Einfluss der Konditionierung mit Glucan auf die Zytokinsekretion

In einem ersten Schritt sollte untersucht werden, ob mit G konditionierte Makrophagen eine veränderte Zytokinsekretion als Reaktion auf eine LPS-Stimulation zeigen. Hierfür wurden bovine Gesamt-Monozyten eingesät, an Tag 1 mit 5 oder 10 µg G konditioniert und an Tag 4 mit LPS stimuliert. Der an Tag 5 gewonnene Überstand wurde mittels ELISA (3.7) auf den Gehalt an TNF- und IL-1 geprüft.

Makrophagen aus bovinen Gesamt-Monozyten zeigten unabhängig von Konditionierung und Stimulation keine TNF--Sekretion (Abbildung 34, A). Unstimulierte Makrophagen zeigten darüber hinaus keine IL-1-Sekretion. Stimulierte Makrophagen sezernierten bei drei von sechs untersuchten Tieren nachweisbare Mengen IL-1, wenn sie nicht oder mit 5 µg G konditioniert worden waren. Bei Konditionierung mit 10 µg G sezernierten fünf von sechs untersuchten Tieren IL-1 in nachweisbaren Mengen. Der Unterschied zwischen den verschiedenen Konditionierungen war jedoch ebenso wenig statistisch signifikant wie der Unterschied zwischen stimulierten und nicht-stimulierten Ansätzen (Abbildung 34, B).

Abbildung 34: Zytokin-Sekretion boviner Makrophagen aus Gesamt-Monozyten in Abhängigkeit von der G-Konditionierung.

Gesamt-Monozyten (4*10⁵) wurden eingesät und an Tag 1 mit 5 oder 10 µg G konditioniert. An Tag 2 wurde der Überstand vollständig entfernt und die Zellen an Tag 4 mit 10 ng LPS stimuliert.

An Tag 5 wurde der Überstand entnommen und mittels ELISA auf den Gehalt an TNF- und IL- untersucht. Dargestellt ist der Zytokingehalt in pg/ml (n = 6, Einzelwerte und Median).

Als Kontrolle dienten Ansätze, die nicht konditioniert, nicht stimuliert oder weder konditioniert noch stimuliert wurden. Unterschiede zwischen den Konditionierungen wurden mit Hilfe eines Friedman-Tests, Unterschiede zwischen stimulierten und nicht-stimulierten Ansätzen mittels eines Vorzeichen-Rang-Tests auf Signifikanz geprüft. LPS = Lipopolysaccharid, ELISA = enzyme-linked immunosorbent assay, TNF- = Tumornekrosefaktor-, IL-1 = Interleukin-1.

Da bei keinem der untersuchten Tiere eine TNF-- und nur bei manchen Tieren eine IL-1-Sekretion nachweisbar war, sollte im Folgenden geprüft werden, ob es bei Polarisierung zu M_ca-Makrophagen zu einer höheren Zytokin-Sekretion in Reaktion auf die LPS-Stimulation kommt. Zugleich sollte untersucht werden, ob bei M_ca-polarisierten Makrophagen aus Gesamt-Monozyten ein Training durch G induzierbar ist.

Hierfür wurden Gesamt-Monozyten unter dem Einfluss von boGM-CSF und boIFN- kultiviert, an Tag 1 mit 5 oder 10 µg G konditioniert und an Tag 4 mit LPS stimuliert. An Tag 5 wurden die Überstände entfernt und auf ihren Gehalt an TNF- und IL-1 geprüft.

Bovine M_ca-polarisierte Makrophagen, die aus Gesamt-Monozyten kultiviert wurden, zeigten keinerlei Zytokin-Sekretion, wenn sie nicht stimuliert wurden. Unter LPS-Stimulation war die IL-1-Sekretion von der Konditionierung unabhängig und lediglich tendenziell stärker als in unstimulierten Makrophagen (p = 0,0625; Abbildung 35, B). Die TNF--Sekretion fiel dagegen

TNF-(pg/ml)

signifikant höher aus, wenn die Zellen stimuliert wurden (p = 0,0313). Bei Betrachtung dieses Zytokins konnte auch ein Einfluss der Konditionierung beobachtet werden. Die TNF--Sekretion fiel mittelgradig signifikant stärker aus, wenn die Zellen zuvor mit 5 oder 10 µg G konditioniert worden waren (Konditionierung mit 5 µg G p = 0,004; Konditionierung mit 10 µg

G p = 0,008; Abbildung 35, A).

Abbildung 35: Zytokin-Sekretion boviner Mca-polarisierter Makrophagen aus Gesamt-Monozyten abhängig von der Konditionierung mit G.

Gesamt-Monozyten (4*10⁵) wurden unter dem Einfluss von boGM-CSF und boIFN- kultiviert und an Tag 1 mit 5 oder 10 µg G konditioniert. An Tag 2 wurde der Überstand vollständig entfernt und die Zellen an Tag 4 mit 10 ng LPS stimuliert. An Tag 5 wurde der Überstand entnommen und mittels ELISA auf den Gehalt an TNF- und IL- untersucht. Dargestellt ist der Zytokingehalt in pg/ml (n = 6, Einzelwerte und Median). Als Kontrolle dienten Ansätze, die nicht konditioniert, nicht stimuliert oder weder konditioniert noch stimuliert wurden.

Unterschiede zwischen den Konditionierungen wurden mit Hilfe eines Friedman-Tests und eines konsekutiven Permutationstests, Unterschiede zwischen stimulierten und nicht-stimulierten Ansätzen mittels eines Vorzeichen-Rang-Tests auf Signifikanz geprüft (* = 0,05 ≥ p > 0,01;

** = 0,01 ≥ p > 0,001; *** = p ≤ 0,001). boGM-CSF = boviner, rekombinanter Granulozyten-Makrophagen Kolonie-stimulierender Faktor, boIFN- = bovines, rekombinantes Interferon-, LPS = Lipopolysaccharid, ELISA = enzyme-linked immunosorbent assay, TNF- = Tumornekrosefaktor-, IL-1 = Interleukin-1.

Die quantitative Bestimmung von Zytokinen in einem Zellkulturüberstand lässt keinen Rückschluss auf die Sekretion einer einzelnen Zelle zu. Um zu untersuchen, ob eine erhöhte Zytokin-Sekretion auf eine erhöhte Anzahl vitaler Makrophagen zurückzuführen ist, wurden im folgenden Gesamt-Monozyten kultiviert, an Tag 1 mit 5 oder 10 µg G konditioniert und an Tag 4 stimuliert. An Tag 5 erfolgte die durchflusszytometrische Erfassung (3.2) der

TNF-(pg/ml)

Propidiumiodid-negativen Makrophagen. Das Vorgehen erfolgte analog unter dem Einsatz von boGM-CSF und boIFN-.

Eine Konditionierung mit 10 G führte unabhängig von der Polarisierung der Makrophagen zu geringgradig signifikant mehr Makrophagen, wenn diese stimuliert wurden (unpolarisierte Mph:

p = 0,024, M_ca-polarisierte Mph p = 0,013). In M_ca-polarisierten Makrophagen führte auch 5 µg

G zu einer erhöhten Anzahl stimulierter Makrophagen (p = 0,015; Abbildung 36, B).

Abbildung 36: Anzahl vitaler Makrophagen in Abhängigkeit von der Konditionierung mit G.

Bovine Gesamt-Monozyten (4*10⁵) wurden eingesät, an Tag 1 die adhärenten Monozyten selektiert und mit 5 oder 10 µg G konditioniert. An Tag 2 wurden die Zellen gewaschen und an Tag 4 mit 10 ng LPS stimuliert. An Tag 5 wurden die Zellen abgelöst und durchflusszytometrisch die Anzahl Propidiumiodid-negativer Zellen bestimmt, die hier dargestellt ist (n = 6, Einzelwerte und Median). Als Kontrolle dienten Zellen, die nicht konditioniert, nicht stimuliert oder weder konditioniert noch stimuliert wurden (A). Parallelansätze unkonditionierter oder konditionierter und unstimulierter oder stimulierter Zellen wurden unter dem Einfluss von boGM-CSF und boIFN- kultiviert (B). Unterschiede zwischen den G-Konzentrationen wurden mittels eines Friedman-Tests und eines konsekutiven Permutationstests auf Signifikanz geprüft.

MNCs = mononukleäre Zellen, G = -Glucan, LPS = Lipopolysaccharid, boGM-CSF = boviner, rekombinanter Granulozyten-Makrophagen Kolonie-stimulierender Faktor, boIFN- = bovines, rekombinantes Interferon-

Bei Einsaat von bovinen MNCs konnte ein Training durch 5 oder 10 µg G sowie eine proinflammatorische Reaktion auf 10 µg G, jedoch nicht auf 5 µg G beobachtet werden. Im Folgenden sollte geprüft werden, ob diese Art der Reaktion unabhängig von kontaminierenden Lymphozyten stattfindet. Hierfür wurden bovine Gesamt-Monozyten eingesät und an Tag 1 mit

— 10

5 oder 10 µg G konditioniert. An Tag 2 wurden die Überstände entnommen und mittels ELISA (3.7) auf ihren Gehalt an TNF- und IL-1 geprüft.

Weder in Reaktion auf die Konditionierung mit 5 µg noch mit 10 µg G konnte eine signifikante Änderung der TNF-- oder IL-1-Sekretion beobachtet werden, wobei vier von sechs Tieren unabhängig von der Konditionierung keine nachweisbaren Mengen TNF- sezernierten (Abbildung 37, A).

Abbildung 37: Zytokin-Sekretion G-konditionierter Makrophagen, differenziert aus Gesamt-Monozyten, an Tag 2.

Bovine Gesamt-Monozyten (4*10⁵) wurden eingesät und an Tag 1 mit 5 oder 10 µg G konditioniert. An Tag 2 wurde der Überstand vollständig entfernt und mittels ELISA auf den Gehalt an TNF- und IL- untersucht. Dargestellt ist der Zytokingehalt in pg/ml (n = 6, Einzelwerte und Median). Als Kontrolle dienten Ansätze, die nicht konditioniert wurden.

Unterschiede wurden mit Hilfe eines Friedman-Tests auf Signifikanz geprüft. G = -Glucan, ELISA = enzyme-linked immunosorbent assay, TNF- = Tumornekrosefaktor-, IL-1 = Interleukin-1.

Im Folgenden sollte geprüft werden, ob eine Polarisierung der Monozyten zu klassisch-aktivierten Makrophagen zu einer Reaktion auf die Konditionierungssubstanzen führt. Hierfür wurden Gesamt-Monozyten unter dem Einfluss von boGM-CSF und boIFN- kultiviert, an Tag 1 mit 5 oder 10 µg G konditioniert und an Tag 2 die Überstände entnommen. Diese wurden mittels ELISA (3.7) auf ihren Gehalt an TNF- und IL-1 untersucht.

Es konnte keine erhöhte Sekretion von TNF- oder IL-1 in Reaktion auf Konditionierung mit 5 oder 10 µg G nachgewiesen werden (für 10 µg G: p = 0,055 resp. 0,051). Unter M_ca

polarisierenden Bedingungen sezernierten je nach Konditionierung ein bis vier Tiere TNF- und alle Tiere IL-1Abbildung 38.

Abbildung 38: Zytokin-Sekretion G-konditionierter, Mca-polarisierter Makrophagen, differenziert aus Gesamt-Monozyten, an Tag 2.

Bovine Gesamt-Monozyten (4*10⁵) wurden unter dem Einfluss von boGM-CSF und boIFN-

kultiviert und an Tag 1 mit 5 oder 10 µg G konditioniert. An Tag 2 wurde der Überstand vollständig entfernt und mittels ELISA auf den Gehalt an TNF- und IL- untersucht.

Dargestellt ist der Zytokingehalt in pg/ml (n = 6, Einzelwerte und Median). Als Kontrolle dienten Ansätze, die nicht konditioniert wurden. Unterschiede zwischen konditionierten und nicht-konditionierten Ansätzen wurden mit Hilfe eines Friedman-Tests auf Signifikanz geprüft.

G = -Glucan, ELISA = enzyme-linked immunosorbent assay, TNF- = Tumornekrosefaktor-, IL-1 = Interleukin-1boGM-CSF = boviner, rekombinanter Granulozyten-Makrophagen Kolonie-stimulierender Faktor, boIFN- = bovines, rekombinantes Interferon-.