenstoffe, welche je nach Funktion als Zytokine oder Chemokine bezeichnet werden. Auf diese Art tauschen sie auch Informationen über Infektionen aus und aktivieren weitere Zellen des Immunsystems. Insofern ist es naheliegend, dass auch manche dieser wirtseigenen Faktoren die Bildung eines Gedächtnisses des angeborenen Immunsystems fördern oder induzieren.
GM-CSF
Der Granulozyten-Makrophagen Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF) zählt zur Familie der Kolonie-stimulierenden Faktoren und wirkt über einen hoch-affinen GM-CSF-Rezeptor, der verschiedene Kinase-Gruppen aktiviert (KITAMURA et al. 1991; DE GROOT et al. 1998).
Dieser Rezeptor wird auf Vorläuferzellen exprimiert und forciert dort die Myelopoese, also die
Entwicklung von Monozyten, Makrophagen und anderen Leukozyten (LOPEZ et al. 1992;
BECHER et al. 2016). Außerdem wird der GM-CSF-Rezeptor auch auf dendritischen Zellen, Monozyten wie Makrophagen, neutrophilen, basophilen und eosinophilen Granulozyten exprimiert. Dort modifiziert GM-CSF Effektorfunktionen wie zum Beispiel die Migration (DE GROOT et al. 1998). Klinisch wurde GM-CSF unter anderem in synovialer Flüssigkeit von Patienten mit rheumatoider Arthritis nachgewiesen, und der Einsatz von anti-GM-CSF- Antikörpern zeigte im Maus-Modell therapeutisches Potential gegen chronisch-obstruktive Lungenerkrankungen (VLAHOS et al. 2006).
Auch ein Gedächtnis des angeborenen Immunsystems kann durch GM-CSF initiiert werden. So zeigten Borrelio et al. in einem Kurzzeitmodell, dass GM-CSF-konditionierte humane CD14+-Monozyten auf Stimulation mit LPS oder Pam3CSK verstärkt reagieren. In einem Langzeitmodell der gleichen Arbeitsgruppe reagierten GM-CSF-konditionierte Monozyten auf Stimulation stärker als M-CSF- oder LPS-konditionierte Monozyten (BORRIELLO et al. 2017).
Im Gegensatz zu dieser direkten Induktion von Gedächtnis trägt GM-CSF auch zu der Induktion von Gedächtnis des angeborenen Immunsystems durch G bei, indem es die Dectin-1- Expression erhöht. Hier zeigt sich ein reziprokes Verhältnis zwischen G und GM-CSF, da Konditionierung mit G zu einer erhöhten Expression von GM-CSF führt (S.
WALACHOWSKI et al. 2017).
IFN-
Interferon gamma (IFN-) zählt zu der Zytokin-Familie der Interferone, benannt nach der Eigenschaft, mit der Replikation von Viren zu interferieren. Interferone werden in Typ I- und Typ II-Interferone eingeteilt, wobei IFN- als einziges der Typ II-Interferon-Gruppe zugeordnet wird (BOEHM et al. 1997). IFN- kann von T- und B-Lymphozyten, NK-Zellen, Monozyten, Makrophagen sowie dendritischen Zellen sezerniert werden (GUNJAN et al. 2018). Für Makrophagen ist dabei bekannt, dass LPS, IL-12 und eine In-vitro-Infektion mit Mycobakterium tuberculosis eine IFN--Sekretion initiieren können (GESSANI u. BELARDELLI 1998). IFN-
wirkt über den IFN--Rezeptor (IFNGR), welcher aus je zwei IFNGR1- und IFNGR2-Ketten zusammengesetzt ist. Die Expression von IFNGR2 wird dabei von IFN- im Sinne eines negativen Feedbacks reguliert, während Agonisten an TLR 2 zu einer verminderten Expression
beider IFNGR-Ketten führen (CURRY et al. 2004). Bindung an den IFNGR führt zu einer Signaltransduktion über den JAK-STAT-Signalweg und mündet in der verstärkten Transkription IFN-regulierter Gene. Die Anzahl IFN-regulierter Gene ist enorm groß und kann hier nicht ansatzweise vollständig wiedergegeben werden. Unter diesen Genen finden sich verschiedene immunologisch bedeutende Gruppen wie Zytokine und ihre Rezeptoren, zum Beispiel TNFR1 und 2, Antigen-präsentierende Moleküle wie MHC-II und das Enzym Caspase-1 (BOEHM et al.
1997; STEPHANOU u. LATCHMAN 2003).
IFN- wird im Zuge des Gedächtnisses des angeborenen Immunsystems vor allem als Zytokin von B- und T-Lymphozyten erforscht. So stellten Yao et al. fest, dass sich Gedächtnis- Alveolarmakrophagen bei Mäusen, assoziiert mit erhöhter Überlebensrate nach bakterieller Infektion, nur in Anwesenheit von IFN--produzierenden CD8-T-Lymphozyten ausbilden.
Allerdings fanden sie auch heraus, dass die Quelle des IFN- nicht entscheidend ist, da bei IFN--defizienten Mäusen die Gabe von rekombinanten IFN- die Bildung von Gedächtnis- Alveolarmakrophagen ermöglichte (YAO et al. 2018). In Bezug auf die Toleranz des angeborenen Immunsystems konnte in vitro gezeigt werden, dass die Reaktion LPS- konditionierter mononukleärer Zellen auf Stimulation stärker, also weniger tolerant, war, wenn ihnen IFN- zugegeben wurde. Gleichzeitig konnte in vivo gezeigt werden, dass die geringe MHC-II-Expression von Monozyten septischer Patienten durch IFN--Gabe gesteigert werden konnte (DÖCKE et al. 1997). Ohne auf die Modifikation des Sekretoms vorgreifen zu wollen, soll hier schon erwähnt werden, dass IFN- auch gemessen wird, um ein Gedächtnis des angeborenen Immunsystems nachzuweisen. Bei Konditionierung von NK-Zellen mit den Zytokinen IL-12 und IL-15 produzieren diese auf Stimulation mit denselben Zytokinen vermehrt IFN- (COOPER et al. 2009). Dagegen konnte bei Konditionierung per BCG-Vakzine keine vermehrte IFN--Sekretion durch NK-Zellen in Reaktion auf heterologe Stimuli nachgewiesen werden (KLEINNIJENHUIS et al. 2014).
2.4.3 GEDÄCHTNIS-FÄHIGE ANGEBORENE IMMUNZELLEN
Unter den vielen Zellen des angeborenen Immunsystems wurden einige bislang auf die Fähigkeit hin geprüft, ein Gedächtnis auszubilden. Im Folgenden werden nur die ausführlich untersuchten oder für diese Arbeit relevanten Zellpopulationen vorgestellt.
Dendritische Zellen
Dendritische Zellen (DC) bilden die Schnittstelle zwischen der Peripherie und den zentralen Immunorganen, indem sie als gewebeständige Zellen ihre Umgebung auf Pathogene hin kontrollieren und bei Kontakt mit einem solchen aktiv in Organe des Immunsystems migrieren.
Dort besteht ihre wesentliche Aufgabe darin, T-Lymphozyten über MHC-Komplexe Antigene zu präsentieren (SHORTMAN u. NAIK 2007). T-Lymphozyten werden in ihrer weiteren Differenzierung sowohl von der Art der präsentierenden DC als auch von deren sezernierten Zytokinen beeinflusst (WALSH u. MILLS 2013). Dendritische Zellen gehen üblicherweise aus einer gemeinsamen Vorläuferzelle für Monozyten und dendritische Zellen hervor, welche im Knochenmark zu finden ist (KANG LIU et al. 2009). Neben diesem klassischen Weg haben spezielle dendritische Zellen wie die Langerhans-Zellen der Haut einen eigenen Vorläufer embryologischen Ursprungs und sind in der Lage, sich aus sich selbst heraus zu erneuern (CHORRO et al. 2009). Ein weiterer, aber seltener Ursprung von dendritischen Zellen sind lymphoide Vorläuferzellen des Knochenmarks (MANZ et al. 2001). In vitro wie in vivo entstehen dendritische Zellen außerdem aus Monozyten (ZHOU u. TEDDER 1996;
RANDOLPH et al. 1999) reviewed in: (GEISSMANN et al. 2010).
Im Rahmen der Gedächtnisinduktion, die unabhängig von B- und T-Lymphozyten stattfindet, fielen dendritische Zellen in einem murinen Experiment auf, bei dem eine Gabe von Flagellin gegen eine konsekutive Rotavirus-Infektion schützte und bestehende chronische Infektionen heilte. Diese Wirkung konnte in DC-depletierten Mäusen nicht nachgewiesen werden. Eine temporäre Minderung der Virusausscheidung wurde auch nach einer Gabe von LPS beobachtet (ZHANG et al. 2014). Dendritische Zellen waren außerdem entscheidend für den Schutz gegen Entamoeba histolytica, der durch eine Gabe von segmented filamentous bacteria initiiert wurde. Letzteres stellt hier die Konditionierung dar, welche einen Schutz gegenüber einer Stimulation mit Entamoeba histolytica vermittelt. Dieser Schutz konnte durch die alleinige Transplantation von dendritischen Zellen segmented filamentous bacteria-kolonisierter Mäuse vermittelt werden, welche auf eine Stimulation mit Trophozoiten verstärkt reagierten (BURGESS et al. 2014).
Monozyten und Makrophagen
Monozyten sind im Blut zirkulierende Leukozyten, welche aus Knochenmarkszellen hervorgehen. Nach Migration in das Gewebe verbleiben sie entweder unverändert als
Monozyten, die lediglich eine erhöhte Expression mancher Gene aufweisen, oder sie differenzieren in dendritische Zellen oder Makrophagen aus (AUFFRAY et al. 2009;
JAKUBZICK et al. 2013). So dienen Monozyten nicht nur als Vorläuferzellen dieser spezialisierten Effektorzellen, sondern erfüllen auch selbst Aufgaben, um Pathogene abzuwehren.
Dazu gehören die Phagozytose von Pathogenen und Zelltrümmern sowie die Sekretion von Zytokinen und antimikrobiellen Peptiden (SERBINA et al. 2008; CARLIN et al. 2013). Zudem können Monozyten auch Antigene präsentieren, wobei dies aufgrund einer geringeren MHC-Expression weniger effizient erfolgt als durch dendritische Zellen (BANCHEREAU u.
STEINMAN 1998). Bei Menschen und Rindern lassen sich Monozyten phänotypisch in drei Gruppen unterscheiden, welche auch funktionell heterogen sind. Die Einteilung erfolgt anhand der Expression des LPS-Rezeptors CD14 und des FcIII-Rezeptors CD16. Klassische Monozyten exprimieren lediglich CD14, wogegen intermediäre Monozyten sowohl CD14 als auch CD16 exprimieren. Nicht klassische Monozyten exprimieren CD16, wobei bezüglich der Expressionsstärke von CD14 auf humanen Monozyten Uneinigkeit herrscht. Humane nicht- klassische Monozyten werden je nach Veröffentlichung als CD14–, CD14dim oder CD14+ deklariert. Da bei Selektion CD14-positiver Zellen 10% der gewonnenen humanen Monozyten den nicht-klassischen Monozyten zugeordnet werden, scheint eine relevante Menge CD14 von dieser Gruppe exprimiert zu werden. Bovine nicht-klassische Monozyten exprimieren CD16 und geringe Mengen CD14 (PASSLICK et al. 1989; LOEMS ZIEGLER-HEITBROCK et al. 2010;
HUSSEN u. SCHUBERTH 2017; MARLENE C. NIELSEN et al. 2020).
Monozyten oder embryonale Stammzellen können zu Makrophagen differenzieren.
Makrophagen besitzen eine hohe funktionelle und phänotypische Diversität und Plastizität und sind schwer in klar unterscheidbare Gruppen zu trennen. Mosser et al. beschrieben drei Gruppen von Makrophagen, namentlich klassisch-aktivierte, Wund-heilende und regulatorische Makrophagen, die unten weiter besprochen werden (MOSSER u. EDWARDS 2008). In vitro lassen sich murine Monozyten mittels M-CSF in Makrophagen differenzieren, während für humane Monozyten verschiedene Differenzierungsprotokolle angewandt werden. Nach Saeed et al. differenzieren humane Monozyten ebenfalls unter Einfluss von M-CSF in Makrophagen, während Akagawa et al. beobachteten, dass unter dem Einfluss von M-CSF differenzierte Makrophagen vermehrt IL-10 produzieren, was einer Differenzierung zu regulatorischen
Makrophagen entspricht (AKAGAWA et al. 2006; MOSSER u. EDWARDS 2008; WYNN et al.
2013; SAEED et al. 2014).
Um den Effekt eines Gedächtnisses des angeborenen Immunsystems auf bestimmte Zellpopulationen zurückzuführen, arbeiteten Quintin et al. mit verschiedenen Immunzell- defizienten Mausstämmen. So konnten sie nachweisen, dass das erzielte Gedächtnis unabhängig von T- und B-Lymphozyten entsteht, bei Monozyten-defizienten Mäusen jedoch nicht nachgewiesen werden kann. (QUINTIN et al. 2012) In darauffolgenden Arbeiten wurden Monozyten auf unterschiedliche Weise isoliert, die sich aufgrund der Zugabe von humanem Serum, welches M-CSF enthält, in Makrophagen differenzierten (SAEED et al. 2014). Bei Versuchen mit Plastik-adhärenten Monozyten unterschieden sich tolerante oder trainierte Makrophagen in ihrer Morphologie und ihrem Phänotyp. Trainierte Makrophagen sind von höherer Komplexität und Größe und exprimieren vor allem CD14 und CD11b, ein Migrations- assoziiertes Oberflächenmolekül. Tolerante Makrophagen weisen bei geringerer Größe eine verminderte Expression von CD68, CD11b und DC-SIGN, einem C-Typ-Lektin-Rezeptor, auf (IFRIM et al. 2014). Für CD3–CD19–CD56–-Monozyten, die zu 88 % CD14 exprimierten, konnte nach Konditionierung mit Zellwandbestandteilen von Pilzen und Differenzierung mittels M-CSF eine erhöhte Reaktion auf Stimulation mit grampositiven wie gramnegativen Bakterien gezeigt werden (CHENG et al. 2014). Auf Konditionierung mit LPS reagierten gleichartig isolierte und kultivierte Monozyten mit Immuntoleranz (SAEED et al. 2014). Plastik-adhärente Monozyten exprimierten nach Konditionierung mit LPS weniger MHC-II-Komplexe, welche der Präsentation von Antigenen gegenüber T- und B-Lymphozyten dienen, wobei den Zellen in diesem Fall kein M-CSF zur Differenzierung in Makrophagen zugegeben wurde und es sich daher um Induktion von Toleranz in Monozyten handelt (DEL FRESNO et al. 2009). Das Phänomen der MHC-Regulation kann man auch bei Sepsis-Patienten beobachten, bei denen die Expression von HLA-DR, dem humanen Äquivalent zu MHC-II, reduziert ist (DÖCKE et al.
1997). In einem anderen Ansatz wurden Mäuse mit einem Adenovirus konditioniert und zeigten eine erhöhte Resistenz gegen Stimulation im Sinne einer Infektion mit grampositiven oder gramnegativen Erregern. Alveolarmakrophagen dieser konditionierten Mäuse zeigten dabei eine erhöhte Expression des MHC-II-Komplexes (YAO et al. 2018).
In manchen Gedächtnis-Ansätzen wurden Monozyten als CD14-positive Zellen isoliert, eine differenzierte Betrachtung von Gedächtnisinduktion in den verschiedenen Monozyten- Subpopulationen erfolgte jedoch nicht.
Natürliche Killerzellen
Natürliche Killerzellen (NK-Zellen) residieren in verschiedenen Geweben wie der Milz oder dem Uterus, können aber auch im Blut zirkulieren (MORETTA et al. 2014). Sie sind an der Kontrolle von viralen Infektionen beteiligt, indem sie zytotoxisch gegen infizierte Zellen wirken und Zytokine, vornehmlich IFN-, sezernieren (BIRON et al. 1999). Außerdem kommt ihnen eine relevante Aufgabe in der Bekämpfung neoplastischer Zellen zu, da sie Rezeptoren für Oberflächenmoleküle besitzen, die auf Tumorzellen verstärkt exprimiert werden und auf Bindung mit Zytotoxizität reagieren (GUERRA et al. 2008). In Anbetracht der Tatsache, dass NK-Zell-Dysfunktionen mit autoimmunen Erkrankungen wie juveniler rheumatoider Arthritis assoziiert sind, fällt diesen Zellen auch eine Rolle in der Aufrechterhaltung der Immun- Homöostase zu (VILLANUEVA et al. 2004). NK-Zellen deszendieren von einer gemeinsamen lymphoiden Vorläuferzelle und können nicht nur im Knochenmark, sondern auch in anderen Geweben ausdifferenzieren (MORETTA et al. 2014).
Im Kontext der Gedächtnisinduktion des angeborenen Immunsystems wurden NK-Zellen zunächst vernachlässigt. Quintin et al. beschrieben, dass NK-Zell-depletierte Mäuse nicht nur weiterhin in der Lage waren, ein solches Gedächtnis auszubilden, die Überlebensrate dieser Mäuse nach letaler Infektion war sogar höher als jene von NK-Zell-kompetenten Mäusen (QUINTIN et al. 2012). Dem entgegen standen Beobachtungen, die eine Gedächtnisfunktion von NK-Zellen nahelegen, so zum Beispiel eine über Wochen anhaltende Hypersensitivität gegenüber Hapten, welche durch NK-Zell-Transplantation sensibilisierter Mäuse übertragen werden kann (O'LEARY et al. 2006). Auch eine Konditionierung durch Zytokine war bei NK-Zellen bekannt, die zu einer erhöhten Reaktivität auf Aktivierung durch Rezeptor-Liganden oder Zytokine führt, während die Zellen phänotypisch nicht von unkonditionierten NK-Zellen zu unterscheiden sind (COOPER et al. 2009). Gezielt auf den Nachweis einer Gedächtnis- Fähigkeit der NK-Zellen ausgerichtet war ein Versuch, in dem eine Konditionierung durch die Gabe der BCG-Vakzine zu einer erhöhten Reaktion auf Stimulation mit diversen Pathogengruppen führte und bei dem die verbesserte Überlebensrate nach letaler Candida albicans-
Infektion zum Teil auf NK-Zellen zurückgeführt werden konnte (KLEINNIJENHUIS et al.
2014).
-T-Zellen
T-Lymphozyten sind Immunzellen, welche einen durch Gen-Umgruppierung hochspezialisierten T-Zell-Rezeptor besitzen. Funktionell sind sie an vielen Immunreaktionen sowie an der spezifischen Form des Gedächtnisses beteiligt (KUMAR et al. 2018). Allerdings gilt dies nur für T-Lymphozyten, deren T-Zell-Rezeptor aus einer alpha- und einer beta-Kette zusammengesetzt ist. Der T-Zell-Rezeptor von T-Lymphozyten setzt sich dagegen aus einer gamma- und einer delta-Kette zusammen. Dieser Rezeptor erkennt neben Antigenen, welche nicht durch MHC- Moleküle präsentiert werden müssen, auch DAMPs (HOLDERNESS et al. 2013). Des Weiteren exprimieren T-Lymphozyten eine Anzahl von PRRs und befinden sich durch die Möglichkeit, PAMPs und spezifische Antigen zu erkennen, an der Schnittstelle von angeborenem und adaptiven Immunsystem (BALDWIN u. TELFER 2015). Die Gruppe der T-Lymphozyten wurde im bovinen System erstmalig anhand der Expression des scavenger receptors WC1 in zwei Gruppen unterteilt (MACHUGH et al. 1997). Funktionell sind T-Lymphozyten sehr vielfältig. Sie können professionell Antigene präsentieren, zytolytisch wirken, Zytokine und Chemokine sezernieren und dadurch Migration induzieren (HOLDERNESS et al. 2013).
Während die Bindung von MAMPs zu keiner deutlichen Zytokin-Sekretion führt, können alle diese Reaktionen durch die Bindung von spezifischem Antigen ausgelöst werden (HEDGES et al. 2005).
Zu den vielfältigen Funktionen von T-Lymphozyten gehört auch die Ausbildung von Gedächtnis. Im Sinne eines Gedächtnisses des adaptiven Immunsystems reagieren diese Zellen auf eine zweite Stimulation mit demselben Antigen, indem sie proliferieren und vermehrt Zytokine sezernieren. Dies wurde im Menschen bei der Impfung mit der BCG-Vakzine oder mit Canarypox-Viren nachgewiesen (HOFT et al. 1998; WORKU et al. 2001). Auch PAMPs können
T-Lymphozyten zu einer später verstärkten Reaktion auf Zytokine wie IL-2 und IL-15 veranlassen. Jedoch wurde bislang nicht überprüft, ob auch eine veränderte Reaktion auf heterologe PAMPs und DAMPs erfolgt (JUTILA et al. 2008).
2.5 M ECHANISMEN DES G EDÄCHTNISSES DES ANGEBORENEN I MMUNSYSTEMS
Das Gedächtnis des angeborenen Immunsystems wurde zuerst anhand erhöhter Überlebensraten nach potentiell tödlichen Infektionen erkannt. Inzwischen sind jedoch auch zahlreiche Erkenntnisse zu Veränderungen auf zellulärer Ebene erforscht, die im Folgenden vorgestellt werden.
2.5.1 EPIGENETISCHE MODIFIKATIONEN
Epigenetik umfasst die Methylierung von DNA, die Modifizierung von Histonen sowie den Umbau von Nukleosomen und reguliert eine Vielzahl biologischer Prozesse (DAWSON u.
KOUZARIDES 2012). Auch das Gedächtnis des angeborenen Immunsystems beruht auf epigenetischen Veränderungen, von denen vor allem die Histonmodifizierungen untersucht wurden. Eine gut untersuchte Histonmodifizierung ist die dreifache Methylierung des vierten Lysins im Histon 3 (H3K4me3), welche mit aktiver Transkription in Verbindung gesetzt wird (SCHNEIDER et al. 2004). Solche Histon-Methylierungen in humanen Monozyten konnte an den Promotoren für TNF- und IL-6 nachgewiesen werden, nachdem drei Monate zuvor eine BCG-Vakzinierung durchgeführt wurde (KLEINNIJENHUIS et al. 2012). Die Gedächtnisinduktion im angeborenen Immunsystem über Histon-Methylierungen konnte auf Methyltransferasen zurückgeführt werden, da eine Hemmung der Methyltransferase eine Induktion von Training des angeborenen Immunsystems durch die BCG-Vakzine verhinderte (KLEINNIJENHUIS et al. 2012). Auch wenn Histon-Modifizierungen bis zu drei Monate nach dieser Impfung nachgewiesen werden, stellen sie keine irreversiblen Veränderungen dar.
Novakovic et al. zeigten 2016, dass LPS-induzierte epigenetische Veränderungen durch Exposition gegenüber Glucan wieder aufgehoben werden können (NOVAKOVIC et al.
2016). Bei Konditionierung mit oxidierten Lipoproteinen geringer Dichte konnte eine solche Trimethylierung an H3K4 (H3K4me3) auch an Promotorregionen von IL-18, Matrix- Metalloproteinasen und scavenger-Rezeptoren gefunden werden. Diese Ergebnisse stellten Gedächtnis-Induktion im angeborenen Immunsystem durch Konditionierung mit Lipoproteinen in einen Kontext mit der Genese der Atherosklerose (SIROON BEKKERING et al. 2014). In einer breiter angelegten Untersuchung wurden mehrere epigenetische Marker untersucht. Neben dem bereits beschriebenen H3K4me3, das für einen Promotor steht, befasste sich diese Arbeit
auch mit einfach-metyhliertem H3K4 (H3K4me1) als Surrogat eines Enhancers (distalen regulatorischen Elements) und acetyliertem Lysin 27 des Histons 3 (H3K27ac), welches aktive Promotoren und Enhancer markiert. Die zahlreichsten Veränderungen dieser Marker wurden bei
G-konditionierten Zellen gefunden (SAEED et al. 2014). Bemerkenswert ist, dass es sich bei diesen Veränderungen auch um eine verminderte Anzahl dieser Marker handeln kann. Bei der Induktion von Gedächtnis des angeborenen Immunsystems werden vor allem aktivierende Marker reguliert, da hemmende Marker wie beispielsweise eine Trimethylierung an H3K27 im Rahmen der Konditionierung keinen Veränderungen unterliegen (SAEED et al. 2014;
NOVAKOVIC et al. 2016). Außerdem ist unerwartet, dass manche Modifikationen bei G- wie LPS-konditionierten Zellen gleichermaßen auftreten, wenngleich erstere verstärkt und letztere vermindert auf einen Stimulus reagieren. Diese unterschiedlichen Effekte lassen sich aus den gleichzeitig existierenden Unterschieden ableiten, so ist bei LPS-konditionierten Zellen die negative Rückkopplung von TLR-mediierten Signalen stärker ausgeprägt (SAEED et al. 2014).
2.5.2 METABOLISCHE MODIFIKATIONEN
Die Funktionen von Zellen des Immunsystems wie beispielsweise die Phagozytose sind eng mit dem Metabolismus dieser Zellen verbunden und dieser Zusammenhang ist seit Langem bekannt (SBARRA u. SHIRLEY 1963). Der metabolische Zustand lässt Rückschlüsse auf die unterschiedlichen Aktivitätszustände von Zellen zu. So beziehen ruhende T-Zellen, also naive oder Gedächtnis-T-Zellen, ihre Energie hauptsächlich aus dem Zitronensäure-Zyklus und können so Energie aus Amino- und Fettsäuren generieren. Proliferierende T-Zellen dagegen benötigen Amino- und Fettsäuren für ihren anabolen Stoffwechsel und beziehen ihre Energie aus der Glykolyse, deren Produkt Pyruvat in Laktat hydrogeniert wird. (FOX et al. 2005) Wenn Pyruvat nicht im Zitronensäurezyklus metabolisiert wird, obwohl aerobe Bedingungen vorliegen, spricht man vom Warburg-Effekt, der zuerst bei Tumorzellen beschrieben wurde, der aber auch bei myeloiden Zellen und neutrophilen Granulozyten bekannt ist. (WARBURG et al. 1927; FOX et al. 2005; STIENSTRA et al. 2017)
Auch im Zusammenhang mit der Induktion von Gedächtnis des angeborenen Immunsystems wird der Warburg-Effekt nachgewiesen. In diesem Sinne werden bei -Glucan-trainierten Zellen ein erhöhter Glukose-Verbrauch sowie eine erhöhte Laktat-Produktion gemessen, außerdem ist ein erhöhtes NAD+/NADH-Verhältnis zu beobachten. Bei einem erhöhten NAD+/NADH-
Verhältnis liegt vermehrt NAD+ vor, welches als Co-Enzym der Deacetylase Sirtuin 1 dient.
Diese wird als Schalter beschrieben, welcher den Metabolismus von Glykolyse zu vermehrter Fettsäureoxidation umstellen kann. Des Weiteren deaktiviert Sirtuin 1 NFB p65 und hemmt durch Verdichten pro-inflammatorischer Gene deren Transkription, in diesem Sinne wird Sirtuin 1 im Kontext der Toleranz des angeborenen Immunsystems besprochen (TIE FU LIU et al. 2012). Nach Induktion von Training des angeborenen Immunsystems durch Konditionierung mit -Glucan werden proinflammatorische Gene dagegen weiter exprimiert, da in diesem Fall die Expression von Sirtuin 1 gehemmt wird (CHENG et al. 2014). Grundlage dieser metabolischen Effekte sind epigenetische Veränderungen von Genen, welche den Regulator mTOR (target of rapamycin), Transkriptionsfaktor HIF1 sowie Enzyme der Glykolyse kodieren. Für die notwendigen Acetylierungen wird Acetyl-CoA aus Zitrat bereitgestellt (WELLEN et al. 2009).
mTOR induziert die Glykolyse über den Transkriptionsfaktor HIF1 und sowohl die Blockade von mTOR als auch jene von HIF1 oder die Hemmung der Glykolyse durch Metformin führen dazu, dass G kein Gedächtnis des angeborenen Immunsystems induziert (MAJUMDER et al.
2004; CHENG et al. 2014). HIF-1 führt nicht nur zu einer vermehrten Transkription glykolytischer Enzyme, sondern hemmt daneben auch die Pyruvat-Dehydrogenase und damit diese Supplementierung des Zitratzyklus (KIM et al. 2006). Allerdings beeinflussen nicht nur epigenetische Modifikationen den Metabolismus. Andersherum reguliert der metabolische Status auch die Histon-Modifikationen. So wirkt Laktat als Inhibitor von Histondeacetylasen.
(LATHAM et al. 2012). Histon- und DNA-Demethylasen werden durch Succinat und Fumarat gehemmt, zwei Metaboliten, welche ebenfalls vermehrt in G-konditionierten Zellen nachgewiesen werden (XIAO et al. 2012; ROB J. W. ARTS et al. 2018).
2.5.3 SEKRETORISCHE MODIFIKATIONEN
Mit dem Begriff Sekretom wird die Gesamtheit sezernierter Proteine von Bakterien wie auch von verschiedenen eukaryotischen Zellen bezeichnet (TJALSMA et al. 2000; ALI KHAN et al. 2018).
Busatto et al. schlugen kürzlich vor, den Begriff auf sämtliche sezernierten Nanopartikel einer Zelle auszuweiten (BUSATTO et al. 2020). Im Rahmen des Gedächtnisses des angeborenen Immunsystems liegt ein Fokus auf den Zytokinen Interleukin-1 beta (IL-1) und Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-) (IFRIM et al. 2014).
IL-1
IL-1 gehört zur IL1-Familie, welche sieben pro- und ein antiinflammatorisches Zytokin umfasst (GARLANDA et al. 2013). Die Sekretion von IL-1 erfolgt durch Monozyten, Makrophagen und dendritische Zellen (MOORLAG et al. 2018). Wenn Zytokine, Gefahr- oder Mikroorganismen-assoziierte molekulare Muster diese Zellen stimulieren, wird zuerst die inaktive Form pro-IL-1 transkribiert. Pro-IL-1 kann dann durch das NLRP3-Inflammasom, in humanen Monozyten konstitutiv exprimierte Caspase-1, durch extrazellulär lokalisierte Elastase oder die Proteinase 3 gespalten und damit aktiviert werden (M. G. NETEA et al. 2009;
GARLANDA et al. 2013). Die Wirkung von IL-1 entfaltet sich nach Bindung an den IL1-Rezeptor 1, der über eine konservierte Toll/IL-1 Rezeptor Domäne wirkt und in der Aktivierung von MyD88 und NFB sowie konsekutiver Gen-Transkription mündet (DINARELLO 2009). Dies betrifft Gene für Wachstumsfaktoren wie M- und GM-CSF, Zytokine wie TNF-, IL-1 und IL-6 und viele weitere mehr (BAEUERLE u. HENKEL 1994).
Eine veränderte Sekretion von IL-1 wird mit der Induktion von Gedächtnis des angeborenen Immunsystems in Zusammenhang gebracht. Bei der Standard-Induktion des Trainings des angeborenen Immunsystems durch Vakzinierung mit BCG können erhöhte Mengen von sezerniertem IL-1 nach Stimulation mit M. tuberculosis, S. aureus, C. albicans und LPS nachgewiesen werden (KLEINNIJENHUIS et al. 2012; ROB J. W. ARTS et al. 2018). In einem weniger klassischen Versuch wurde als Stimulation eine Gelbfieber-Vakzine verabreicht, die eine milde virale Infektion darstellen soll. BCG-geimpfte Probanden zeigten hierauf eine verringerte Virämie, welche mit der LPS-induzierten Sekretion von IL-1 korrelierte (ROB J. W. ARTS et al.
2018).
TNF-
Der Tumornekrosefaktor-alpha wird in einer Vielzahl von Zellen, darunter Makrophagen, Granulozyten, NK- und Epithelzellen, in Reaktion auf MAMPs oder Zytokine exprimiert (SPRIGGS et al. 1992; AGGARWAL 2003). Dabei liegt TNF- zuerst in einer Membran- gebundenen Form vor, welche durch das TNF--converting enzyme von der Membran abgespalten werden kann (BLACK et al. 1997). An Zielzellen wirkt TNF- über Bindung an den TNF-
Rezeptor 1 oder 2. Während der TNF-Rezeptor 1 (TNFR1) von allen kernhaltigen Zellen exprimiert wird, beschränkt sich TNF-Rezeptor 2 (TNFR2) auf Immun- und Endothelzellen.
Zudem unterscheiden sich die beiden Rezeptoren dahingehend, dass TNFR1 vor allem lösliches und TNFR2 nur membrangebundenes TNF- bindet (GRELL et al. 1995). Beide Rezeptoren vermitteln ihre Wirkungen über den TNFR-assoziierten Faktor 2, wobei am Ende der Signalkette die Expression von AP1- und NFB-Zielgenen steht (AGGARWAL 2003). Die Wirkungen von TNF- sind vielfältig und zum Teil gegensätzlich. Entsprechend seines Namens vermittelt TNF- den Tod von Zellen, in Makrophagen allerdings nicht die Nekrose, sondern die Apoptose. Im Gegensatz dazu kann es bei Kombination mit M-CSF auch die Proliferation von Wachstums-kompetenten Makrophagen fördern (GUILBERT et al. 1993; TAKADA et al. 2007) Zudem kommt TNF- eine zentrale Rolle in der Regulation anderer pro-inflammatorischer Zytokine wie IL-1, -6 und -8 sowie von Wachstumsfaktoren wie GM-CSF zu (MAINI et al.
1995).
TNF- ist eines der am besten untersuchten Zytokine im Zusammenhang mit dem Gedächtnis des angeborenen Immunsystems. Im Sinne eines Trainings des angeborenen Immunsystems findet man erhöhte TNF--Konzentrationen nach Stimulation. Quintin et al. zeigten dies für eine Konditionierung mit Candida albicans oder G und Stimulation mit LPS, Pam3CSK4, Candida albicans oder Mycobacterium tuberculosis. Eine erhöhte TNF--Sekretion wurde in diesem Versuchsaufbau sowohl durch periphere mononukleäre Zellen des Blutes als auch durch CD14-positive Monozyten nachgewiesen und in Verbindung mit H3K4-Trimethylierungen an dem entsprechenden Gen sowie erhöhter mRNA-Expression gebracht (QUINTIN et al. 2012).
Weitere MAMPs wurden von Ifrim et al. auf ihre Fähigkeit, Gedächtnis in adhärenten Monozyten zu induzieren, getestet. Während Pam3CSK4, Poly I:C und R848 anhand ihrer TNF--senkenden Wirkung als Toleranz-induzierend eingestuft wurden, vermitteln Flagellin, TriDAP und Muramyldipeptid eine erhöhte TNF--Sekretion nach Stimulation und damit Training des angeborenen Immunsystems. Bemerkenswert ist, dass sich die Situation bei Betrachten der IL-6-Sekretion zum Teil anders darstellt. So induziert R848, anhand von IL-6 betrachtet, keine Toleranz des angeborenen Immunsystems. Eine hohe Konzentration von Flagellin führt bei Betrachten der TNF--Sekretion zu keinem Gedächtniseffekt des
angeborenen Immunsystems, anhand der IL-6-Sekretion allerdings zu Toleranz des angeborenen Immunsystems (IFRIM et al. 2014).
2.5.4 BEEINFLUSSUNG DER MONOZYTEN-MAKROPHAGEN-DIFFERENZIERUNG
Wie oben beschrieben, können Makrophagen aus Monozyten entstehen und bilden unterschiedliche funktionelle und phänotypische Gruppen, welche zudem ineinander übergehen können. Welche Funktionen die entstehenden Makrophagen erfüllen, ist abhängig von den Faktoren, die während der Differenzierung auf sie einwirken. Diese Faktoren sind zumeist löslich und werden von Zellen des angeborenen sowie von solchen des adaptiven Immunsystems gebildet (MOSSER u. EDWARDS 2008). Sogenannte klassisch-aktivierte Makrophagen entstehen, wenn Monozyten in der Gegenwart von IFN- und LPS ausdifferenzieren. Der Effekt von LPS liegt hier in der Sekretionsinduktion von TNF-, welches dann autokrin auf die sich differenzierenden Zellen einwirkt. Diese Gruppe der Makrophagen sezerniert eine große Menge pro-inflammatorischer Zytokine und wirkt stark mikrobizid (GORDON u. TAYLOR 2005;
MOSSER u. EDWARDS 2008). Wenn Monozyten in der Anwesenheit von IL-4 und IL-13 ausdifferenzieren, entstehen Wund-heilende Makrophagen, welche synonym als alternativ- aktivierte Makrophagen bezeichnet wurden (GORDON u. TAYLOR 2005; MOSSER u.
EDWARDS 2008). Funktionell sezernieren Wund-heilende Makrophagen deutlich weniger pro- inflammatorische Zytokine und mehr Arginase. Diese führt dazu, dass L-Arginin statt zur Radikal-Synthese der Polyamin- und Kollagensynthese zugeführt wird. Polyamine führen letztendlich zur Proliferation von Fibroblasten (GORDON 2003). Zu beachten ist, dass sowohl klassische als auch Wund-heilende Makrophagen vermehrt MHC-II-Moleküle exprimieren, jedoch nur letztere eine erhöhte Expression des Mannose-Rezeptors, auch als CD206 bezeichnet, zeigen (GORDON 2003). Die dritte Makrophagen-Gruppe sind die regulatorischen Makrophagen. Eine solche Zellpopulation entsteht unter dem Einfluss einer Vielzahl von Stimuli, darunter Glukokortikoide, Immunkomplexe und IL-10, sowie durch den Einfluss efferozytierender Makrophagen (GERBER u. MOSSER 2001; STERNBERG 2006; ERWIG u.
HENSON 2007; MARTINEZ et al. 2008). Regulatorische Makrophagen zeichnen sich durch hohe IL-10- sowie niedrige IL-12-Produktion aus. IL-10 hemmt dabei die Produktion und Aktivität pro-inflammatorischer Zytokine. Außerdem exprimieren regulatorische Makrophagen in verstärktem Ausmaß ko-stimulatorische Moleküle und dienen so der Antigen-Präsentation (EDWARDS et al. 2006; MOSSER u. EDWARDS 2008).
Im Zusammenhang mit der Induktion von Gedächtnis des angeborenen Immunsystems wurden auch Marker für verschiedene humane und murine Makrophagen-Gruppen betrachtet. Nach Konditionierung mit G zeigten Makrophagen eine erhöhte Transkription von TNF- und IL-6, was klassisch-aktivierten Makrophagen entspricht. Zeitgleich exprimierten diese Makrophagen wenig Arginase, dafür allerdings vermehrt andere Marker für Wund-heilende Makrophagen und zeigten keine deutliche IL-10-Sekretion (QUINTIN et al. 2012). In einer nachfolgenden Studie der Arbeitsgruppe zeigte sich im Gegensatz dazu eine erhöhte Sekretion von IL-10 in Reaktion auf LPS, wenn die Zellen zuvor mit G konditioniert wurden (SIROON BEKKERING et al.
2014). Arts et al. stellten neben den oben dargestellten Modifikationen des Glukose- Stoffwechsels auch Überlegungen über den Einfluss des Glutamin- und Aspartat-Stoffwechsels auf die Gedächtnisinduktion im angeborenen Immunsystem an, während Jha et al. den Metabolismus in einen Zusammenhang mit der Differenzierung von Makrophagen setzten (JHA et al. 2015; R. J. ARTS et al. 2016) Dementsprechend haben klassisch-aktivierte Makrophagen eine erhöhte glykolytische Aktivität, während Wund-heilende Makrophagen vor allem auf den Glutamin-Metabolismus angewiesen sind (JHA et al. 2015). In Bezug auf die Induktion von Gedächtnis des angeborenen Immunsystems lässt sich daraus keine eindeutige Zuordnung zu einer Gruppe an Makrophagen ableiten, da Makrophagen, in denen Gedächtnis induziert wurde, einen hohen Glukose-Verbrauch haben und das benötigte Acetyl-CoA für die Acetylierung von Histonen (2.5.1) aus der Verstoffwechselung von Glutamin stammen könnte (R. J. ARTS et al.
2016).
2.6 D AS G EDÄCHTNIS DES ANGEBORENEN I MMUNSYSTEMS BEI N UTZTIERSPEZIES
Die Forschung bezüglich des Gedächtnisses des angeborenen Immunsystems, deren Ergebnisse hier zusammenfassend dargelegt wurden, bezieht sich fast ausschließlich auf das murine und das humane System. Bezüglich der Toleranz des angeborenen Immunsystems ist vor allem die Endotoxin-Toleranz bei verschiedenen Haus- und Nutztierspezies beschrieben. So wurde eine Schweine-Gruppe über 24 Stunden mit LPS infundiert und direkt im Anschluss eine sechs- stündige Infusion mit einer erhöhten Dosis LPS verabreicht. Eine Vergleichsgruppe bekam nur die zweite LPS-Infusion. Solche Tiere, die auch die erste LPS-Infusion erhielten, zeigten auf die höher konzentrierte Infusion eine verminderte Reaktion im Sinne einer Endotoxin-Toleranz
(CASTEGREN et al. 2012). Allerdings ist bei diesem Versuchsaufbau keine Rückkehr zur Homöostase gegeben, da sich beide LPS-Expositionen direkt aneinander anschließen. Die Rückkehr zur Homöostase wird allerdings von Hamon et al. als „Conditio sine qua non“ für die Bezeichnung als Gedächtnis des angeborenen Immunsystems angegeben (HAMON u.
QUINTIN 2016). Im bovinen System wurde Endotoxin-Toleranz durch tägliche Injektionen steigender Endotoxin-Konzentrationen ausgelöst und anhand ausbleibender klinischer Symptome festgestellt. Das Serum so behandelter Kühe wurde auf seine Kapazität, E. coli- Bakterien abzutöten, hin geprüft und zeigte eine erhöhte antimikrobielle Aktivität (Hill, 1967).
Eine Deduktion boviner Endotoxin-Toleranz auf einzelne Zellsubpopulationen erfolgte bei der Betrachtung von primären bovinen Euterepithelzellen. Diese zeigten eine Toleranz, welche durch Konditionierung mit LPS oder Pam2CSK4 induziert werden konnte und sich nach einer Stimulation mit E. coli anhand einer verminderten Expression diverser Gene, darunter TNF und IL1B, ablesen ließ (GÜNTHER et al. 2017). Für bovine Makrophagen konnte in vitro eine erhöhte Phagozytose von lebenden Mycobacterium bovis-Bakterien gezeigt werden, wenn Jungrindern 78 oder 186 Tage zuvor hitzeinaktivierte Mycobacterium bovis-Bakterien verabreicht wurden. Eine veränderte Expression der Zytokine TNF und IL1B wurde in diesen Makrophagen nicht gefunden, wobei Makrophagen hier aus mononukleären Zellen oder CD14-positiven Monozyten unter dem Einfluss von fetalem Kälberserum generiert wurden (JUSTE et al. 2016).
Guerra-Maupome et al. untersuchten den Effekt der BCG-Vakzine im bovinen System genauer.
Diese Arbeitsgruppe wies in vitro ein Training anhand der Expression von IL-6 und TNF- in Reaktion auf LPS oder Pam3CSK4 in CD14-positiven Monozyten nach. In einem ex-vivo- Ansatz wurden Kälber intranasal mit der BCG-Vakzine geimpft und nach vier Wochen mononukleäre Zellen aus dem Blut gewonnen. Auch diese zeigten eine erhöhte Expression und Sekretion von IL-1, TNF- und IL-6 nach Stimulation mit LPS oder Pam3CSK4. Zudem wiesen diese Zellen eine erhöhte Laktatsekretion und einen erhöhten Glukoseverbrauch auf, wobei letzterer bei Stimulation mit Pam3CSK4 nicht signifikant war (GUERRA-MAUPOME et al. 2019).
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Datenlage bezüglich des Gedächtnisses des angeborenen Immunsystems in Nutztieren sich auf wenige Aspekte beschränkt. So existiert ein Nachweis von Toleranz nur in Bezug auf LPS und Pam2CSK4, der jedoch ohne zwischenzeitliche Rückkehr zur Homöostase arbeitet oder sich auf Epithelzellen beschränkt.
Training wurde im veterinärmedizinischen Bereich bislang nur mit Mycobacterium bovis als vollständigem Pathogen nachgewiesen.
3 M ETHODEN
3.1 G EWINNUNG VON LEUKOZYTÄREN S UBPOPULATIONEN AUS DEM PERIPHEREN B LUT
3.1.1 GEWINNUNG VON BOVINEM, VENÖSEN BLUT
Die in dieser Arbeit verwendeten bovinen Zellen wurden aus venösem Blut isoliert. Zur Blutgewinnung standen neun Kühe der Rinderklinik der Tierärztlichen Hochschule Hannover (Aktenzeichen 33.19-42502-05-17A176) zur Verfügung (9.5). Diese Kühe waren rein- oder gemischtrassige Deutsche Holstein, das Durchschnittsalter betrug 8,6 ± 3,0 Jahre. Die Zusammensetzung dieser Gruppe änderte sich im Verlauf des Versuchszeitraumes, wobei zu keinem Zeitpunkt eine Trächtigkeit oder Laktation vorlag.
Anhand tierindividueller Akten wurden Tiere, denen in derselben Woche Blut für Forschungs- oder Therapiezwecke entnommen wurde, sowie solche mit erhöhter Körpertemperatur von der Blutentnahme ausgeschlossen. Zur Herstellung des Blutentnahmebesteckes wurde eine 1,2 * 40 mm Kanüle (9.4.1) über eine Heidelberger Verlängerung (9.4.1) mit einem Vacutainer®- System (9.4.1) verbunden. Nach Fixierung des Tieres mittels Fressgitter, Halfter und Strick erfolgte die adspektorische Prüfung der Inzisionsregion auf Verunreinigungen und Verletzungen.
Die Vene wurde mittels Staukette nach Witte (9.4.1) gestaut und mit der Kanüle punktiert, welche kranial vorgeschoben wurde. Zum Auffangen des Blutes wurden Natrium-Heparin- Röhrchen (10 ml) (9.4.1) verwendet und sofort geschwenkt. Die Menge des gewonnenen Blutes richtete sich nach dem entsprechenden Versuchsvorhaben, jedoch wurden maximal 200 ml entnommen. Nach erfolgter Blutentnahme wurde die Staukette gelöst und die Vene kranial der Punktionsstelle manuell gestaut, bevor die Kanüle entfernt wurde. Nach Lösen des manuellen Staus wurde die Punktionsstelle auf Blutaustritt überprüft.
3.1.2 SEPARATION MONONUKLEÄRER ZELLEN
Für die Gewinnung mononukleärer Zellen (MNC) wurden 20 ml Blut in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen (9.4.2) gegeben und mit 30 ml warmer Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) (9.4.5) verdünnt. Dieses verdünnte Blut wurde daraufhin mit Hilfe einer serologischen
