Nachdem in einzelnen Monozyten-Subpopulationen und in CD14+-Monozyten keine Toleranz des angeborenen Immunsystems induziert werden konnte, sollte im Folgenden überprüft werden, ob eine solche in Gesamt-Monozyten ausgelöst werden kann.
Hierfür wurden cM, intM und ncM zusammen eingesät, an Tag 1 mit 100 ng LPS konditioniert sowie an Tag 4 mit LPS stimuliert. An Tag 5 gewonnene Überstände wurden mittels ELISA (3.7) auf die enthaltene Menge TNF- und IL-1 geprüft.
Bei Einsaat von Gesamt-Monozyten konnte unabhängig von Konditionierung oder Stimulation keine TNF--Sekretion beobachtet werden (Abbildung 29, A). Stimulierte Ansätze zeigten nur in der Hälfte der Fälle eine messbare IL-1-Sekretion, welche sich unabhängig von einer Konditionierung mit LPS darstellte (Abbildung 29, B).
Abbildung 29: TNF--Sekretion in Abhängigkeit von LPS-Konditionierung, Einsaat von Gesamt-Monozyten.
Gesamt-Monozyten (4*105) wurden eingesät und an Tag 1 mit 100 ng LPS konditioniert. An Tag 2 wurde der Überstand vollständig entfernt und die Zellen an Tag 4 mit 10 ng LPS stimuliert.
An Tag 5 wurde der Überstand entnommen und mittels ELISA auf den Gehalt an TNF- und IL- untersucht. Dargestellt ist der Zytokingehalt in pg/ml (n = 6, Einzelwerte und Median).
Als Kontrolle dienten Ansätze, die nicht konditioniert, nicht stimuliert oder weder konditioniert noch stimuliert wurden. Unterschiede zwischen konditionierten und nicht-konditionierten Ansätzen wurde mittels eines Friedman-Tests, Unterschiede zwischen stimulierten und nicht-stimulierten Ansätzen mittels eines Vorzeichen-Rang-Tests auf Signifikanz geprüft.
LPS = Lipopolysaccharid, ELISA = enzyme-linked immunosorbent assay, TNF- = Tumornekrosefaktor-, IL-1 = Interleukin-1.
TNF-(pg/ml)
Um bovine Makrophagen zu einer TNF--Sekretion in Reaktion auf die LPS-Stimulation zu veranlassen, wurde bovinen Gesamt-Monozyten täglich boGM-CSF und boIFN- zugegeben. So kultivierte Zellen wurden an Tag 1 mit LPS konditioniert und an Tag 4 mit LPS stimuliert. An Tag 5 wurden die Überstände entfernt und mittels ELISA (3.7) auf ihren Gehalt an TNF- und IL-1 untersucht.
Bei Kultivierung von Gesamt-Monozyten unter dem Einfluss von boGM-CSF und boIFN-
konnte in allen Tieren eine TNF-- sowie eine IL-1-Sekretion in Reaktion auf die LPS-Stimulation nachgewiesen werden. Dabei fiel die Reaktion bei Betrachtung von TNF-
geringgradig signifikant aus (p = 0,0313; Abbildung 30, A), während die Reaktion bei Betrachtung von IL-1 nur tendenziell signifikant ausfiel (p = 0,0625; Abbildung 30, B). Dabei hatte die Konditionierung mit LPS weder in stimulierten noch in unstimulierten Ansätzen einen Einfluss auf die Zytokin-Sekretion.
Abbildung 30: Zytokin-Sekretion boviner Mca-polarisierter Makrophagen aus Gesamt-Monozyten abhängig von der LPS-Konditionierung.
Gesamt-Monozyten (4*105) wurden unter dem Einfluss von boGM-CSF und boIFN- kultiviert und an Tag 1 mit 100 ng LPS konditioniert. An Tag 2 wurde der Überstand vollständig entfernt und die Zellen an Tag 4 mit 10 ng LPS stimuliert. An Tag 5 wurde der Überstand entnommen und mittels ELISA auf den Gehalt an TNF- und IL- untersucht. Dargestellt ist der Zytokingehalt in pg/ml (n = 6, Einzelwerte und Median). Als Kontrolle dienten Ansätze, die nicht konditioniert, nicht stimuliert oder weder konditioniert noch stimuliert wurden.
Unterschiede zwischen konditionierten Ansätzen und nicht konditionierten Kontrollen wurden mit Hilfe eines Friedman-Tests, Unterschiede zwischen stimulierten und nicht-stimulierten Ansätzen mittels eines Vorzeichen-Rang-Tests auf Signifikanz geprüft (* = 0,05 ≥ p > 0,01;
** = 0,01 ≥ p > 0,001; *** = p ≤ 0,001). boGM-CSF = boviner, rekombinanter Granulozyten-Makrophagen Kolonie-stimulierender Faktor, boIFN- = bovines, rekombinantes Interferon-,
TNF-(pg/ml)
ELISA = enzyme-linked immunosorbent assay, TNF- = Tumornekrosefaktor-, IL-1 = Interleukin-1 LPS = Lipopolysaccharid.
Im Folgenden sollte festgestellt werden, ob die signifikante TNF--Sekretion in Reaktion auf die Stimulation mit einer erhöhten Anzahl vitaler Makrophagen einhergeht wie bei Einsaat von boviner CD14+-Monozyten oder davon unabhängig ist wie bei Einsaat von bovinen mononukleären Zellen. Hierfür wurden bovine Gesamt-Monozyten unter dem Einfluss von boGM-CSF und boIFN- kultiviert und an Tag 4 mit LPS stimuliert. An Tag 5 wurden die adhärenten Zellen abgelöst und die Anzahl vitaler Makrophagen durchflusszytometrisch (3.2) bestimmt.
Durch die Kultivierung mit boGM-CSF und boIFN- wurden signifikant mehr vitale Makrophagen erfasst. Diese Steigerung fiel bei unstimulierten Ansätzen hochgradig und bei stimulierten Ansätzen geringgradig signifikant aus (p = 0,0005 resp. p = 0,015). Zudem wurden mittelgradig signifikant weniger vitale Makrophagen detektiert, wenn diese unter dem Einfluss der Zytokine mit LPS stimuliert wurden (p = 0,0313; Abbildung 31).
Abbildung 31: Anzahl vitaler Makrophagen in Abhängigkeit von dem Einsatz der Zytokine boGM-CSF und boIFN-.
Bovine Gesamt-Monozyten (4*105) wurden unter täglicher Zugabe von boGM-CSF und boIFN- kultiviert sowie an Tag 4 mit 10 ng LPS stimuliert. An Tag 5 wurden die Makrophagen abgelöst und die Anzahl Propidiumiodid-negativer Makrophagen gemessen. Als Kontrollen
Zytokine — + — +
Stimulation — +
Anzahl vitaler Makrophagen 0 10 20 30 40
50
*** *
*
dienten Zellen, denen täglich PBS zugegeben wurde und Ansätze, welche nicht mit LPS stimuliert wurden. Angegeben ist die Anzahl vitaler Makrophagen in einem gemessenen Mikroliter (n = 6, Einzelwerte). Unterschiede zwischen Kultivierung mit und ohne den Einfluss der Zytokine wurden mittels eines t-Tests, Unterschiede zwischen stimulierten und nicht-stimulierten Ansätzen mittels eines Vorzeichen-Rang-Tests auf Signifikanz geprüft (* = 0,05 ≥ p > 0,01; ** = 0,01 ≥ p > 0,001; *** = p ≤ 0,001). LPS = Lipopolysaccharid, boGM-CSF = boviner, rekombinanter Granulozyten-Makrophagen Kolonie-stimulierender Faktor, boIFN- = bovines, rekombinantes Interferon-
Um herauszufinden, ob das Ausbleiben einer nachweisbaren Toleranz mit einem Ausbleiben einer pro-inflammatorischen Reaktion auf die Konditionierungssubstanz zusammenhängt, wurde im Folgenden geprüft, ob auf die Konditionierungssubstanz mit der Sekretion pro-inflammatorischer Zytokine reagiert wurde. Hierfür wurden bovine Gesamt-Monozyten eingesät, an Tag 1 mit LPS konditioniert und die an Tag 2 entnommenen Überstände mittels ELISA (3.7) auf ihren Gehalt an TNF- und IL-1 überprüft.
Bovine Makrophagen reagierten auf die Konditionierung mit LPS im Sinne einer höheren Sekretion pro-inflammatorischer Zytokine. Dabei fiel dieser Unterschied zu den Kontrollansätzen in Bezug auf TNF- geringgradig (Abbildung 32, A) und in Bezug auf IL-1
mittelgradig signifikant aus (Abbildung 32, B; p = 0,028 resp. p = 0,004). Ansätze, welche nicht konditioniert wurden, zeigten in einem von sechs Fällen eine detektierbare TNF--Sekretion.
Abbildung 32: Zytokin-Sekretion boviner Monozyten, differenziert aus Gesamt-Monozyten, an Tag 2 in Abhängigkeit von der LPS-Konditionierung.
Bovine Gesamt-Monozyten (4*105) wurden eingesät und an Tag 1 mit 100 ng LPS konditioniert.
An Tag 2 wurden die Überstände entfernt und auf ihren Gehalt an TNF- (A) und IL-1 (B) mittels ELISA untersucht. Die Zytokin-Gehalte sind in pg/ml dargestellt (Einzelwert und Median, n = 6). Als Kontrolle dienten Ansätze, welche nicht konditioniert wurden. Unterschiede zwischen diesen Kontrollen und den konditionierten Ansätzen wurden mittels eines Friedman-
Konditionierung — LPS
und eines konsekutiven Permutationstest auf Signifikanz geprüft (* = 0,05 ≥ p > 0,01;
** = 0,01 ≥ p > 0,001; *** = p ≤ 0,001). LPS = Lipopolysaccharid, ELISA = enzyme-linked immunosorbent assay, TNF- = Tumornekrosefaktor-, IL-1 = Interleukin-1
Um herauszufinden, ob eine ähnliche Reaktion auf die Konditionierungssubstanz besteht, wenn bovine Gesamt-Monozyten in Richtung klassisch-aktivierter Makrophagen polarisiert werden, wurden Gesamt-Monozyten unter dem Einfluss von boGM-CSF und boIFN- kultiviert.
Währenddessen wurden diese an Tag 1 mit LPS konditioniert und an Tag 2 die Überstände entfernt. Jene wurden im Anschluss mittels ELISA (3.7) auf ihren Gehalt an TNF- und IL-1
hin untersucht.
Im Gegensatz zu den nicht-polarisierten Makrophagen sezernierten die klassisch-aktivierten Makrophagen zwar geringgradig signifikant mehr IL-1, wenn sie konditioniert wurden (Abbildung 33, B), jedoch nicht signifikant mehr TNF-Abbildung 33. Drei von sechs Tieren sezernierten dabei unabhängig von einer Konditionierung kein TNF- in nachweisbaren Mengen.
Abbildung 33: Zytokin-Sekretion boviner, Mca-polarisierter Monozyten, differenziert aus Gesamt-Monozyten, an Tag 2 in Abhängigkeit von der LPS-Konditionierung.
Bovine Gesamt-Monozyten (4*105) wurden unter dem Einfluss von boGM-CSF und boIFN-
kultiviert. An Tag 1 wurden diese Zellen mit LPS konditioniert und an Tag 2 die Überstände entnommen. Diese wurden mittels ELISA auf ihren Gehalt an TNF- (A) und IL-1 (B) geprüft. Die Zytokin-Gehalte sind in pg/ml dargestellt (Einzelwerte und Median, n = 6). Als Kontrolle dienten Ansätze, welche nicht konditioniert wurden. Unterschiede zwischen diesen Kontrollen und den konditionierten Ansätzen wurden mittels eines Friedman- und eines konsekutiven Permutationstest auf Signifikanz geprüft (* = 0,05 ≥ p > 0,01;
** = 0,01 ≥ p > 0,001; *** = p ≤ 0,001). boGM-CSF = boviner, rekombinanter Granulozyten-Makrophagen Kolonie-stimulierender Faktor, boIFN- = bovines, rekombinantes Interferon-,
Konditionierung — LPS
LPS = Lipopolysaccharid, ELISA = enzyme-linked immunosorbent assay, TNF- = Tumornekrosefaktor-, IL-1 = Interleukin-1