Induktion von Training in FR-markierten Monozyten

Um den Beitrag nicht-klassischer Monozyten auf die Induktion von Training genauer zu untersuchen, wurden klassische und intermediäre Monozyten mit CellTrace^TM FarRed (FR) gefärbt und mit ungefärbten nicht-klassischen Monozyten und lymphoiden Zellen vermischt. In diesen Zellen sollte Training induziert werden, in dem Plastik-adhärente Zellen an Tag 1 mit G konditioniert und an Tag 4 mit LPS stimuliert wurden. An Tag 5 wurde der TNF--Gehalt der Makrophagen nach einer ICS (3.5) durchflusszytometrisch (3.2) erfasst.

Nach Konditionierung mit G enthielten Makrophagen aus klassischen und intermediären Monozyten geringgradig signifikant mehr TNF- als unkonditionierte Makrophagen (Abbildung 43, A). Nach Konditionierung und Stimulation konnte kein Einfluss der Konditionierung mehr festgestellt werden, ebenso wie die Konditionierung keinen Einfluss auf den TNF--Gehalt von Makrophagen aus nicht-klassischen Monozyten hatte (Abbildung 43, B). Die Stimulation führte in keinem Fall zu einem signifikant höheren TNF--Gehalt. Die Isotypkontrolle lag auf dem gleichen Niveau wie die unkonditionierten Kontrollansätze.

Abbildung 43: TNF--Gehalt von Makrophagen aus cM und intM oder aus ncM in Abhängigkeit von der Konditionierung mit G.

Bovine, FR-gefärbte klassische und intermediäre Monozyten wurden gemeinsam mit ungefärbten nicht-klassischen Monozyten und lymphoiden Zellen in einer Gesamtzellzahl von 2*10⁶ Zellen eingesät. An Tag 1 wurden nicht-adhärente Zellen entfernt und die verbliebenen Zellen mit 10 µg

G konditioniert. An Tag 2 wurde der Überstand restlos entfernt und die Zellen an Tag 4 mit 5 µg Brefeldin A und 1 µg LPS stimuliert. An Tag 5 erfolgte durchflusszytometrisch die Bestimmung des Gehaltes adhärenter Makrophagen. Hier dargestellt ist der TNF--Gehalt FR⁺- (A) und FR^–-Makrophagen (B) (n = 6, Einzelwerte und Median, Daten von gleichen Individuen verbunden). Als Kontrollen dienten Ansätze, die nicht konditioniert, aber mit LPS stimuliert, weder konditioniert noch mit LPS stimuliert oder konditioniert, aber nicht mit LPS stimuliert wurden, während allen Ansätzen Brefeldin A zugegeben wurde. Für die Isotypkontrolle wurden unkonditionierte, mit oder ohne LPS stimulierte Ansätze verwendet. Unterschiede zwischen konditionierten und nicht-konditionierten Ansätzen wurden mittels eines Friedman-Test, Unterschiede zwischen stimulierten und nicht-stimulierten Ansäten mittels eines Vorzeichen-Rang-Tests auf Signifikanz geprüft (* = 0,05 ≥ p > 0,01; ** = 0,01 ≥ p > 0,001;

*** = p ≤ 0,001). cM = klassische Monozyten, intM = intermediäre Monozyten, ncM = nicht-klassische Monozyten, LPS = Lipopolysaccharid, G = -Glucan, Mean-FL1 = mittlere gemessene Fluoreszenz des Fluoreszenzkanals 1, TNF- = Tumornekrosefaktor-.

Da ein deutlicheres Training durch G in M_ca-polarisierten Makrophagen nachgewiesen werden konnte, wurde im Weiteren geprüft, inwiefern M_ca-polarisierte Makrophagen aus klassischen und intermediären oder nicht-klassischen Monozyten ein Training erkennen lassen. Hierfür wurden klassische und intermediäre Monozyten mittels Selektion CD14-positiver Zellen separiert (3.1.3), mit FR gefärbt und mit ungefärbten, nicht-klassischen Monozyten und lymphoiden Zellen gemischt. Diese Zellen wurden unter dem Einfluss von boGM-CSF und boIFN- kultiviert und an Tag 1 die Plastik-adhärenten Zellen mit G konditioniert. Nach der LPS-Stimulation an Tag 4, wurde an Tag 5 der TNF--Gehalt der Makrophagen mittels ICS (3.5) ermittelt.

Konditionierung

Die Konditionierung mit G hatte keinen signifikanten Einfluss auf den TNF--Gehalt der Makrophagen, unabhängig davon, ob diese sich auch klassischen und intermediären oder aus nicht-klassischen Monozyten entwickelt hatten. Stimulierte Makrophagen aus klassischen und intermediären Monozyten enthielten allerdings tendenziell mehr TNF-, wenn sie mit G konditioniert wurden (p = 0,097). Ein geringgradig signifikant erhöhter TNF--Gehalt in Reaktion auf die Stimulation konnte in Makrophagen aus klassischen und intermediären Monozyten in G-konditionierten Ansätzen beobachtet werden (p = 0,0313; Abbildung 44, A).

Invers verhielt sich der TNF--Gehalt von Makrophagen aus nicht-klassischen Monozyten, der nur bei unkonditionierten Zellen nach Stimulation geringgradig signifikant erhöht war (p = 0,0469; Abbildung 44, B).

Abbildung 44: TNF--Gehalt von Mca-Makrophagen aus cM und intM oder aus ncM in Abhängigkeit von der G-Konditionierung.

Bovine, FR-gefärbte klassische und intermediäre Monozyten wurden gemeinsam mit ungefärbten nicht-klassischen Monozyten und lymphoiden Zellen in einer Gesamtzellzahl von 2*10⁶ Zellen eingesät. Die Kultivierung erfolgte unter dem Einfluss von boGM-CSF und boIFN-. An Tag 1 wurden nicht-adhärente Zellen entfernt und die verbliebenen Zellen mit 10 µg G konditioniert.

An Tag 2 wurde der Überstand restlos entfernt und die Zellen an Tag 4 mit 5 µg Brefeldin A und 1 µg LPS stimuliert. An Tag 5 erfolgte durchflusszytometrisch die Bestimmung des TNF--Gehaltes adhärenter Makrophagen (n = 7, Einzelwerte und Median, Daten von gleichen Individuen verbunden). Als Kontrollen dienten Ansätze, die nicht konditioniert, aber mit LPS stimuliert, weder konditioniert noch mit LPS stimuliert oder konditioniert, aber nicht mit LPS stimuliert wurden, während allen Ansätzen Brefeldin A zugegeben wurde. Unterschiede zwischen konditionierten und nicht-konditionierten Ansätzen wurden mittels eines Friedman- und eines konsekutiven Permutationstest, Unterschiede zwischen stimulierten und nicht-stimulierten Ansäten mittels eines Vorzeichen-Rang-Tests auf Signifikanz geprüft (* = 0,05 ≥ p > 0,01;

** = 0,01 ≥ p > 0,001; *** = p ≤ 0,001). M_ca = klassisch-aktivierte Makrophagen, boGM-CSF = boviner, rekombinanter Granulozyten-Makrophagen Kolonie-stimulierender

Konditionierung — G — G

Faktor, boIFN- = bovines, rekombinantes Interferon-, LPS = Lipopolysaccharid, TNF- = Tumornekrosefaktor- Mean-FL1 = mittlere gemessene Fluoreszenz des Fluoreszenzkanals 1.

5 D ISKUSSION

Das Gedächtnis ist eine Eigenschaft, die dem angeborenen Immunsystem erst in der jüngeren Vergangenheit zugeschrieben wird. Die Beschreibung desselben fokussiert sich bislang auf humane und murine angeborene Immunzellen und auf einzelne Erreger, PAMPs oder DAMPs zur Induktion dieses Gedächtnisses. An bovinen Versuchstieren oder Zellen wurde ein Gedächtnis im Sinne eines Trainings des angeborenen Immunsystems bislang nur zweimal beschrieben (JUSTE et al. 2016; GUERRA-MAUPOME et al. 2019). In beiden Fällen wurde ein Gedächtnis durch die BCG-Vakzine induziert, welche aus modifizierten Mycobacterium bovis-Bakterien besteht. Dieser Induktor ist auch bei humanen Zellen beschrieben (HIGGINS et al. 2016; ROB J. W. ARTS et al. 2018; NAMAKULA et al. 2020), eignet sich in Deutschland aufgrund des Verbotes der Impfung gegen bovine Tuberkulose allerdings nicht für die praktische Anwendung in Rinderbeständen (TUBERKULOSE-VERORDNUNG). Die Toleranz des angeborenen Immunsystems wurde bereits in verschiedenen bovinen Zellpopulationen nachgewiesen (HILL et al. 1976; GÜNTHER et al. 2017), wobei die dort angewandten Protokolle, meist aufgrund fehlender Rückkehr zu einem homöostatischen Zustand, nicht den Anforderungen für den Nachweis eines Gedächtnisses des angeborenen Immunsystems entsprechen. In der hier vorliegenden Arbeit wurde daher ein Protokoll für bovine, Plastik-adhärente Monozyten in Anlehnung an ein Protokoll für humane, Plastik-Plastik-adhärente Monozyten entwickelt (IFRIM et al. 2014; GUERRA-MAUPOME et al. 2019). Monozyten standen im Fokus dieser Arbeit, da sie in der Vielfalt der Immunzellen jene zentralen Zellen des angeborenen Immunsystems darstellen, welche im Kontext eines Gedächtnisses am besten untersucht sind.

Dabei wurde hier aufgrund funktioneller Aspekte beurteilt, ob in dem angewandten Protokoll Training und Toleranz in bovinen Monozyten nachgewiesen werden kann und konsekutiv untersucht, ob phänotypische Merkmale mit einem Gedächtnis des angeborenen Immunsystems einhergehen.

Wichtig ist in diesem Kontext die genaue Definition des Gedächtnisses des angeborenen Immunsystems. Pradeu et al. bezeichnen das Gedächtnis des angeborenen Immunsystems als Gedächtnis auf Grundlage epigenetischer Veränderungen (PRADEU u. DU PASQUIER 2018).

Wenn nach einer Konditionierung in veränderter Weise auf eine Stimulation reagiert wird, beschreibt Pradeu dies als Spätfolge der Konditionierung, die einen andauernden, veränderten Zustand von Zellen ausgelöst hat. Dagegen stellen Hamon und Quintin für das Gedächtnis des

angeborenen Immunsystems die Vorbedingung auf, dass keine Reaktion mehr auf die Konditionierung vorliegt (HAMON u. QUINTIN 2016).

In dieser Arbeit wurde zuerst untersucht, ob bovine mononukleäre Zellen oder Monozyten auf die Konditionierung reagieren. Zu einem späteren Zeitpunkt wurde sowohl untersucht, wie konditionierte Makrophagen auf eine Stimulation reagieren als auch, ob zum gleichen Zeitpunkt in unstimulierten Ansätzen noch eine Reaktion auf die Konditionierung nachweisbar ist.