4.8 Induktion von Gedächtnis in FR-markierten Monozyten
4.8.1 Toleranz durch LPS-Konditionierung in FR-markierten Monozyten
Hierfür wurden klassische und intermediäre Monozyten separiert und mit CellTrace FarRed (FR) markiert. Anschließend wurden diese FR+-, klassischen und intermediären Monozyten mit FR–-, CD14–-mononukleären Zellen, die auch nicht-klassische Monozyten enthielten, im Verhältnis 1:4 gemischt. Von diesen gemischten Zellen wurden 2*106 eingesät. An Tag 1 wurden die adhärenten Zellen mit LPS oder G konditioniert und an Tag 4 mit LPS und Brefeldin A stimuliert. An Tag 5 wurden die Zellen abgelöst und der TNF--Gehalt der Zellen nach einer ICS (3.5) durchflusszytometrisch (3.2) bestimmt.
Die Konditionierung mit LPS führte zu einem geringgradig signifikant höheren TNF--Gehalt in Makrophagen, welche sich aus klassischen und intermediären Monozyten entwickelten (Abbildung 41, D). Dieser Effekt konnte nicht beobachtet werden, wenn diese Zellen stimuliert wurden und es war auch kein Einfluss der Konditionierung auf den TNF--Gehalt von Makrophagen aus nicht-klassischen Monozyten ersichtlich. Ein erhöhter TNF--Gehalt aufgrund der Stimulation konnte in keiner der beiden Gruppen gesehen werden. Der TNF--Gehalt der Makrophagen, die sich aus nicht-klassischen Monozyten entwickelten, lag auf einem geringeren Niveau als der TNF--Gehalt der Makrophagen, welche sich aus klassischen und intermediären Monozyten entwickelten. Die Fluoreszenz der Isotypkontrolle lag auf dem gleichen Niveau wie die unkonditionierten Kontrollansätze (Abbildung 41, B-D).
Abbildung 41: TNF--Gehalt der Makrophagen aus cM und intM oder aus ncM abhängig von der Konditionierung mit LPS.
Bovine, FR-gefärbte klassische und intermediäre Monozyten wurden gemeinsam mit ungefärbten nicht-klassischen Monozyten und lymphoiden Zellen in einer Gesamtzellzahl von 2*106 Zellen eingesät. An Tag 1 wurden nicht-adhärente Zellen entfernt und die verbliebenen Zellen mit 100 ng LPS konditioniert. An Tag 2 wurde der Überstand restlos entfernt und die Zellen an Tag 4 mit 5 µg Brefeldin A und 1 µg LPS stimuliert. An Tag 5 erfolgte durchflusszytometrisch eine ICS zur Bestimmung des TNF--Gehaltes adhärenter Makrophagen. Hier dargestellt ist ein exemplarisches durchflusszytometrisches Bild der FR-Fluoreszenz-Verteilung (A) sowie der Verteilung der FL1-Fluoreszenz der LPS-stimulierten Ansätze von FR–-(B, n = 1)und FR+ -Makrophagen (C, n = 1), welche mit dem Isotyp-Kontroll- (schwarz) oder dem TNF--Antikörper (HEYL et al.) markiert wurden. Zudem ist die mittlere FL1-Fluoreszenz der FR–- (D) und FR+-Makrophagen (E) abgebildet (n = 6, Einzelwerte und Median, Daten von gleichen Individuen verbunden). Als Kontrollen dienten Ansätze, die weder konditioniert noch mit LPS stimuliert, nicht konditioniert, aber mit LPS stimuliert oder konditioniert, aber nicht mit LPS stimuliert wurden, während allen Ansätzen Brefeldin A zugegeben wurde. Für die Isotypkontrolle wurden unkonditionierte, stimulierte oder unstimulierte Ansätze verwendet. Unterschiede zwischen konditionierten und nicht-konditionierten Ansätzen wurden mittels eines Friedman-Tests, Unterschiede zwischen stimulierten und nicht-stimulierten Ansäten mittels eines Vorzeichen-Rang-Tests auf Signifikanz geprüft (* = 0,05 ≥ p > 0,01; ** = 0,01 ≥ p > 0,001;
ncM = nicht-klassischen Monozyten, LPS = Lipopolysaccharid, G = -Glucan, ICS = intrazelluläre Färbung, FR = CellTrace FarRed, Mean-FL1 = mittlere gemessene Fluoreszenz des Fluoreszenzkanals 1, TNF- = Tumornekrosefaktor-.
Da ein Nachweis von Toleranz anhand von TNF- nur bei Mca-polarisierten Makrophagen möglich war, sollte im Folgenden geprüft werden, inwiefern der TNF--Gehalt von Mca-polarisierten Makrophagen ko-kultivierter Monozyten durch die Konditionierung beeinflusst wird. Hierfür wurden bovine CD14+-Monozyten mittels MACS isoliert und mit FR gefärbt.
Anschließend wurden die FR+CD14+-Monozyten mit den ungefärbten CD14–-mononukleären Zellen gemischt, unter dem täglichen Einfluss von boGM-CSF und boIFN- kultiviert und an Tag 1 die adhärenten Zellen mit LPS konditioniert. An Tag 4 wurden die Zellen mit LPS stimuliert, bevor sie an Tag 5 abgelöst und mittels ICS (3.5) der TNF--Gehalt ermittelt wurde.
Makrophagen, welche sich aus klassischen und intermediären Monozyten entwickelten, enthielten geringgradig signifikant weniger TNF- nach Stimulation, wenn sie mit LPS konditioniert wurden (p = 0,015; Abbildung 42, A). Die Stimulation hatte keinen signifikanten Einfluss auf den TNF--Gehalt dieser Zellen. Dagegen konnte ein geringgradig signifikanter Einfluss der Stimulation auf den TNF--Gehalt jener unkonditionierter Makrophagen beobachtet werden, welche sich aus nicht-klassischen Monozyten entwickelt hatten (p = 0,0469; Abbildung 42, B).
Abbildung 42: TNF--Gehalt der Mca-Makrophagen aus cM und intM oder aus ncM abhängig von der Konditionierung.
Bovine, FR-gefärbte klassische und intermediäre Monozyten wurden gemeinsam mit ungefärbten nicht-klassischen Monozyten und lymphoiden Zellen in einer Gesamtzellzahl von 2*106 Zellen
Konditionierung — LPS — LPS
eingesät. Die Kultivierung erfolgte unter dem Einfluss von boGM-CSF und boIFN-. An Tag 1 wurden nicht-adhärente Zellen entfernt und die verbliebenen Zellen mit 100 ng LPS konditioniert. An Tag 2 wurde der Überstand restlos entfernt und die Zellen an Tag 4 mit 5 µg Brefeldin A und 1 µg LPS stimuliert. An Tag 5 erfolgte durchflusszytometrisch die Bestimmung des TNF--Gehaltes adhärenter Makrophagen (n = 7, Einzelwerte und Median, Daten von gleichen Individuen verbunden). Als Kontrollen dienten Ansätze, die nicht konditioniert, aber mit LPS stimuliert, weder konditioniert noch mit LPS stimuliert oder konditioniert, aber nicht mit LPS stimuliert wurden, während allen Ansätzen Brefeldin A zugegeben wurde. Unterschiede zwischen konditionierten und nicht-konditionierten Ansätzen wurden mittels eines Friedman- und eines konsekutiven Permutationstest, Unterschiede zwischen stimulierten und nicht-stimulierten Ansätzen mittels eines Vorzeichen-Rang-Tests auf Signifikanz geprüft (* = 0,05 ≥ p > 0,01; ** = 0,01 ≥ p > 0,001; *** = p ≤ 0,001). Mca = klassisch-aktivierte Makrophagen, boGM-CSF = boviner, rekombinanter Granulozyten-Makrophagen Kolonie-stimulierender Faktor, boIFN- = bovines, rekombinantes Interferon-, LPS = Lipopolysaccharid, TNF- = Tumornekrosefaktor-Mean-FL1 = mittlere gemessene Fluoreszenz des Fluoreszenzkanals 1.