Induktion eines Gedächtnisses in bovinen, Plastik-adhärenten Monozyten

Um eine Induktion von Gedächtnis in bovinen, Plastik-adhärenten Monozyten nachzuweisen, wurden mononukleäre Zellen (3.1.2) auf eine Zellzahl von 2*10⁶ pro Milliliter komplettem Medium (eM)(9.4.5) eingestellt. Je ein Milliliter dieser Zellsuspension wurde in ein well einer 24-well-Platte für adhärente Zellen (9.4.2) gegeben. Die Zellen wurden über Nacht bei 37 °C und 5 % CO₂ im Brutschrank (9.2) inkubiert. Am folgenden Morgen wurden die Zellen gewaschen, um nicht-adhärente Zellen zu entfernen. Hierfür wurde der Überstand verworfen und 1 ml warmes PBS je well zugegeben. Dieses wurde wiederum verworfen. Die nun verbleibenden Plastik-adhärenten Zellen wurden im Folgenden konditioniert. Hierfür wurde G (1 µg/ml eM)(9.4.5) sowie LPS (100 ng/ml eM)(9.4.3) eingesetzt. Zur Kontrolle diente reines eM. Hiervon wurde je 1 ml zu den Zellen gegeben und die Zellen für weitere 24 Stunden bei 37 °C und 5 % CO₂ inkubiert. Daraufhin wurden am nächsten Tag die Zellüberstände abgenommen und in

2 ml Mikrozentrifugen-Gefäße (9.4.2) überführt, wobei Doppelansätze zusammengefasst wurden.

Diese wurden zur späteren Analyse bei – 20 °C eingefroren. Die Zellen wurden zur Entfernung des Konditionierungsmediums mit 1 ml warmem PBS gewaschen. Danach wurde ihnen 1 ml warmes eM zugegeben und die Zellen für 48 Stunden bei 37 °C und 5 % CO₂ inkubiert. An Tag 4 erfolgte die Stimulation der Zellen, indem der Überstand der Zellen verworfen wurde und die Zellen mit 10 ng LPS in 1 ml eM stimuliert wurden. In Kontrollansätzen wurden konditionierte Zellen mit 1 ml reinen eM inkubiert. Nach weiteren 24 Stunden Inkubation bei 37 °C und 5 % CO₂ wurden die Überstände in 1,5 ml-Reaktionsgefäße überführt und bis zu einer späteren Analyse bei – 20 °C gelagert. Die Zellen wurden mit 1 ml PBS gewaschen, um zur Adhäsion nötiges Kalzium und Magnesium zu entfernen. Danach wurde das PBS verworfen und 200 µl Accutase (9.4.3) auf die Zellen gegeben. Nach einer 20-minütigen Inkubation im Brutschrank hatten sich die Zellen vom Platten-Boden abgelöst und die Accutase wurde mit 200 µl eM ausgeglichen. Die Anzahl, Vitalität, Morphologie und der Phänotyp der Zellen wurde durchflusszytometrisch (3.2) erfasst. Um als Kontrolle für den im Folgenden beschriebenen Versuch dienen zu können, erhielten alle Ansätze in 24-Stunden-Intervallen 35 µl PBS über den gesamten Versuchszeitraum.

Abbildung 1: Protokoll zur Induktion von Gedächtnis in Plastik-adhärenten Monozyten.

Einfluss von Zytokinen auf die Gedächtnisinduktion in bovinen, Plastik-adhärenten Monozyten

Da MAMPs und die Gedächtnisinduktion einen Einfluss auf die Zell-Genese ausüben, sollte überprüft werden, inwiefern die Generierung von klassisch-aktivierten Makrophagen durch die zeitgleiche Induktion von Training beeinflusst wird. Das in unserem Labor etablierte Verfahren zur Generierung dieser Zellen besteht in der täglichen Zugabe von bovinem, rekombinanten GM-CSF (boGM-CSF)(9.4.3), IFN-boIFN- und LPS. Da LPS in den hier beschriebenen Versuchen auf seine Gedächtnis-induzierende Wirkung hin untersucht werden

MNC Ausgangs-population:

Tag 2 Tag 1

Tag 0 Tag 3 Tag 4 Tag 5

Einsaat

Waschen

Konditionieren Waschen Stimulation Messen

sollte, kommen in dieser Arbeit nur boGM-CSF und boIFN- zur Generierung von klassisch-aktivierten Makrophagen zum Einsatz.

Das Vorgehen entspricht dem Ansatz zur Induktion des Gedächtnisses in bovinen, Plastik-adhärenten Monozyten mit der Adaption, dass zum Zeitpunkt des Einsäens den Zellen je 20 ng boGM-CSF und boIFN- zugegeben wurde, was einer Menge von 35 µl entsprach. Die weitere Zytokin-Zugabe erfolgte ab Tag 1 jeden Morgen im Abstand von 24 Stunden.

Abbildung 2: Protokoll zum Einfluss von Zytokinen auf die Induktion von Gedächtnis in Plastik-adhärenten Monozyten.

Titration des G zur Gedächtnisinduktion

Um die Dosis-Abhängigkeit einer Gedächtnisinduktion durch G zu betrachten, wurden Plastik-adhärente Monozyten (3.1.2) mit drei verschiedenen Konzentrationen G konditioniert.

Hierfür wurden mononukleäre Zellen auf eine Zellzahl von 2*10⁶ Zellen pro ml eM eingestellt und je 1 ml dieser Zellsuspension in ein well einer 24-well-Platte gegeben. Nach einer Inkubation bei 37 °C und 5 % CO₂ wurde am folgenden Morgen der Überstand entfernt und die Zellen mit 1 ml warmem PBS gewaschen, um adhärente Zellen zu selektieren. Daraufhin wurden die Zellen mit Medium als Kontrolle oder 1, 5 oder 10 µg G in je 1 ml eM konditioniert. Nach 24 Stunden Inkubation bei 37 °C und 5 % CO₂ wurden die entstandenen Überstände in 2 ml Mikrozentrifugen-Gefäße überführt, wobei Doppelansätze zusammengefasst wurden, und zur späteren Analyse bei – 20 °C gelagert. Die Zellen wurden mit je 1 ml warmem eM versorgt und für 48 Stunden bei 37 °C und 5 % CO₂ inkubiert. Daraufhin wurden die Zellen mit 10 ng LPS pro ml eM stimuliert, wobei den Kontrollansätzen 1 ml reines eM gegeben wurde. Nach einer

Magnesium zu entfernen und die nachfolgende Ablösung durch 200 µl Accutase zu ermöglichen.

Die Zellen wurden für 20 Minuten mit Accutase inkubiert und zeigten sich danach mikroskopisch in Suspension. Folgend wurden durchflusszytometrisch (3.2) Anzahl, Vitalität und Morphologie sowie der Phänotyp der Zellen erfasst. Um als Kontrolle für den als nächstes beschriebenen Versuch dienen zu können, erhielten alle Ansätze in 24-Stunden-Intervallen 35 µl PBS über den gesamten Versuchszeitraum.

Einfluss von Zytokinen auf die Gedächtnisinduktion durch verschiedene G-Konzentrationen

Um die Interaktion der Polarisierung in klassisch-aktivierte Makrophagen mit der Induktion von Gedächtnis durch G vertiefend zu untersuchen, wurde das Protokoll zur Titration des G zur Gedächtnisinduktion abgewandelt, um klassisch-aktivierte Makrophagen zu generieren. Zu diesem Zweck wurden den Ansätzen bei Einsaat je 20 ng boGM-CSF und boIFN- in einem Gesamtvolumen von 35 µl zugegeben. In einem Intervall von 24 Stunden wiederholte sich dieses Vorgehen an jedem Morgen des Versuchszeitraumes.

Untersuchung des Anteils kontaminierender Lymphozyten

Um die Anteile von kontaminierenden Lymphozyten zu bestimmen, wurden mehrere Parallelansätze mit adhärenten mononukleären Zellen (3.1.2) gemacht. Ein Ansatz erfolgte identisch wie für die Induktion von Gedächtnis in bovinen, Plastik-adhärenten Monozyten besprochen: Es wurden 2*10⁶ mononukleäre Zellen eingesät und an Tag 1 nicht-adhärente Zellen durch Waschen mit warmem PBS entfernt. In diesem Ansatz erfolgte die Konditionierung mit 100 ng LPS und 5 oder 10 µg G oder eM zur Kontrolle für 24 Stunden. Nach Entnahme der Überstände, Waschen mit warmem PBS und Kultivierung für 48 Stunden wurden die Zellen mit 10 ng LPS oder eM zur Kontrolle für 24 Stunden stimuliert, danach Überstände gewonnen und die Zellen durchflusszytometrisch (3.2) charakterisiert. Hierbei erhielt eine Hälfte der Ansätze über den ganzen Versuchszeitraum 35 µl PBS täglich und die andere Hälfte je 20 ng boGM-CSF und boIFN- in einem Gesamtvolumen von 35 µl. Ein weiterer Ansatz verlief in derselben Weise bis zu Tag 4. An diesem Tag wurde der Überstand verworfen und die Zellen zur weiteren Charakterisierung abgelöst. Hierzu wurden die Zellen zuerst mit 1 ml warmem PBS gewaschen, um zur Adhäsion benötigtes Kalzium und Magnesium zu entfernen. Alsdann wurden 200 µl

Accutase auf die Zellen gegeben und für 20 Minuten bei 37 °C und 5 % CO₂ inkubiert. Dadurch lösten sich die Zellen vom Boden der Platte und die Accutase wurde mit 200 µl eM ausgeglichen.

Abschließend wurden Anzahl, Vitalität, Morphologie sowie der Phänotyp der abgelösten Zellen durchflusszytometrisch (3.2) erfasst.

Abbildung 3: Protokoll zur Untersuchung des Anteils kontaminierender Lymphozyten auf die Induktion von Gedächtnis.