Z ELLEN
In dieser Arbeit konnte eine Toleranz des angeborenen Immunsystems bei Einsaat von bovinen mononukleären Zellen und Selektion von Monozyten durch Entfernen nicht-adhärenter Zellen beobachtet werden (Abbildung 7, B; Abbildung 8). Diese Ergebnisse stimmen überein mit Daten von Ifrim et al., welche in humanen, Plastik-adhärenten Monozyten eine Toleranz durch Konditionierung mit LPS nachweisen konnten. Während in dieser Arbeit eine geringere Sekretion der Zytokine TNF- und IL-1 mit der LPS-Konditionierung einherging, bestimmten Ifrim et al. die TNF-- und IL-6-Sekretion stimulierter Zellen. Eine LPS-Toleranz konnte hierbei auch in Bezug auf die IL-6-Sekretion beobachtet werden (IFRIM et al. 2014). Ifrim et al.
verwendeten zur Induktion eines Gedächtnisses LPS in verschiedenen Konzentrationen. Dabei war eine Konditionierung mit 100 ng LPS die einzige Entität, welche zu einer Induktion von Toleranz führte und die auch in dieser Arbeit eine Toleranz des angeborenen Immunsystems zur Folge hatte. Ifrim et al. verwendeten darüber hinaus niedrigere Konzentrationen zur Konditionierung und erzielten durch Konditionierung mit 0,00001-10 pg LPS/ml ein Training des angeborenen Immunsystems (IFRIM et al. 2014). Ob auch im bovinen System durch sehr geringe Dosen LPS ein Training ausgelöst wird, wurde in dieser Arbeit nicht untersucht.
Eine Toleranz konnte anhand der hier erarbeiteten Daten nicht beobachtet werden, wenn Monozyten durch positive magnetische Zell-Sortierung selektiert wurden. Dies war unabhängig davon, ob dabei alle Monozyten-Subpopulationen (Abbildung 29, Abbildung 30) oder nur klassische und intermediäre bovine Monozyten isoliert wurden (Abbildung 25, Abbildung 26).
Dies steht im Gegensatz zu Veröffentlichungen, in denen humane Monozyten als CD3–, CD19– und CD56–-Zellen selektiert und einer erfolgreichen Toleranzinduktion durch LPS-Konditionierung unterzogen wurden (NOVAKOVIC et al. 2016). Die hier anhand der
Fluoreszenzintensität nach Immunfluoreszenz gewonnenen Daten zum intrazellulären TNF--Gehalt sind leider wenig belastbar, da sie sich von den Kontrollansätzen (Isotypkontrolle) wenig unterscheiden. Der hier verwendete anti-bovine anti-TNF--Antikörper wurde bislang nicht für intrazelluläre Immunfluoreszenz, jedoch als Primärantikörper in einem ELISA zum Nachweis der TNF--Sekretion boviner Makrophagen verwendet. Dass mittels dieses Antikörpers kein deutlicher intrazellulärer TNF--Nachweis gelang, könnte demnach methodisch bedingt sein.
Um die Sekretion dieses Zytokins zu hemmen und es auf diese Weise einem intrazellulären Nachweis zugänglich zu machen, wurde Brefeldin A eingesetzt, wobei die hier verwendete Konzentration die TNF--Produktion in Ratten-Zellen nicht beeinträchtigte (BAUMGARTNER et al. 1994). Brefeldin A wurde hier zeitgleich mit dem LPS zu den Zellen gegeben, während andere Protokolle die Zugabe von Brefeldin A vor und nach einer Stimulation vorsehen (BAUMGARTNER et al. 1994; SCHUERWEGH et al. 2001). Da Brefeldin A unselektiv die Sekretion von Zytokinen hemmt, werden dadurch möglicherweise autokrine und parakrine Wirkungen der LPS-Stimulation gehemmt. Dies wurde hier nicht geprüft, könnte aber ein Grund für die beobachtete geringe intrazelluläre TNF--Menge sein. Für murine Makrophagen wurde gezeigt, dass LPS-induziertes TNF- in auto- und parakriner Art die NO-Synthase-Produktion bewirkt, während die TNF--Sekretion unabhängig von einer autokrinen TNF--Wirkung war (CLEMONS-MILLER et al. 2000). Ein weiterer Einflussfaktor in diesem Zusammenhang ist die vorherige Markierung der Monozyten-Subpopulationen mit dem Farbstoff CellTraceTM FarRed.
Eine Funktionseinschränkung von Immunzellen durch einen ähnlichen Farbstoff ist bei equinen Lymphozyten beschrieben, welche nach Färbung mit CellTraceTM Violet und Stimulation mit Concanavalin A ihre Proliferationsfähigkeit verloren (K et al. 2020). Im Gegensatz dazu zeigten bovine Lymphozyten nach Färbung mit CellTraceTM FarRed in zwei unterschiedlichen Konzentrationen eine Proliferationskapazität (Abbildung 45, A) und keine Abweichungen ihrer Morphologie, die auf eine verminderte Proliferationskompetenz schließen lassen würden (Abbildung 45, C, D). Jedoch konnte in der Darstellung des CellTraceTM FarRed-Histogrammes nur ein Fluoreszenzpeak niedrigerer Intensität (als Zeichen für erfolgte Zellteilung) charakterisiert werden (Abbildung 45, B), wogegen eine asynchrone Zellteilung zu mehreren Fluoreszenzpeaks führen sollte. Tempany et al. machten an murinen Lymphozyten eine ähnliche Beobachtung und konnten dies letztendlich darauf zurückführen, dass die Lymphozyten den Farbstoff in unterschieden Mengen aufgenommen hatten. Wurden Lymphozyten auf eine geringe Variation
ihrer Fluoreszenzintensität selektiert, waren nach 2 und nach 3 Tagen einzelne Teilungswellen eindeutig zu identifizieren (TEMPANY et al. 2018). Insgesamt lässt sich festhalten, dass die Färbung mit CellTraceTM FarRed nicht zu einer Funktionseinschränkung boviner Lymphozyten führt.
Die Methodik des intrazellulären Nachweises von TNF- in bovinen Makrophagen sollte in weiteren Arbeiten abgesichert werden. An dieser Stelle gibt sie lediglich einen Hinweis darauf, dass die verminderte TNF--Sekretion im Rahmen der Toleranz auf Makrophagen beruht, welche aus klassischen und intermediären Monozyten ausdifferenzierten.
In Anbetracht der gescheiterten Toleranzinduktion bei Einsaat reiner Monozyten kann davon ausgegangen werden, dass während der Induktion von Toleranz das Sekretom von oder der Kontakt zu lymphoiden Zellen benötigt wird, ähnlich wie es für die Induktion von Training in murinen Alveolar-Makrophagen beschrieben ist (YAO et al. 2018). Ein Einfluss von lymphoiden Zellen zum Zeitpunkt der Stimulation erscheint unwahrscheinlich, da diese an Tag 5 nur in sehr geringer Anzahl nachgewiesen werden konnten (Daten nicht gezeigt). Aus diesem Grund wurde der Anteil lymphoider Zellen an Tag 0 als Annäherung an die Situation während der Konditionierung an Tag 1 betrachtet. Dabei zeigte sich eine signifikante Korrelation zwischen dem Gedächtniseffekt und dem Anteil CD2+-lymphoider Zellen (Tabelle 6). Aufgrund fehlender Signifikanz der Korrelation zwischen dem Gedächtniseffekt und den CD2+CD4+- oder CD2+CD8+-lymphoiden Zellen scheint eine Toleranz-Induktion jedoch nicht von T-Helfer-Zellen oder zytotoxischen T-Lymphozyten abzuhängen. Deswegen sollten andere CD2-exprimierende Zellen wie NK-Zellen und -T-Zellen auf ihren Beitrag zur Induktion einer Toleranz des angeborenen Immunsystems hin untersucht werden.
In Hinblick auf das Vorkommen der untersuchten Oberflächenmoleküle konnte nur für MHC-II eine Regulation durch die LPS-Konditionierung beobachtet werden. Dieses Molekül wurde in toleranten, Mca-polarisierten Makrophagen vermindert exprimiert, wobei diese Beobachtung nur für nicht-stimulierte Ansätze gilt (Abbildung 13, A). Bei Stimulation der konditionierten Makrophagen wird die MHC-II-Expression weiter gesenkt, wodurch möglicherweise ein Einfluss der Konditionierung überdeckt wird. Die verminderte Expression von MHC-II-Molekülen steht in Übereinstimmung mit Daten von humanen Plastik-adhärenten Monozyten, welche nach Konditionierung weniger MHC-II exprimierten. Im Gegensatz zu den hier erhobenen Daten
wurden diese Zellen jedoch unabhängig von Mca-polarisierenden Faktoren kultiviert (DEL FRESNO et al. 2009). Eine verminderte Expression von MHC-II-Molekülen führt zu einer Beeinträchtigung der Antigen-Präsentation und darüber zu einer verminderten Proliferation Antigen-spezifischer T-Zellen sowie zu einer verminderten IFN--Sekretion humaner peripherer mononukleärer Zellen (BARRIONUEVO et al. 2008). Als mögliche Auslöser für das geringere Vorkommen von MHC-II-Molekülen auf der Oberfläche der Makrophagen wurden sowohl IL-6 als auch IL-10 identifiziert, wobei IL-6 über TLR 2-Aktivierung durch ein Lipoprotein von Brucella abortus induziert wurde (BARRIONUEVO et al. 2008; THIBODEAU et al. 2008). In Hinblick auf die Polarisierung der entstehenden Makrophagen wurden diese zwar unter Bedingungen kultiviert, welche zu klassisch-aktivierten Makrophagen führen sollten, das verringerte Vorkommen von MHC-II-Molekülen auf den gewonnenen Makrophagen lässt jedoch nicht auf das Vorhandensein von klassisch-aktivierten Makrophagen schließen. Für die Entwicklung in Richtung wund-heilender Makrophagen sprechen Daten von Mia et al., die Monozyten in verschiedene Richtungen polarisierten. Dabei wurde eine verringerte Expression von MHC-II-Molekülen beobachtet, wenn die Zellen ohne Zytokine, mit IL-4 und IL-13, IL-4 und IL-10 oder IL-4, IL-10 und TGF kultiviert wurden. Eine erhöhte Expression von CD206 konnte an diesen humanen Makrophagen bei jenen Ansätzen gemessen werden, welche unter dem Einfluss von IL-10 polarisiert wurden, also regulativen Makrophagen entsprechen. Eine geringe Expression von CD206 wie in den hier vorliegenden Daten wurde in jenen Versuchen bei unstimulierten, klassisch-aktivierten und wund-heilenden Makrophagen erkannt (MIA et al.
2014). Für bovine wund-heilende Makrophagen, polarisiert unter dem Einfluss von IL-4, IL-13 und M-CSF, ist jedoch eine erhöhte Expression von CD206 kürzlich in unserer Arbeitsgruppe beschrieben worden (FERNANDES WERNER 2019). Der hier beschriebene Phänotyp toleranter Makrophagen ist daher nicht klar in eine Kategorie aktivierter Makrophagen einzuordnen. Eindeutig ist, dass die Toleranz zu einem weniger klaren Phänotyp klassisch-aktivierter Makrophagen führt. Ob dieser eher wund-heilenden oder regulatorischen Makrophagen entspricht, sollte in Zukunft näher untersucht werden.