G konnte in bovinen, Plastik-adhärenten Monozyten ein Training des angeborenen Immunsystems auslösen (Abbildung 16, Abbildung 17) Dies stimmt überein mit Versuchen von Quintin et al. an humanen Plastik-adhärenten Monozyten, welche G als jenes PAMP identifizierten, welches das Candida albicans-vermittelte Training des angeborenen Immunsystems mediiert. Eine Differenz zu humanen Monozyten zeigt sich aber in der benötigten Konzentration des Gedächtnis-Induktors. Während Quintin et al. G in einer Konzentration von 10 µg einsetzten, um Training zu induzieren, zeigten Ifrim et al., dass für ein Training in humanen Monozyten eine Konditionierung mit 1 µg G ausreichend ist (QUINTIN et al. 2012; IFRIM et al. 2014). Diese Konzentration erwies sich jedoch als unzureichend, um Training in bovinen Monozyten zu induzieren (Abbildung 14, Abbildung 15).
In dieser Arbeit wurde eine Gedächtnisfunktion anhand der TNF-- und IL-1-Sekretion konditionierter Monozyten nach Stimulation mit LPS beurteilt. In Hinblick auf die Trainingsinduktion durch G ließ sich ein Trainingseffekt nur anhand einer erhöhten TNF--Sekretion ohne Konditionierungs-bedingte Veränderung der IL-1-TNF--Sekretion erkennen (Abbildung 16, Abbildung 17). Eine erhöhte IL-1-Sekretion wurde bislang nicht im Rahmen einer G-Konditionierung gemessen, jedoch als Charakteristikum von BCG-konditionierten Monozyten erkannt. 3 Monate nach der Impfung wurden Plastik-adhärente Monozyten isoliert und mit verschiedenen inaktivierten Pathogenen stimuliert. Nach Stimulation mit Mycobacterium tuberculosis und Staphylococcus aureus zeigten die Monozyten eine signifikant höhere IL-1-Sekretion als Monozyten vor der Impfung (KLEINNIJENHUIS et al. 2012). Die IL1B-mRNA wurde nach Stimulation mit Mycobacterium tuberculosis, Staphylococcus aureus und Candida albicans in höherer Menge nachgewiesen als vor der Impfung (KLEINNIJENHUIS et al. 2012). Dementsprechend scheint eine erhöhte IL-1-Sekretion ein mögliches, aber kein zwingendes Charakteristikum trainierter Zellen des angeborenen Immunsystems zu sein, ähnlich wie es für die nicht gleichsinnige Sekretion von TNF- und IL-6 gezeigt wurde (IFRIM et al. 2014).
Eine größere Menge TNF- im Überstand G-konditionierter, stimulierter Zellen kann auf eine erhöhte Anzahl vitaler Makrophagen zurückzuführen sein. An humanen, klassischen Monozyten
wurde eine Konditionierung mit 5 oder 50 µg G durchgeführt, welche zu einer erhöhten Anzahl vitaler Makrophagen an Tag 7 führte (LEONHARDT et al. 2018). Dieser Effekt wurde auch bei Konditionierung muriner und humaner Plastik-adhärenter Monozyten mit 5 µg G beobachtet, wobei in den Experimenten mit murinen Zellen die Zytokinmenge in Relation zu der Anzahl gewonnener Makrophagen gesetzt wurde und auf diese Weise kein signifikanter Unterschied in der Zytokinsekretion mehr ersichtlich war (S. BEKKERING et al. 2016; GARCIA-VALTANEN et al. 2017). Wurden humane, klassische Monozyten mit G konditioniert und die Zytokinmenge auf die Gesamt-Proteinmenge bezogen, war kein Gedächtniseffekt nachweisbar (LEONHARDT et al. 2018). Dieses Ergebnis stellt in Frage, ob das bislang nachgewiesene Training in humanen Monozyten möglicherweise ein Effekt einer erhöhten Zellzahl und kein Phänomen der einzelnen Zelle ist. Bei der Einsaat von mononukleären Zellen und der Selektion Plastik-adhärenter Monozyten konnte kein solcher Effekt durch eine der eingesetzten G-Konzentrationen beobachtet werden (Abbildung 20). Bei der Einsaat von Gesamt-Monozyten konnten jedoch vor allem bei Konditionierung mit der höheren G-Konzentration vermehrt vitale Makrophagen erfasst werden (Abbildung 31). Eine Untersuchung der produzierten Zytokinmenge in Hinblick auf die Zellzahl und die Rolle der kontaminierenden Lymphozyten sollte in Zukunft vertiefend erfolgen.
Bei Einsaat klassischer und intermediärer Monozyten konnte kein Trainingseffekt durch G in stimulierten Makrophagen gemessen werden (Abbildung 25; Abbildung 26). Dies stimmt überein mit Daten von Leonhardt et al., welche versuchten, Training in humanen, klassischen Monozyten durch eine Konditionierung mit 5 µg G zu induzieren. In diesem Fall konnte jedoch weder eine erhöhte TNF-, noch eine erhöhte IL-6-Sekretion konditionierter Makrophagen beobachtet werden. Stattdessen wurde beobachtet, dass G-konditionierte klassische Monozyten nach Kultivierung und Stimulation vermehrt IL-10 sezernierten (LEONHARDT et al. 2018). Diese Eigenschaft wird von Leonhardt et al. als Indiz für eine Polarisierung G-konditionierter Makrophagen in Richtung Wund-heilende Makrophagen gedeutet. Eine verstärkte Sekretion von IL-10 wird jedoch auch des Öfteren im Zusammenhang mit Training beschrieben, so wurde bei einer in-vivo-Induktion eines G-vermittelten Trainings in murinem Serum vermehrt IL-10 nachgewiesen (GARCIA-VALTANEN et al. 2017). Auch eine Trainingsinduktion in humanen, Plastik-adhärenten Monozyten führt zu einer erhöhten IL-10-Sekretion, wobei dieser Effekt
sowohl bei adulten als auch bei neonatalen Zellen beobachtet wird (S. BEKKERING et al. 2016;
NAMAKULA et al. 2020). Ob und in welchem Umfang auch die Sekretion anti-inflammatorischer Zytokine charakteristisch für bovine, trainierte Makrophagen ist und ob bei Betrachtung solcher anti-inflammtorischen Zytokine ein Training in klassischen und intermediären bovinen Monozyten beobachtet werden kann, war nicht Gegenstand dieser Arbeit und sollte in Zukunft untersucht werden.
Da in Plastik-adhärenten Monozyten ein Training des angeborenen Immunsystems induzierbar war, bei Einsaat von klassischen und intermediären Monozyten jedoch nicht, wurde in dieser Arbeit die Stärke der Korrelation zwischen Trainingseffekt und den Monozyten-Subpopulationen sowie kontaminierenden lymphoiden Zellen bestimmt. Auf Grundlage der signifikanten positiven Korrelation zwischen dem Trainingseffekt und der Gruppe der nicht-klassischen Monozyten (Tabelle 6) wurden daraufhin Gesamt-Monozyten, bestehend aus klassischen, intermediären und nicht-klassischen Monozyten, mit G konditioniert. In dieser Zellpopulation konnte bei Polarisierung der Monozyten in Richtung Mca-Makrophagen ein Training des angeborenen Immunsystems beobachtet werden (Abbildung 35). Damit scheint die Induktion von Training in bovinen Monozyten von der Anwesenheit nicht-klassischer Monozyten abhängig zu sein. Die Daten der intrazellulären Immunfluoreszenz sind auf Grundlage der Nähe zur Isotypkontrolle wenig belastbar (Abbildung 43). Sollen diese zur Interpretation herangezogen werden, ergeben sie keinen Hinweis darauf, dass Makrophagen aus nicht-klassischen Monozyten in verstärktem Maße TNF- im Rahmen eines Trainings sezernieren (Abbildung 43, Abbildung 44). Von daher ist anzunehmen, dass der Kontakt zu oder das Sekretom von nicht-klassischen Monozyten und daraus entstehenden Makrophagen die Makrophagen der anderen Monozyten-Subpopulationen zu einem trainierten Funktionszustand befähigt. Humane nicht-klassische Monozyten sezernieren zwar in Reaktion auf TLR-Agonisten weniger pro-inflammtorische Zytokine wie TNF- und IL-1, sind jedoch die Hauptquelle für andere Zytokine wie IFN- (BOYETTE et al. 2017).
Während die Reaktion humaner, nicht-klassischer Monozyten auf -Glucan nicht untersucht ist, wurde für Stimulation dieser Zellen mit Zymosan gezeigt, dass CD16+-Monozyten hierauf mit einer stärkeren Produktion inflammatorischer Zytokine wie TNF- und IL-6 reagieren als CD16– -Monozyten und schon im unstimulierten Zustand mehr -Defensine produzieren als klassische Monozyten (AGUILAR-RUIZ et al. 2011). Die genannten Zytokine sollten bei näherer Untersuchung des Einflusses boviner, nicht-klassischer Monozyten auf die Induktion von
Training Beachtung finden. Eine Dependenz von nicht-klassischen Monozyten kann neben einem Einfluss intermediärer Monozyten auch im humanen System vermutet werden, da eine Induktion von Training mit 5 µg G bei klassischen Monozyten nicht nachweisbar ist (LEONHARDT et al. 2018). Die eingesetzten, humanen Monozyten wurden in diesem Zusammenhang jedoch bislang nicht auf die jeweiligen Anteile der Monozyten-Subpopulationen untersucht. Neben den nicht-klassischen Monozyten müssen entweder die Zytokine GM-CSF und IFN- oder lymphoide Zellen zugegen sein, um ein Training in bovinen Makrophagen erfassen zu können. Der Effekt der lymphoiden Zellen könnte hierbei in der Produktion der eingesetzten Zytokine bestehen. Für murine Alveolarmakrophagen wurde gezeigt, dass ein Training in diesen Zellen von dem IFN- abhängig ist, welches von CD8-T-Zellen sezerniert wurde (YAO et al. 2018). Ob IFN- für die Induktion von Training in Gesamt-Monozyten ausreichend ist, sollte im Weiteren untersucht werden.
Die Konditionierung beeinflusste den Phänotyp der hier generierten trainierten Makrophagen nur dann, wenn mononukleäre Zellen eingesät wurden, also kontaminierende Lymphozyten anwesend waren Dann konnte durch die Konditionierung mit G eine verminderte Expression von MHC-II festgestellt werden, die sich jedoch nur in unstimulierten Ansätzen zeigte (Abbildung 23, A; Abbildung 24, A). Wie bei der Induktion von Toleranz schon beschrieben, minderte die Stimulation die MHC-II-Expression, sodass ein senkender Effekt durch die Konditionierung gegebenenfalls überdeckt wird. Eine verminderte MHC-II-Expression in trainierten Makrophagen widerspricht Daten von Yao et al., die für viral trainierte, murine Alveolarmakrophagen eine erhöhte MHC-II-Expression nachwiesen (YAO et al. 2018). Mögliche Ursachen für eine verminderte MHC-II-Expression wurden weiter oben schon besprochen (5.4).
Eine weitere Phänotyp-Änderung trainierter Makrophagen betrifft CD206. Dieses Oberflächenmolekül wurde bei konditionierten Makrophagen vermehrt exprimiert und zwar nur, wenn diese in Anwesenheit lymphoider Zellen und nicht unter dem Einfluss von boGM-CSF und boIFN- kultiviert wurden (Abbildung 23, B). Eine erhöhte Expression von CD206 spricht für die Polarisierung in Richtung Wund-heilender Makrophagen, wobei bovine Makrophagen nach Kultivierung mit M-CSF, IL-4 und IL-13 eine stärker erhöhte CD206-Expression aufweisen (FERNANDES WERNER 2019). Eine Entwicklung in Richtung Wund-heilender Makrophagen kann als Erklärung dafür herangezogen werden, dass kein Trainingseffekt anhand der IL-1-Sekretion festgestellt wurde. Jenvey et al. zeigten 2019 für bovine Darm-Makrophagen, dass
CD206 mit Kennzeichen wund-heilender Makrophagen wie IL-1Ra korreliert, wodurch die IL-1-Sekretion gehemmt wird. Allerdings hemmt IL-1Ra bei humanen, mononukleären Zellen auch die TNF--Sekretion, welche in den hier vorliegenden Daten vorliegt (MARSH et al. 1994;
JENVEY et al. 2019).