Charakterisierung
boviner Monozyten-Subpopulationen und deren In-vitro-Differenzierung
in Makrophagen
INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von Constanze Frank
aus Murrhardt
Hannover 2012
Wissenschaftliche Betreuung: Apl. Prof. Dr. med. vet. H.-J. Schuberth Arbeitsgruppe Immunologie
Univ.-Prof. Dr. med. vet. C. Pfarrer Anatomisches Institut
1. Gutachter: Apl. Prof. Dr. med. vet. H.-J. Schuberth 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. med. vet. M. Hoedemaker
Tag der mündlichen Prüfung: 18. 05. 2012
Gefördert durch die Firma Pfizer Animal Health durch Personal- und Sachmittel
Wir meinen, die Natur zu beherrschen, aber wahrscheinlich hat sie sich nur an uns gewöhnt.
Karl-Heinrich Waggerl
Meiner Familie in Liebe gewidmet.
Und Mike, dem wundervollsten Menschen, den ich kenne.
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung und Zielsetzung ... 9
2 Literaturübersicht ... 11
2.1 Bau der bovinen Zitze (Papilla mammae) ... 11
2.2 Immunzellen in der Zitze des Rindes ... 11
2.3 Expression immunrelevanter Gene in der bovinen Milchdrüse ... 12
2.4 Monozyten und deren Subpopulationen ... 13
2.4.1 Monozyten ... 13
2.4.2 Monozyten-Subpopulationen ... 14
2.5 Makrophagen und deren Rolle im Entzündungsgeschehen ... 15
2.5.1 Makrophagen ... 15
2.5.2 Die Bedeutung von Monozyten und Makrophagen im Entzündungsgeschehen 16 2.6 Makrophagenplastizität ... 18
2.6.1 Klassisch aktivierte Makrophagen ... 19
2.6.2 Makrophagen der Wundheilung ... 20
2.6.3 Regulatorische Makrophagen ... 20
2.6.4 Bedeutung der Makrophagenplastizität für verschiedene Erkrankungen ... 21
2.6.5 Makrophagenplastizität beim Rind ... 22
2.7 Leukozyten- und Makrophagen-spezifische Antikörper ... 22
2.7.1 CD68 ... 22
2.7.2 Antikörper PM-2K ... 23
2.7.3 Antikörper AM-3K ... 23
2.7.4 Antikörper MAC387 ... 23
2.7.5 MHC-Klasse-II-Moleküle ... 24
2.7.6 CD45 ... 24
2.8 Chemokine und Chemokinrezeptoren von Monozyten ... 25
2.8.1 CCL2 ... 26
2.8.2 CCL4 ... 27
2.8.3 CCL5 ... 27
3 Methoden ... 29
3.2 Generierung von Makrophagen aus Blutmonozyten in vitro ... 30
3.3 Durchflusszytometrie ... 31
3.4 Intrazelluläre Calciummessung monozytärer Subpopulationen ... 31
3.5 Durchflusszytometrische phänotypische Charakterisierung boviner Monozyten und Makrophagen nach Membran- und intrazellulärer Immunfluoreszenz ... 34
3.6 Darstellung der Kernmorphologie von Monozyten ... 35
3.7 Probennahme, Fixierung und Einbettung von Gewebeproben ... 35
3.7.1 Probennahme ... 35
3.7.2 Fixierung und Zuschneiden der Zitzen ... 36
3.7.3 Einbettung in Paraffin ... 36
3.8 Immunhistologische Nachweise ... 37
3.9 Immunfluoreszenz an Zitzenschnitten ... 39
3.10 Molekularbiologische Verfahren ... 41
3.10.1 Aufbereitung von RNA aus bovinem Zitzengewebe für die real time PCR ... 41
3.10.2 Aufbereitung von mRNA aus bovinen Makrophagen für die real time PCR .... 42
3.10.3 Qualitative und quantitative Analyse der RNA mit dem Experion Automated Electrophoresis System ... 42
3.10.4 Synthese von cDNA durch Reverse Transkription ... 43
3.10.5 Quantitative Real-Time PCR (qrtPCR) ... 44
3.11 Statistische Auswertung ... 47
4 Ergebnisse ... 49
4.1 Immunhistologischer Nachweis von Leukozyten und Makrophagen in der Zitze .... 49
4.1.1 AM-3K ... 49
4.1.2 MAC387 ... 50
4.1.3 MHC-Klasse-II ... 55
4.2 Genexpression ausgewählter Chemokine/Proteine in bovinem Zitzengewebe ... 57
4.2.1 Korrelation zwischen UXT und RPS9 ... 57
4.2.2 S100A8 und S100A9 ... 58
4.2.3 CD163 ... 59
4.2.4 CXCL1 ... 60
4.2.5 CXCL8 ... 61
4.2.6 CCL3 und CCL5 ... 62
4.3 Analyse monozytärer Subpopulationen in bovinen MNC ... 63
4.4 Auswertung der Zellaktivierung (intrazelluläre Calciummessung) ... 65
4.4.1 Etablierung der intrazellulären Calciummessung in bovinen Monozyten ... 65
4.4.2 Effekte von CCL2 und CCL5 auf die Aktivierung boviner Monozyten ... 68
4.4.3 CCL2- und CCL5-vermittelte Aktivierung boviner Monozyten-Subpopulationen ... 69
4.5 Einfluss von CCL2 und CCL5 auf die Monozyten/Makrophagen-Differenzierung in vitro ... 72
4.5.1 CCL2- und CCL5-vermittelte Änderung des Phänotyps in-vitro-differenzierter boviner MdM ... 72
4.5.2 Effekte der Differenzierung boviner MdM unter CCL2 und CCL5 auf die Expression ausgewählter Gene ... 76
5 Diskussion ... 78
5.1 Immunhistologischer Nachweis verschiedener Makrophagensubtypen in bovinem Zitzengewebe ... 78
5.2 Expression ausgewählter Chemokine und Proteine in bovinem Zitzengewebe ... 83
5.3 Aktivierung boviner Monozyten durch CCL2 und CCL5 ... 87
5.4 Bovine Monozyten-Subpopulationen und deren Chemokin-vermittelte Aktivierung .. ... 88
5.5 Chemokin-vermittelte Effekte auf die In-vitro-Differenzierung boviner Monozyten... ... 91
6 Zusammenfassung ... 97
7 Summary ... 99
8 Literaturverzeichnis ... 101
9 Anhang ... 128
9.1 Geräte ... 128
9.2 Material ... 130
9.2.1 Klinikbedarf ... 130
9.2.2 Laborbedarf ... 130
9.2.3 Reagenzien ... 131
9.2.4 Kulturmedien, Puffer und Lösungen ... 134
9.2.5 Monoklonale Antikörper ... 136
9.4 Tabellenverzeichnis ... 138 9.5 Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen ... 139
1 Einleitung und Zielsetzung
Die bovine Mastitis stellt weltweit eine der häufigsten und kostenintensivsten Erkrankungen in der Milchviehhaltung dar (BRADLEY 2002; PETROVSKI et al. 2006). In der peripartalen Phase sind die Kühe deutlich anfälliger für intramammäre Infektionen (MCDOUGALL et al.
2007). Die Anfälligkeit der peripartalen Milchdrüse für Infektionen steigt mit Einsetzen der Milchbildung durch die beginnende Öffnung des Zitzenkanals (OLIVER u. SORDILLO 1988). Durch die hormonelle Lage während der Gravität befinden sich peripartale Kühe in einem immunmodulierten Zustand. Bedingt durch den peripartalen Anstieg von Stresshormonen wie Glucocorticoiden (SORDILLO u. STREICHER 2002b) werden Immunzellen in ihrer Anzahl und Funktion oft negativ beeinflusst; so ist z. B. der Neutrophileneinstrom in die Milchdrüse nach intramammärer Infektion mit Escherichia coli (E. coli) verzögert (MONFARDINI et al. 2002). Die Rekrutierung neutrophiler Granulozyten ins Gewebe ist jedoch von entscheidender Bedeutung für die schnelle Unschädlichmachung der Erreger und für die Resolution der Entzündung. Chemokine, die für diesen schnellen initialen Einstrom neutrophiler Granulozyten verantwortlich sind, werden von Monozyten und residenten Makrophagen sezerniert, so dass diese eine Schlüsselrolle in der Initialphase der Entzündung spielen (RAINARD u. RIOLLET 2006a). Nach der Elimination der Erreger muss die Entzündungsreaktion gestoppt werden, um exzessive Gewebeschäden zu verhindern und die Wundheilung einzuleiten. Hierbei spielen Makrophagen wiederum eine entscheidende Rolle, indem sie durch Freisetzung verschiedener Mediatoren entscheidend zur Wiederherstellung der Homöostase beitragen (RAINARD u. RIOLLET 2006a). Monozyten und Makrophagen nehmen also eine Schlüsselfunktion ein, indem anfangs pro- inflammatorische und später anti-inflammatorische Monozyten und Makrophagen für die Feinregulation des Entzündungsverlaufs verantwortlich sind. Störungen in diesem Ablauf können sowohl zu persistierenden Infektionen durch fehlende Erregereliminierung als auch zu überschießenden Entzündungsreaktionen führen. Monozyten differenzieren nach Einwanderung ins Gewebe in Makrophagen. Diese können, je nach Kontakt mit aktivierenden Signalen während der Differenzierung, unterschiedliche Funktionszustände besitzen und unterschiedlich auf Erreger und deren Bestandteile reagieren (MANTOVANI et al. 2004b).
Durch die Differenzierung in verschiedene Makrophagensubtypen können die Entzündungsreaktion und der weitere Verlauf der Entzündung mit beeinflusst werden. In der vorliegenden Arbeit sollten immunhistologische Untersuchungen von Zitzengewebeschnitten von multiparen Kühen in der peripartalen Phase klären, ob und welche Makrophagensubtypen in welcher Detaillokalisation vorliegen. Die Zitze wurde als Ort der primären Erreger- Wirtsinteraktion gewählt. Diese Zitzengewebeschnitte sollten mit solchen von multiparen mittlaktierenden Kühen verglichen werden, um Hinweise darauf zu erhalten, welchen Einfluss verschiedene Laktationsstadien auf die Verteilung dieser Zellen im Zitzengewebe haben.
Zusätzlich sollte das Genexpressionsprofil ausgewählter Chemokine und Mediatoren im Zitzengewebe dieser beiden Gruppen untersucht werden, um zu prüfen, ob sich
unterschiedliche Häufigkeiten von Makrophagensubtypen in einem veränderten Genexpressionsprofil wiederspiegeln.
Die Einwanderung von Monozyten in das Gewebe wird über Chemokine gesteuert. Da noch nichts über Monozyten-Subpopulationen beim Rind bekannt war, sollten diese im peripheren Blut näher charakterisiert und Unterschiede in der Chemokin-vermittelten Zellaktivierung dieser Monozyten-Subpopulationen erfasst werden.
Auf welche Weise verschiedene Makrophagensubtypen entstehen ist immer noch sehr strittig.
In-vitro-Differenzierungsstudien sollten den Einfluss ausgewählter Chemokine auf die gerichtete Differenzierung boviner Makrophagen untersuchen.
2 Literaturübersicht
2.1 Bau der bovinen Zitze (Papilla mammae)
Die Zitzen des Rindes oder Striche, Papillae mammae, stellen bei normaler Ausbildung 70 – 90 mm lange, zylindrisch-zapfenförmige Anhänge des Euters (Mamma, Glandula mammaria) mit abgerundeter Spitze dar. Als Zitzenbasis (Zitzenwurzel) wird der Bereich bezeichnet, der den weitesten Abschnitt der Zitzenzisterne enthält. Er befindet sich in der Regel am Übergang von der behaarten Euter- in die unbehaarte Zitzenhaut. Man unterscheidet weiterhin den weiten, langgestreckten Zitzenteil der Milchzisterne (Zitzenzisterne) und den nach außen führenden Zitzenkanal (Strichkanal, Ductus papillaris). Der Strichkanal hat im Mittel eine Länge von 8 – 11 mm (NICKEL et al. 2004). Im Bereich der Zitzenöffnung (Ostium papillare) schlägt von außen die Zitzenhaut in das Zitzenlumen um und bildet eine mehrschichtige verhornte Schleimhaut. Die Zitzenwand ist ein elastisch-bindegewebig- muskulöses Funktionsgewebe, das proximal weitlumige muskelstarke Venen aufweist. Die innere Auskleidung der Zitze besteht aus Schleimhaut, außen wird die Zitze von äußerer haarloser Haut bedeckt. Im Bereich der Zitzenzisterne ist die Zitze von einem zweischichtigen isoprismatischen Epithel ausgekleidet, das unmittelbar in das mehrschichtige verhornende Plattenepithel des Strichkanals wechselt. Kollagene und elastische Fasernetze und glatte Muskelzellen durchziehen die Zitzenwand. Von innen nach außen sind folgende Wandschichten angeordnet: zum Lumen des inneren Hohlraums sind glatte Muskelzellen zirkulär orientiert, in den mittleren Wandabschnitten verlaufen sie vorwiegend längs und strahlen radiär zur Oberfläche hin aus, gleichzeitig nimmt die Anzahl elastischer Fasern deutlich zu. Die Radiärfasern formieren eine 5- bis 8-fache Rosette, die sich distal in das Lumen des Zitzenkanals einfaltet. An dieser Stelle ist der Musculus sphincter papillaris als Verschlußeinrichtung der Zitze (Fürstenberg’sche Rosette) entwickelt (LIEBICH et al. 2003).
2.2 Immunzellen in der Zitze des Rindes
Neben dem Strichkanal und humoralen Abwehrmechanismen bilden Immunzellen in der bovinen Zitze eine weitere wichtige Schutzvorrichtung gegen galaktogen eindringende Keime. In Milch, Kolostrum und bovinem Milchdrüsengewebe werden hauptsächlich Makrophagen gefunden (JENSEN u. EBERHART 1981; MCDONALD u. ANDERSON 1981; SORDILLO et al. 1987). Obwohl eine direkte Rolle der Makrophagen in der Erregerabwehr angezweifelt wird, stellen sie Antigen-präsentierende Zellen dar, denen eine Bedeutung in der Erkennung eindringender Keime und in der Initiation der Entzündungsreaktion zugeschrieben wird, sodass Makrophagen in bovinem Milchdrüsengewebe vorrangig Effektorzellen der angeborenen Immunität darstellen (RAINARD u. RIOLLET 2006b). Während der peripartalen Phase sind die funktionellen Kapazitäten der Milchdrüsen-Makrophagen eingeschränkt, was mit einer erhöhten Mastitisinzidenz in dieser Periode in Verbindung gebracht wurde (WALLER 2000;
SORDILLO u. STREICHER 2002a). Die Bedeutung neutrophiler Granulozyten in der Milch für die Erregerabwehr ist unklar. Auf der einen Seite ist die Konzentration zu gering, um einen effektiven Schutz durch Phagozytose zu gewährleisten (LEIJH et al. 1979) und die Zellen sind teilweise nicht vital oder in einem nicht-aktivierten Zustand (VANGROENWEGHE et al. 2002; BURTON u. ERSKINE 2003). Auf der anderen Seite scheint das Vorhandensein neutrophiler Granulozyten in der Milch gesunder Milchdrüsen negativ mit der Anfälligkeit für intramammäre Infektionen zu korrelieren (BURTON u.
ERSKINE 2003). NK-Zellen in der Milch sind von entscheidender Bedeutung in der Bekämpfung intrazellulärer Pathogene, darüber hinaus töten sie Bakterien durch Sekretion bakterizider Proteine (RAINARD u. RIOLLET 2006b). Zusammenfasend betrachtet beherbergt gesundes Milchdrüsengewebe wenige Leukozyten; diese bestehen hauptsächlich aus T-Lymphozyten, CD4+ Zellen im interalveolaren Gewebe und CD8+ Zellen um die Aleolen (LEITNER et al. 2003). Darüber hinaus kommen Makrophagen, B-Zellen, NK-Zellen und dendritische Zellen vor. In der Zitzenzisterne sind hauptsächlich Lymphozyten und Monozyten/Makrophagen vertreten. In größerer Anzahl sind Leukozyten am distalen Ende der Zitzenzisterne am Übergang zum Strichkanal (Fürstenberg’sche Rosette) zu finden. Diese Zunahme an Leukozyten im Bereich der Fürstenberg’schen Rosette beruht hauptsächlich auf Plasmazellen, die den vorherrschenden Zelltyp im subepithelialen Bindegewebe darstellen (NICKERSON u. PANKEY 1983).
2.3 Expression immunrelevanter Gene in der bovinen Milchdrüse
Transkriptomanalysen sind ein wichtiges Instrument, um das Verständnis von Pathogen- Wirts-Interaktionen zu verbessern und das Wissen um die Wirtsabwehr gegen Mastitis zu vertiefen. In den letzten Jahren wurden zunehmend holistische Transkriptomanalysen in der bovinen Milchdrüse durchgeführt. MITTERHUEMER et al. (2010) untersuchten die Transkriptom-Antwort der bovinen Milchdrüse nach E.-coli-Inokulation und fanden nach 24 Stunden eine veränderte Genexpression sowohl in infizierten als auch in nicht infizierten Eutervierteln. Da sich der somatische Zellgehalt in den Kontrollvierteln nicht veränderte, konnte somit eine systemische Antwort der bovinen Milchdrüse bewiesen werden. Die Analyse der Chemokingenexpression zeigte überraschende Ergebnisse. So wurde eine erhöhte Genexpression von CC-Chemokinen (siehe 2.8) nur auf lokaler Ebene festgestellt, während viele CXC-Chemokine (siehe 2.8) systemisch reguliert wurden. Neben einer Hochregulation von lingualem antimikrobiellem Peptid (LAP), CXCL8, Toll-like Rezeptor 2 (TLR2) und TLR4 in infizierten Vierteln wurde das S100-Protein S100A12, dem ein direkter antimikrobieller Effekt gegen E. coli zugeschrieben wird (LUTZOW et al. 2008), 110-fach in infizierten und 4-fach in nicht infizierten Eutervierteln hochreguliert. In einer Studie über die Genexpression boviner Milchdrüsenepithelzellen nach Stimulation mit Lipopolysaccharid (LPS) (PAREEK et al. 2005) wurde eine Induktion von Interleukin-6 (IL-6) und auch von CCL5 und CXCL5 festgestellt. RINALDI et al. (2009) untersuchten mittels Microarray- Analyse und qrtPCR Änderungen in der Genexpression in verschiedenen Regionen der
Milchdrüse nach experimenteller E.-coli-Infektion. Die Rekrutierung neutrophiler Granulozyten, Sekretion pro-inflammatorischer Mediatoren und Aktivierung von Immunzellen wurden 12 und 24 Stunden nach Infektion reguliert. Nach 12 Stunden wurden verminderte Zellproliferation, Apoptose und anti-inflammatorische Immunantworten reguliert. Zellproliferation, Gewebeneubildung und anti-inflammatorische und hormonelle Signalkaskaden wurden nach 24 Stunden reguliert. Die Zitzenzisterne (ZZ) und die Drüsenzisterne (DZ) reagierten 12 Stunden nach Infektion am stärksten, während die lobulo- alveoläre Region (LA) nach 24 Stunden die deutlichste Antwort auf die Infektion mit E. coli zeigte. In der Fürstenberg’schen Rosette (FBR) wurden Gene der Wirtsabwehr gegen eindringende Keime aktiviert, so war z. B. die induzierbare Nitritoxidsynthase (NOS2) nach 12 Stunden hochreguliert. Die Erregererkennung ist ein essenzieller Schritt in der Initiierung einer effizienten Entzündungsreaktion in der Milchdrüse; diese wird über sogenannte Toll- like Rezeptoren (TLR) gesteuert. TLR2, der Rezeptor für Proteoglykan von S. aureus, und TLR4, der Lipopolysaccharid (LPS) von E. coli erkennt, wurden am stärksten in FBR, ZZ und DZ 12 Stunden nach Infektion hochreguliert. Das Chemokin CXCL8 (IL-8) vermittelt die Migration neutrophiler Granulozyten aus dem Blutstrom ins Gewebe. Die mRNA von CXCL8 und von einem IL-8-Rezeptor (IL8RA) war in der ZZ nach 12 Stunden hochreguliert, wohingegen die LA nach 24 Stunden die höchste mRNA-Konzentration enthielt. Die Chemokine CXCL1 und CXCL2 hatten nach 12 Stunden einen Peak in ZZ und DZ, ebenso die Zytokine IL-1β und IL-6. Tumor Nekrosefaktor-α (TNF-α) zeigte die stärkste Hochregulation nach 12 Stunden in FBR, ZZ und DZ. Gene, die für die Akute-Phase-Proteine Haptoglobin (HP), Lipopolysaccharid-bindendes Protein (LBP) und Serum-Amyloid A (SAA) kodieren, waren nur in der LA nach 24 Stunden signifikant hochreguliert. Weitere antimikrobielle Substanzen wurden schnell und stark zuerst in der ZZ und später in der LA hochreguliert. Die Gruppe um RINALDI (2009) konnte somit zeigen, dass Zitzengewebe zur schnellen und effektiven Reaktion gegen eindringende Keime beiträgt. Sie schlossen aus der schnellen Genregulation im Vergleich zum langsamen Anstieg des somatischen Zellgehalts mit einem Peak erst nach 24 Stunden, dass nicht nur einwandernden, sondern auch residenten Immunzellen eine wichtige Bedeutung in der Pathogenerkennung und Produktion pro- inflammatorischer Mediatoren zukommt.
2.4 Monozyten und deren Subpopulationen 2.4.1 Monozyten
Die Zellen des mononukleären Phagozytensystems (MPS; bestehend aus Monozyten und Gewebemakrophagen) differenzieren aus Stammzellen des Knochenmarks. Diese sogenannten Monoblasten entwickeln sich zu Promonozyten, welche zu Monozyten differenzieren. Dies geschieht unter dem Einfluss von colony-stimulating factors (CSF).
Monozyten gelangen schließlich in den Blutstrom, wo sie etwa drei Tage zirkulieren bevor sie
ins Gewebe auswandern und dort zu Makrophagen oder dendritischen Zellen differenzieren.
Der Anteil der Monozyten an der im Blut zirkulierenden Leukozyten-Gesamtpopulation beträgt etwa 5% (der Referenzbereich des Rindes beträgt 2 – 6%) (TIZARD 2004). Über die genaue Lebensdauer von Monozyten ist wenig bekannt, jedoch wird allgemein akzeptiert, dass Monozyten länger leben als neutrophile Granulozyten, die nach etwa 12 Stunden im Blutstrom ins Gewebe auswandern und dort nach wenigen Tagen absterben (DALE et al.
2008). Diese Eigenschaft ist von großer klinischer Bedeutung, da mononukleäre Phagozyten im Falle einer unterbrochenen Neutrophilenproduktion, wie sie etwa bei einer Chemotherapie, idiosynkratischer Medikamentenreaktion oder Stammzelltransplantation auftritt, Patienten vor letalen Infektionen schützen (DALE et al. 2008). Monozyten spielen eine wichtige Rolle als Effektorzellen, die Zelldebris und einwandernde Pathogene phagozytieren und auch als regulatorische Zellen durch ihre Fähigkeit Antigen zu präsentieren und die Immunantwort durch Zytokinproduktion zu modulieren. So exprimieren Monozyten den IgG-Rezeptor FcγRI (CD64) konstitutiv im Gegensatz zu neutrophilen Granulozyten, die diesen Rezeptor nur als Antwort auf pro-inflammatorische Stimuli exprimieren (STOSSEL u. BABIOR 2003).
Weiterhin sezernieren aktivierte Monozyten und Makrophagen Interleukin-1 (IL-1), IL-6, Tumor Nekrosefaktoren (TNF), Interferon-α (IFN-α) und IFN-β, die in der Regulation der Hämatopoese von Bedeutung sind (SIEFF et al. 1998). Monozyten spielen darüber hinaus eine entscheidende Rolle in der Immunmodulation durch Monozyten-aktivierende Chemokine; bspw. inhibieren CCL3, CCL4 und CCL5 durch Bindung an bestimmte Monozyten-Zelllinien eine Infektion mit humanem Immundefizienzvirus (HIV) (COCCHI et al. 1995).
2.4.2 Monozyten-Subpopulationen
Im humanen System werden periphere Monozyten des Blutes anhand ihrer CD14- und CD16- Expression in drei Subpopulationen eingeteilt: klassische (CD14++CD16-), intermediäre (CD14++CD16+) und nicht-klassische Monozyten (CD14+CD16++). Klassische Monozyten machen etwa 90% der zirkulierenden Monozytenfraktion aus.
Während in CD14++CD16- Monozyten Gene für antimikrobielle Funktionen hochreguliert sind, werden in CD16+ Monozyten Gene für die Fcγ-Rezeptor-vermittelte Phagozytose hochreguliert (ANCUTA et al. 2009; ZHAO et al. 2009). In einer Studie von MOBLEY et al.
(2007) wurde die Funktion von CD14++CD16- Monozyten anhand ihres Genexpressionsprofils primär in der Beseitigung apoptotischer neutrophiler Granulozyten am Ort einer Entzündung gesehen, während CD16+ Monozyten zahlreiche Gene exprimieren, die für antimikrobielle Proteine kodieren und daher eher der peripheren Wirtsabwehr dienen. Im Vergleich des Genexpressionsprofils der drei Subpopulationen zeigen CD14++CD16+ und CD14+CD16++ Monozyten die größte Übereinstimmung. Bei Betrachtung dieser beiden Subpopulationen haben CD14++CD16+ Monozyten jedoch eine signifikant höhere Expression von Genen, die für die Abwehr mikrobieller Pathogene eine wichtige Rolle
spielen (z. B. S100A8 und CD14), und solchen, die der Antigenprozessierung und – präsentation dienen. CD14+CD16++ Monozyten exprimieren Gene für MHC-Klasse-I- vermittelte Prozesse, die Migration, die transendotheliale Beweglichkeit und den Zellmetabolismus in höherem Maße (ZAWADA et al. 2011).
Neben Unterschieden in der Genexpression werden unter den Monozyten-Subpopulationen auch differenzielle Muster in der Expression von Zelloberflächenmolekülen beobachtet. So benutzen CD14++CD16- Monozyten P-Selektin-Glykoprotein-Ligand-1 (PSGL1), CC- Chemokin-Rezeptor 2 (CCR2) und CCR6 für die Migration aus dem Blut (SOEHNLEIN u.
LINDBOM 2010). Die Anheftung und die Migration CD14+CD16++ Monozyten ins Gewebe ist jedoch CX3CL1-vermittelt (ANCUTA et al. 2003). CD14++CD16+ Monozyten stellen zwar mit der Expression von CCR2 und CX3CR1 einen intermediären Phänotyp dar, sie können jedoch klar von CD14++CD16- und CD14+CD16++ Monozyten anhand ihrer selektiven Expression von CCR5 (ANCUTA et al. 2003; ROGACEV et al. 2011) und CD143 (ULRICH et al. 2006) abgegrenzt werden.
Bei Betrachtung der Funktion fallen ebenfalls Unterschiede zwischen den verschiedenen Monozyten-Subpopulationen auf; so produzieren CD14++CD16- Monozyten TNF-α und IL- 10, während CD16+ Monozyten zwar vergleichbare Mengen TNF-α, jedoch kaum IL-10 produzieren und somit von manchen Autoren als pro-inflammatorisch angesehen werden (ZIEGLER-HEITBROCK 2007). In einer Studie von ZAWADA et al. (2011) zeigten CD14++CD16- Monozyten die höchste Phagozytose-Kapazität, während die basale ROS- Produktion frisch isolierter Monozyten in CD14++CD16+ Monozyten am stärksten war. In Abweichung dazu wiesen CROS et al. (2010) in CD14++CD16- Monozyten die stärkste ROS-Produktion nach, allerdings nach Stimulation mit IgG-opsonisiertem BSA.
Es wird vermutet, dass humane Monozyten in vivo das Knochenmark als CD14++CD16- Monozyten verlassen, sich innerhalb weniger Tage zu CD14++CD16+ Monozyten und weiter zu CD14+CD16++ Monozyten entwickeln, obwohl ein Beweis für diese Annahme noch aussteht.
Monozyten-Subpopulationen anderer Spezies werden aus Gründen der Vermeidung von Wiederholungen nicht im Literaturteil, sondern in der Diskussion ausführlich beschrieben, speziesübergreifend verglichen und im Zusammenhang eigener Ergebnisse diskutiert.
2.5 Makrophagen und deren Rolle im Entzündungsgeschehen 2.5.1 Makrophagen
Aus dem Blutstrom ins Gewebe auswandernde Monozyten differenzieren vor Ort zu Makrophagen. Diese stellen runde Zellen mit einem Durchmesser von etwa 15 µm dar,
besitzen (DUEVEL et al. 2012). Weiterhin sind Makrophagen morphologisch durch einen hohen Zytoplasmaanteil, einen zentrierten, runden bis bohnenförmigen Zellkern, viele Mitochondrien und Lysosomen, ein raues endoplasmatisches Retikulum und einen Golgi- Apparat gekennzeichnet. Die Erneuerungsrate von Gewebemakrophagen beträgt etwa 1% pro Tag (TIZARD 2004). Um Fremdmaterial effizienter zu beseitigen, können Makrophagen durch Fusion sogenannte vielkernige Riesenzellen bilden. Makrophagen sind wie deren Vorläuferzellen Monozyten Teil des mononukleären Phagozytensystems, dessen Hauptaufgaben in der Antigenpräsentation, Phagozytose und Immunmodulation zu sehen sind (DALE et al. 2008).
2.5.2 Die Bedeutung von Monozyten und Makrophagen im Entzündungsgeschehen Eindringende Erreger werden vom Immunsystem durch Initiierung einer Entzündungsreaktion bekämpft. Diese muss streng reguliert werden, um eine überschießende Immunantwort und exzessive Gewebeschädigung zu vermeiden. Am Anfang der Entzündungskaskade steht die Erkennung von molekularen Alarmsignalen. Diese Gefahrensignale können sowohl durch Gewebeschäden wie auch durch mikrobielle Besiedelung freigesetzt werden und werden von Antigen-präsentierenden Zellen wie residente Gewebemakrophagen und dendritische Zellen erkannt. Im Gewebe residente Zellen sind somit als die primären Initiatoren der Entzündungsreaktion zu begreifen. Zytoplasma- und Zellkernbestandteile, die bei einer Infektion aus nekrotischen, nicht jedoch aus apoptotischen Zellen freigesetzt werden, enthalten sogenannte damage-associated molecular patterns (DAMPs). DAMPs (z. B. DNA) werden von pattern recognition receptors (PRRs, wie z. B. Toll-like Rezeptor 4 (TLR4)) der Leukozyten erkannt und induzieren die Produktion pro-inflammatorischer Zytokine wie IL-1.
Proteasen und Hydrolasen, die aus nekrotischen Zellen freigesetzt werden, tragen durch Produktion weiterer Mediatoren und zusätzlicher DAMPs zu einer Signalverstärkung bei.
Erregerbestandteile, die sogenannten Pathogen-assoziierten molekularen Muster (pathogen- associated molecular patterns, PAMPs), lösen ebenfalls eine Entzündungsreaktion durch Aktivierung von Antigen-präsentierenden Zellen via PRRs aus; so aktiviert bspw. bakterielles Lipopolysaccharid (LPS) TLR4 und führt zur Freisetzung pro-inflammatorischer Zytokine.
Im Folgenden wird speziell auf die Bedeutung von Monozyten und Makrophagen im Entzündungsgeschehen eingegangen.
Die patroullierende Eigenschaft nicht-klassischer Monozyten entlang der luminalen Seite des Endothels ist erstmals bei AUFFRAY et al. (2007) beschrieben. Bei Gewebeschädigung oder Infektion migrieren diese Zellen als erste an den Ort des Geschehens. Aufgrund der Expression von Genen, die für antimikrobielle Proteine, PRRs, Scavenger Rezeptoren, Zytokine, Chemokine und Antigenpräsentation kodieren, wird vermutet, dass diese frühe Migration nicht-klassischer Monozyten für die nachfolgende Entzündungsreaktion bedeutsam sein könnte (AUFFRAY et al. 2009). Diese vorübergehende Rekrutierung nicht-klassischer
Monozyten ins Gewebe wird jedoch rasch von neutrophilen Granulozyten und klassischen Monozyten abgelöst (AUFFRAY et al. 2009; SOEHNLEIN et al. 2009). Residente Makrophagen, die durch bei Infektion oder Verletzung freiwerdende molekulare Alarmsignale aktiviert werden, sezernieren Chemokine, die neutrophile Granulozyten aus dem Blutstrom ins Gewebe locken (SOEHNLEIN u. LINDBOM 2010). Neutrophile Granulozyten setzen ihrerseits sekretorische Komponenten wie Azurocidin frei, welches sich aufgrund seiner kationischen Natur an das Endothel anlagert, dort zu einer erhöhten Expression von Adhäsionsmolekülen beiträgt und so die feste Adhäsion von Monozyten an das Endothel fördert (LEE et al. 2003; SOEHNLEIN et al. 2005; SOEHNLEIN u. LINDBOM 2009). Jedoch werden unterschiedliche Monozyten-Subpopulationen durch verschiedene Mechanismen ins Gewebe gelockt. So führte im Mausmodell die Depletion neutrophiler Granulozyten in vivo zu einer verminderten Rekrutierung klassischer Monozyten (SOEHNLEIN et al. 2008; SOEHNLEIN et al. 2009), was jedoch durch die lokale Gabe von Überständen neutrophiler Granulozyten fast vollständig rückgängig gemacht werden konnte.
Im Übergang von der Rekrutierung neutrophiler Granulozyten hin zu Monozyten sind IL-6 und dessen löslicher Rezeptor, sIL-6Rα, von Bedeutung. Die Chemokin-vermittelte Aktivierung neutrophiler Granulozyten führt zur Abstoßung von IL-6Rα, der nun freie sIL- 6Rα bildet einen Komplex mit IL-6 und dieser Komplex bindet an endotheliales gp130.
Dadurch wird das sogenannte IL-6 trans-signalling in Gang gesetzt, in dessen Folge Endothelzellen CCL2 und VCAM1 verstärkt exprimieren, was zur Adhäsion und Emigration klassischer Monozyten führt (ROMANO et al. 1997; HURST et al. 2001). Darüber hinaus produzieren neutrophile Granulozyten Chemokine wie z. B. CCL3 und CCL4, die über die Bindung an CCR1 vorrangig klassische Monozyten rekrutieren (KASAMA et al. 1993).
Im Gewebe angekommen, beseitigen Monozyten, Makrophagen und neutrophile Granulozyten gemeinsam den pathogenen Stimulus durch Phagozytose. Nach erfolgreicher Erregereliminierung muss der Entzündungsprozess moduliert werden, um überschießende Gewebeschädigung zu verhindern und den Heilungsprozess einzuleiten. In dieser Phase verhindern verschiedene Signale einen anhaltenden Leukozyteneinstrom, fördern die Beseitigung von Zelldebris und die Wiederherstellung der Homöostase. Dies ist ein aktiver Prozess, in dem Lipidmediatoren vermutlich eine Schlüsselrolle spielen (SERHAN et al.
2008). Die initiale Entzündungsantwort wird durch Prostaglandine und Leukotriene, die u.a.
von Endothelzellen, neutrophilen Granulozyten, Monozyten und Makrophagen produziert werden, verstärkt (FUNK 2001). Im weiteren Verlauf bewirken Prostaglandin E2 (PGE2) und PGD2 schrittweise die Bildung anti-inflammatorischer, resolutionsfördernder Lipidmediatoren wie Lipoxine und Resolvine (SERHAN et al. 2008). Dieser Vorgang wird als lipid mediator class-switch bezeichnet (LEVY et al. 2001). Lipoxin A4 werden hemmende Eigenschaften auf die Migration neutrophiler Granulozyten und eine Förderung der Migration von Monozyten zugeschrieben (MADDOX et al. 1997). Dies geschieht durch Förderung der nicht entzündlichen Phagozytose von apoptotischen neutrophilen Granulozyten und Verhinderung der CXCL8-Freisetzung aus Monozyten und Makrophagen (JOZSEF et al. 2002). Resolvin
E1 vermindert die TNF-α-vermittelte NF-κB-Aktivierung und führt so zu einer anti- inflammatorischen Signalkaskade in den Zellen (ARITA et al. 2007), andere Resolvine gelten als potente Inhibitoren der transendothelialen Migration neutrophiler Granulozyten (SERHAN et al. 2008). Überdies wird der Einstrom neutrophiler Granulozyten durch Chemokininaktivierung gestoppt. So führen Resolvin E1 und Protectin D1 zu einer vermehrten Expression von CCR5 auf apoptotischen neutrophilen Granulozyten, was zur Beseitigung inflammatorischer Chemokine wie CCL3 und CCL5 (ARIEL et al. 2006) und somit zur Beendigung des inflammatorischen Leukozyteneinstroms führt. Auch Matrix- Metalloproteinasen (MMPs) tragen zur Chemokininaktivierung bei: CCL7 wird durch MMP7 gespalten und bindet an die Rezeptoren CCR1, CCR2 und CCR3, jedoch führt die Bindung von CCL7 nicht zur Zellaktivierung und Chemotaxis. CCL7 kann daher als entzündungshemmender Chemokin-Antagonist gesehen werden (MCQUIBBAN et al. 2000;
MCQUIBBAN et al. 2002).
Die Lebensdauer neutrophiler Granulozyten wird durch die Freisetzung verschiedener Faktoren aus Makrophagen gesteuert; so führen IL-1β, granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) und granulocyte-monocyte colony-stimulating factor (GM-CSF) zu einer verzögerten Apoptose neutrophiler Granulozyten (KANTARI et al. 2008), TNF-α kann jedoch in hohen Konzentrationen oder in membrangebundener Form die Lebensdauer neutrophiler Granulozyten verkürzen und die Resolution der Entzündung fördern (MESZAROS et al. 2000; VAN DEN BERG et al. 2001; ALLENBACH et al. 2006). Aus den sterbenden Zellen wird CX3CL1 freigesetzt; dessen Rezeptor CX3CR1 ist zwar auf klassischen und nicht-klassischen Monozyten exprimiert, wird jedoch selektiv von nicht- klassischen Monozyten für die Migration ins Gewebe genutzt (ANCUTA et al. 2003;
TRUMAN et al. 2008).
Das Zusammenspiel verschiedener Mechanismen (lipid mediator class-switch, Chemokininaktivierung, Sterben neutrophiler Granulozyten) führt also zur Rekrutierung von Makrophagen, die tote neutrophile Granulozyten phagozytieren. Durch Freisetzung von vascular endothelial growth factor (VEGF) und anderen Wachstumsfaktoren wird dadurch die letzte Phase der Entzündungsreaktion, die Gewebeneubildung und Wiederherstellung der Homöostase, eingeleitet. Da die Beseitigung apoptotischer Zellen durch Ingestion die Phagozytosekapazität und Tötung von Bakterien negativ beeinflusst (MEDEIROS et al.
2009), ist die Feinregulation des zeitlichen Ablaufs entscheidend für das Ergebnis: eine zu frühe Resolution der Entzündung könnte eine verlängerte mikrobielle Infektion bedeuten.
2.6 Makrophagenplastizität
Makrophagen zeichnen sich durch eine beeindruckende Plastizität aus; sie können ihre Physiologie an veränderte Umweltbedingungen anpassen. So entstehen verschiedene Makrophagenpopulationen, die sich in ihrer Funktion unterscheiden. Bisher wurden Makrophagen oft analog zu Th1- und Th2-Zellen in klassisch aktivierte M1-Makrophagen
und alternativ aktivierte M2-Makrophagen eingeteilt (GORDON 2003). Da unter den alternativ aktivierten Makrophagen jedoch Zellen mit einer Vielzahl verschiedener Funktionen zusammengefasst wurden, erfolgt die Einteilung von Makrophagen in dieser Übersicht anhand ihrer Funktion in Makrophagen der Wirtsabwehr (klassisch aktivierte Makrophagen), der Wundheilung und der Immunregulation (regulatorische Makrophagen).
Zwischen diesen Extremen gibt es jedoch auch Zwischenstufen mit Makrophagen, die Eigenschaften von verschiedenen Typen besitzen, wie in Abbildung 1 dargestellt.
Abbildung 1: Spektrum der Makrophagenaktivierung.
Klassisch aktivierte Makrophagen (Makrophagen der Wirtsabwehr) sind rot dargestellt, Makrophagen der Wundheilung gelb und regulatorische Makrophagen blau. Mischfarben wie grün stellen Makrophagen mit Charakteristiken von Wundheilungsmakrophagen und von solchen der Immunregulation dar (z. B. Tumor-assoziierte Makrophagen). Nach Mosser 2008.
2.6.1 Klassisch aktivierte Makrophagen
Diese pro-inflammatorischen Effektormakrophagen entwickeln sich nach Stimulation mit IFN-γ und TNF und zeichnen sich durch mikrobizide und tumorizide Eigenschaften sowie durch die Produktion pro-inflammatorischer Zytokine und Mediatoren (z. B. IL-1, IL-6 und IL-23) aus (MACKANESS 1977; O'SHEA u. MURRAY 2008). Als Antwort auf eine Infektion oder Stress wird INF-γ früh und vorübergehend von Zellen der angeborenen Immunität (NK-Zellen) produziert. Zellen der adaptiven Immunität (Th1-Zellen) gewährleisten eine andauernde klassische Aktivierung durch eine längerfristige IFN-γ- Produktion (MOSSER u. EDWARDS 2008). Bestimmte TLR-Liganden sind durch Induktion von TNF und IFN-β ebenfalls in der Lage Makrophagen klassisch zu aktivieren (YAMAMOTO et al. 2003).
klassisch aktivierte Makrophagen
Makrophagen der Wundheilung
regulatorische
Makrophagen
Die Bedeutung klassisch aktivierter Makrophagen für die Wirtsabwehr ist sehr gut beschrieben: so ist der Wirt durch fehlende IFN-γ-Expression anfälliger für diverse bakterielle, virale und Protozoeninfektionen (FILIPE-SANTOS et al. 2006). Auf der anderen Seite sind klassisch aktivierte Makrophagen durch ihre Produktion pro-inflammatorischer Mediatoren an der Immunpathologie verschiedener Autoimmunerkrankungen wie rheumatoide Arthritis (SZEKANECZ u. KOCH 2007) und der inflammatory bowel disease (ZHANG u. MOSSER 2008) beteiligt.
2.6.2 Makrophagen der Wundheilung
Zellen der angeborenen und der adaptiven Immunität können neben klassisch aktivierten Makrophagen auch Wundheilungsmakrophagen induzieren. Dies geschieht durch IL-4, welches bei Gewebeverletzung sehr rasch vor allem aus basophilen Granulozyten und Mastzellen freigesetzt wird (BRANDT et al. 2000). Chitin, Bestandteil bestimmter Pilze und Parasiten, führt ebenso zur IL-4-Sekretion (REESE et al. 2007). Residente Gewebemakrophagen differenzieren auf IL-4 hin zu Zellen, die für Wundheilung programmiert sind; IL-4 erhöht die Arginaseaktivität, sodass Arginin zu Ornithin, einem Vorläufer von Kollagen und von Polyaminen, umgebaut wird. Dies trägt zur Produktion extrazellulärer Matrix bei (KREIDER et al. 2007). Eine Th2-vermittelte Immunantwort ist meist Folge von Störungen der mukosalen Oberflächen, vor allem der Lunge und des Darmes (REESE et al. 2007), jedoch auch als Reaktion auf Wurminfektionen (WILSON et al. 2007).
Die Immunantwort vom Th2-Typ ist gekennzeichnet durch Produktion von IL-4 und IL-13.
Makrophagen, die in vitro diesen Zytokinen ausgesetzt sind, verlieren die Fähigkeit, T-Zellen Antigen zu präsentieren, produzieren nahezu keine pro-inflammatorischen Zytokine und weniger toxische Sauerstoff- und Stickstoffradikale und töten intrazelluläre Bakterien weniger effizient als klassisch aktivierte Makrophagen (EDWARDS et al. 2006). Vielmehr sezernieren diese Zellen Komponenten der Extrazellulärmatrix, sodass ihre Funktion in der Wundheilung gesehen wird. Makrophagen der Wundheilung können im Falle einer Dysregulation jedoch auch schädlich für den Wirt werden; die bei chronischer Schistosomiasis auftretende Gewebefibrose wird auf eine unkontrollierte Aktivierung von Makrophagen der Wundheilung zurückgeführt (HESSE et al. 2001).
2.6.3 Regulatorische Makrophagen
Auch regulatorische Makrophagen können sich durch Stimuli der angeborenen und adaptiven Immunität entwickeln. Für den Bereich des angeborenen Immunsystems ist die Hypothalamus-Hypophysen-Nebennieren-Achse von Bedeutung. Glucocorticoide, die stressbedingt ausgeschüttet werden, hemmen die Makrophagen-vermittelte pro- inflammatorische Wirtsabwehr durch Hemmung der Transkription pro-inflammatorischer Zytokingene und Verminderung der mRNA-Stabilität (STERNBERG 2006) und induzieren
somit regulatorische Makrophagen. Je nach Stimulus können sich regulatorische Makrophagen funktionell unterscheiden, gewisse Charakteristiken sind jedoch generell vorhanden; so bedarf es zweier Signale, um die Zellen regulatorisch zu aktivieren. Das erste Signal, bestehend z. B. aus Immunkomplexen, Prostaglandinen oder apoptotischen Zellen, wirkt nicht stimulierend, sondern bedarf eines zweiten Signals, wie z. B. eines TLR- Liganden, um in Makrophagen die Produktion von IL-10 anzuregen (EDWARDS et al. 2006).
Neben dieser charakteristischen IL-10-Produktion wird IL-12 herunterreguliert (GERBER u.
MOSSER 2001), sodass regulatorische Makrophagen aufgrund der IL-10-Produktion als potente Inhibitoren einer Entzündung gelten. Im Unterschied zu Wundheilungsmakrophagen tragen diese Makrophagen nicht zur Produktion von Extrazellulärmatrix bei, vielmehr können sie durch die Expression von MHC-Klasse-II-Molekülen und von co-stimulatorischen Molekülen (CD80 und CD86) naiven T-Zellen effektiv Antigen präsentieren (EDWARDS et al. 2006). Somit bestehen sowohl auf funktioneller wie auch auf biochemischer Ebene klare Unterschiede zwischen regulatorischen und Wundheilungsmakrophagen.
2.6.4 Bedeutung der Makrophagenplastizität für verschiedene Erkrankungen
Die Rolle der Makrophagen bei Krebserkrankungen wird kontrovers diskutiert.
Überwachungsmechanismen der Makrophagen verhindern zwar das Wachstum veränderter Zellen und deren Vorstufen, jedoch hat die Depletion der Makrophagen kaum einen Effekt auf die Empfänglichkeit des Organismus für neoplastische Entartungen (LIN u. POLLARD 2007; TENG et al. 2008). Klassisch aktivierte Makrophagen können zu neoplastischen Vorstufen beitragen, da die Produktion freier Radikale eine Schädigung der DNA mit nachfolgender Mutation zur Folge haben kann. Im Verlauf der Progression verändert das Tumormillieu den Phänotyp der Tumor-assoziierten Makrophagen hin zu eher regulatorischen Makrophagen (POLLARD 2008). Diese produzieren nachfolgend IL-10, welches in der Lage ist, die Immunantwort auf Tumor-Neoantigene zu verhindern und benachbarte Makrophagen zu deaktivieren (BISWAS et al. 2006). Vermutlich tragen regulatorische Makrophagen darüber hinaus zur Angiogenese und somit zum Tumorwachstum bei (LIN et al. 2006).
Tumor-assoziierte, anfangs klassisch aktivierte Makrophagen verändern im Verlauf der Tumorbildung ihren Phänotyp und zeigen Eigenschaften sowohl regulatorischer Makrophagen (IL-10-Produktion) als auch von Makrophagen der Wundheilung (Hemmung Antigen-präsentierender Zellen).
Die Obesitas ist von einer Änderung des Phänotyps von Wundheilungs- hin zu pro- inflammatorischen Makrophagen gekennzeichnet. In gesunden Individuen besitzen residente Fettgewebemakrophagen den Phänotyp von Makrophagen der Wundheilung; sie produzieren kaum pro-inflammatorische Zytokine, exprimieren Arginase und scheinen die Adipozytenfunktion zu unterstützen und die Insulinsensitivität aufrecht zu erhalten (LUMENG et al. 2007). Obesitas wird mit einer chronischen Entzündung assoziiert, in der
die Zeit können diese Zytokine zu Insulinresistenz und Typ 2 Diabetes führen (LUMENG et al. 2007; ZEYDA u. STULNIG 2007). Weiterhin wird vermutet, dass die vermehrte Expression von Prokoagulanzien durch diese pro-inflammatorischen Makrophagen zu einem erhöhten Risiko für atherosklerotische und kardiovaskuläre Erkrankungen bei Obesitas beitragen könnte (BASTARD et al. 2006). Die Phänotypenänderung der Fettgewebemakrophagen hin zu einem pro-inflammatorischen Typ trägt so vermutlich zur nachfolgenden Pathologie der Obesitas bei. Darüber hinaus könnte in Zukunft der Identifikation der Makrophagen im Fettgewebe prognostische Bedeutung für mögliche kardiovaskuläre und metabolische Risiken zukommen.
2.6.5 Makrophagenplastizität beim Rind
Studien über verschiedene Makrophagenpopulationen des Rindes sind rar. Bei der bovinen Afrikanischen Trypanosomiasis (Schlafkrankheit) tragen klassisch aktivierte M1- Makrophagen zur Entwicklung des Leitsymptoms Anämie bei, während der Wechsel zu alternativ aktivierten M2-Makrophagen das Krankheitsbild verbessert. Darüber hinaus induzieren von Trypanosomen stammende Glykolipide wie das Glycosylphosphatidylinositol (GPI) die Bildung von M1-Makrophagen, wirtseigenes IL-10 hingegen inhibiert die M1- vermittelte Entzündungsreaktion, vermittelt die Phänotypenänderung hin zu M2- Makrophagen und reduziert die klinischen Symptome einschließlich der Anämie (STIJLEMANS et al. 2010). FLYNN et al. (2008) zeigten die Entwicklung alternativ aktivierter Makrophagen nach Stimulation mit IL-4 und exkretorisch/sekretorischen Produkten von Fasciola hepatica mit verringerter iNOS- und hoher Arginase-I-Produktion sowie einer niedrigen IFN-γ-Konzentration nach Stimulation mit TLR2- und TLR4-Liganden.
2.7 Leukozyten- und Makrophagen-spezifische Antikörper 2.7.1 CD68
CD68 wird im Allgemeinen zu Identifizierung von Monozyten und Makrophagen eingesetzt.
KP1 und PG-M1 sind zwei von vielen monoklonalen Antikörpern gegen CD68, die besonders häufig zur Identifizierung des CD68-Antigens eingesetzt werden, da beide Antikörper identische Färbemuster in Paraffin-eingebetteten Gewebeproben zeigen. Das CD68-Antigen ist in Lysosomen, Phagosomen und in Granula neutrophiler Granulozyten lokalisiert, sodass die Antikörper KP1 und PG-M1 eine breite Gewebereaktivität aufweisen (LAU et al. 2004).
Daher können diese Antikörper nicht als spezifische Marker für Monozyten und Makrophagen angesehen werden. Aus diesem Grund wurde auf die Verwendung CD68- spezifischer Antikörper in der vorliegenden Arbeit verzichtet.
2.7.2 Antikörper PM-2K
Der Antikörper PM-2K detektiert Gewebemakrophagen in lymphoretikulären Organen wie Thymus, Milz, Lymphknoten und Tonsillen. Darüber hinaus werden Kupfferzellen der Leber, Alveolarmakrophagen, interstitielle Makrophagen von Niere und Pankreas und weiterer Organe durch diesen Antikörper identifiziert. Monozyten des Blutes, frisch isolierte Peritonealmakrophagen, Mikrogliazellen, Osteoklasten und dendritische Zellen sind PM-2K- negativ. Das Antigen, welches von PM-2K erkannt wird, ist ca. 150 kDa groß und wird zellmembranständig exprimiert (TAKEYA et al. 1991). PM-2K wird als Makrophagen- spezifisch betrachtet, da keine anderen Zelltypen von PM-2K detektiert werden. PM-2K ist kreuzreaktiv für bovines Gewebe, kann jedoch nicht für Paraffin-eingebettetes Gewebe verwendet werden, sodass dieser Antikörper nicht für die immunhistologische Untersuchung verschiedener Makrophagensubtypen in bovinem Paraffin-eingebettetem Zitzengewebe geeignet war.
2.7.3 Antikörper AM-3K
Der Antikörper AM-3K erkennt das CD163-Molekül. CD163 ist ein Hämoglobin Scavenger Rezeptor, der im Blut befindliche Hämoglobin-Haptoglobin-Komplexe bindet und beseitigt.
Aufgrund dieser reinigenden Funktion wird dieser Rezeptor der späten anti- inflammatorischen Antwort zugeordnet (HOGGER et al. 1998; YAMATE et al. 2000;
KRISTIANSEN et al. 2001). Weiterhin wird für anti-inflammatorische Zytokine eine Induktion der CD163-Expression beschrieben, wohingegen IFN-γ, LPS und TNF-α die CD163-Expression unterdrücken (BUECHLER et al. 2000). CD163 wird restriktiv in der Zellmembran von Monozyten und Makrophagen exprimiert und ist für Mensch, Maus, Hund, Rind und Affe beschrieben (VAN GORP et al. 2010). Gewebemakrophagen zeigen im Vergleich zu Monozyten eine stärkere CD163-Expression, was möglicherweise für eine Rolle von CD163 als Differenzierungsmarker der Makrophagenlinie mit zunehmender Expression während der Differenzierung spricht (BACKE et al. 1991; SANCHEZ et al. 1999;
CHAMORRO et al. 2005). CD163-positive Makrophagen werden in der Heilungsphase einer akuten Entzündung, in chronischen Entzündungen und in Wundheilungsgewebe detektiert, wohingegen frisch eingewanderte Gewebemakrophagen CD163-negativ sind (ZWADLO et al. 1987; VERSCHURE et al. 1989). AM-3K-positiven Makrophagen ist aufgrund dieser Eigenschaften eine anti-inflammatorische Rolle (M2-Makrophagen) zuzuschreiben.
2.7.4 Antikörper MAC387
Der Antikörper MAC387 detektiert Calprotectin (S100A8/A9), einen Heterokomplex aus den calciumbindenden S100 Proteinen S100A8 und S100A9 (BRANDTZAEK et al. 1988). S100 Proteine werden zu den damage-associated molecular patterns (DAMPs) gezählt, welche bei
Zellstress aus aktivierten oder geschädigten Zellen freigesetzt werden (ROTH et al. 2003).
S100A8 und S100A9 werden in neutrophilen Granulozyten und Monozyten (ODINK et al.
1987a; LAGASSE u. CLERC 1988; ZWADLO et al. 1988a; ROTH et al. 1992) und unter pro-inflammatorischen Bedingungen auch in Keratinozyten und Epithelzellen exprimiert (M.
FROSCH et al. 2005; ZENZ et al. 2005). Residente Gewebemakrophagen gelten als S100A8/A9-negativ (ROTH et al. 1992). Die intrazelluläre Expression von S100A8/A9 in humanen Monozyten wird durch IL-1β, TNF-α und LPS induziert (STRIZ u.
TREBICHAVSKI 2004; KIDO et al. 2005). Freigesetztes S100A8 und S100A9 binden an Endothelzellen und lösen eine pro-inflammatorische Reaktion aus, in deren Folge die Expression von Adhäsionsmolekülen wie vascular endothelial adhesion molecule 1 (VCAM- 1) und intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) und auch von pro-inflammatorischen Zytokinen hochreguliert wird (FOELL et al. 2007). In entzündetem Gewebe werden S100 Proteine verstärkt exprimiert (ODINK et al. 1987a; ZWADLO et al. 1988a). Die S100A8/A9- Expression in Makrophagen wird mit frisch rekrutierten, Monozyten-ähnlichen Makrophagen unter pro-inflammatorischen Bedingungen (M1-Makrophagen) assoziiert (STRIZ u.
TREBICHAVSKI 2004).
2.7.5 MHC-Klasse-II-Moleküle
MHC-Klasse-II-Moleküle stellen Glycoproteine der Zelloberfäche dar, welche für die Präsentation extrazellulärer Antigene für CD4-T-Zellen von Bedeutung sind und daher hauptsächlich auf professionellen Antigen-präsentierenden Zellen (B-Zellen, dendritische Zellen und Makrophagen) exprimiert werden. Die Expression von MHC-Klasse-II kann jedoch auch in hämatopoetischen und nicht hämatopoetischen Zellen durch verschiedene Stimuli (z. B. IFN-γ) induziert werden (MING FENG et al. 2007). Monozyten und Makrophagen, die die Expression von MHC-Klasse-II auf der Zellemembran herauf regulieren, stellen aktivierte Zellen dar (KAMPHORST et al. 2010). Somit kann mithilfe spezifischer Anti-MHC-Klasse-II-Antikörper der Aktivierungszustand von Makrophagen eingeschätzt werden.
2.7.6 CD45
Das CD45-Molekül, auch als leukocyte-common antigen (LCA) bekannt, ist eine Transmembran-Proteintyrosinphosphatase, die auf allen kernhaltigen hämatopoetischen Zellen vorkommt (THOMAS u. LEFRANCOIS 1988). Aufgrund eines alternativen Splicings der Exons 4, 5 und 6, die für die Regionen A, B und C kodieren, existiert CD45 in vier verschiedenen Isoformen: CD45RA (Molekulargewicht 220 kDa), CD45RB (210 kDa), CD45RC (200 kDa) und CD45RO (180 kDa). Lymphozyten zeigen die höchste CD45- Expression. Ruhende T-Zellen und NK-Zellen exprimieren CD45RA und CD45RB, aktivierte T-Zellen, Gedächtnis-T-Zellen, Monozyten, Granulozyten und dendritische Zellen
exprimieren CD45RO und CD45RC (YU et al. 2002); B-Zellen exprimieren hingegen einzig CD45RA. Verschiedene Studien belegen eine wichtige Bedeutung von CD45 in der T-Zell- Aktivierung und Differenzierung (BENVENISTE et al. 1994; CHAN et al. 1994;
TROWBRIDGE u. THOMAS 1994; ZAPATA et al. 1994) sowie in der Proliferation und Antigen-Rezeptorfunktion von B-Zellen (JUSTEMENT et al. 1991; LIN et al. 1992;
JUSTEMENT et al. 1994). Weiterhin wird eine Beteiligung von CD45 in der Antikörper- Isotypänderung von B-Zellen vermutet (YAKURA et al. 1986; GEORGE et al. 1994). Die CD45-Phosphataseaktivität ist während der Mitose erhöht, sodass diesem Protein auch regulatorische Eigenschaften in der Zellteilung zugeschrieben werden. Anti-CD45-Antikörper werden weithin für die Diagnostik lymphoider Entartungen eingesetzt.
2.8 Chemokine und Chemokinrezeptoren von Monozyten
Chemokine sind kleine Proteine aus 60 bis 100 Aminosäuren mit vier konservierten Cysteinen, die zwei essenzielle Disulfidbrücken bilden (Cys1 – Cys3 und Cys2 – Cys4).
Anhand der Reihenfolge und Anzahl aufeinander folgender Cysteine am N-Terminus werden Chemokine in vier Kategorien eingeteilt: CXC, CC, CX3C und C. Gene, die für humane CXC-Chemokine kodieren, befinden sich auf Chromosom 4, wohingegen die Gene für CC- Chemokine auf Chromosom 17 zu finden sind. Chemokine einer Kategorie können nur an den Rezeptor derselben Kategorie binden (LEONARD u. YOSHIMURA 1990). Chemokine werden als Antwort auf Signale wie pro-inflammatorische Zytokine sezerniert und haben ihre Bedeutung in der selektiven Rekrutierung von Immunzellen anhand eines Konzentrationsgefälles, dem sogenannten Chemokingradienten. (CALLEWAERE et al.
2007). Sie bestehen aus drei wichtigen Domänen: die flexible N-terminale Domäne, die große Schleife und die α-Helix. Die N-terminale Domäne ist besonders wichtig für die Rezeptorbindung und -aktivierung (CLARK-LEWIS et al. 1991). Bisher sind ca. 50 Chemokine für den Menschen beschrieben mit einer molaren Masse von 8 bis 12 kDa und einer Sequenzhomologie von < 20% bis > 90%. Chemokine vermitteln Chemotaxis durch G- Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCR), deren Aktivierung zur Aktivierung intrazellulärer Signalkaskaden und letztendlich zur Chemotaxis führt. Binnen Sekunden nach Stimulation ist eine Erhöhung der intrazellulären Calciumkonzentration (BAGGIOLINI 1998) und eine eindrucksvolle Veränderung der Zellgestalt (shape change) durch Neuformation und Retraktion von Lamellipodien zu beobachten. Weiterhin induzieren Chemokine die Hochregulation und Aktivierung von Integrinen, die Leukozyten befähigen, an die Endothelzellen der Blutgefäße zu binden und nachfolgend ins Gewebe auszuwandern (SPRINGER 1994).
Chemokine und -rezeptoren sind i. d. R. promiskuitiv, indem mehrere Chemokine an denselben Rezeptor binden können und ein Chemokin für gewöhnlich Ligand für verschiedene Rezeptoren ist. Ein weiteres Merkmal des Chemokinsystems ist die Redundanz;
dies bedeutet, dass verschiedene Chemokine und -rezeptoren dieselbe Funktion erfüllen
können. Dies trägt zur Robustheit des Systems bei, da der Ausfall eines Chemokins/Rezeptors durch ein anderes Chemokin/einen anderen Rezeptor kompensiert werden kann (MANTOVANI 1999). Alle Chemokine sind durch Duplikation aus einem gemeinsamen Vorläufer hervorgegangen (DEVRIES et al. 2006; NOMIYAMA et al. 2010). Viele Chemokine und Chemokinrezeptoren befinden sich durch Tandemgenduplikation auf sogenannten Cluster-Regionen der Chromosomen. Cluster-Chemokine zeigen oft speziesspezifische Unterschiede, was vermutlich auf die unterschiedliche Pathogenexposition verschiedener Spezies zurückzuführen ist (NOMIYAMA et al. 2010).
In der Literatur werden CCL2, CCL4 und CCL5 als Chemoattraktoren für Monozyten beschrieben (SOZZANI et al. 1993), an anderer Stelle wird zusätzlich CCL3 genannt (DAVID u. MORTARI 2000). CCR1, CCR2, CCR5 und CXCR4 gelten als Chemokinrezeptoren für Monozyten (SAMSON et al. 1996; SU et al. 1996; BLEUL et al.
1997; FRADE et al. 1997; XU et al. 2000), jedoch werden auch CCR7, CCR8, CXCR1, CXCR2 und CX3CR1 genannt (WIDDISON u. COFFEY 2011).
2.8.1 CCL2
CCL2 ist das zuerst beschriebene humane CC-Chemokin. Humanes CCL2 besteht aus 76 Aminosäuren, besitzt ein Molekulargewicht von 13 kDa (VAN COILLIE et al. 1999) und ist auf Chromosom 17 lokalisiert. Die Freisetzung von CCL2 erfolgt entweder konstitutiv oder nach Induktion durch oxidativen Stress, Zytokine oder Wachstumsfaktoren. CCL2 wird u. a.
von Endothelzellen, Fibroblasten, Epithelzellen, glatten Muskelzellen, Mesangiozyten, Astrozyten, Monozyten und Mikrogliazellen gebildet (CUSHING et al. 1990; STANDIFORD et al. 1991; BROWN et al. 1992; BARNA et al. 1994), jedoch gelten Monozyten und Makrophagen als Hauptquelle von CCL2 (YOSHIMURA et al. 1989a; YOSHIMURA et al.
1989b). Monozyten werden durch CCL2 an den Ort aktiver Entzündungen rekrutiert (AJUEBOR et al. 1998). Knockout Mäuse für CCL2 und dessen Rezeptor CCR2 sind zwar vital, jedoch zeigen sie eine abnormale Rekrutierung von Monozyten und der Zytokinproduktion (LU et al. 1998). Die Expression von CCL2 ist mit der Entwicklung einer Th2-Antwort assoziiert (CHENSUE et al. 1995; HANDEL u. DOMAILLE 1996) und CCL2 verstärkt die IL-4-Ausschüttung aus T-Zellen (KARPUS et al. 1997). Darüber hinaus ist CCL2 in Th2-vermittelten Immunerkrankungen wie Asthma in großem Maße exprimiert und eine Neutralisierung führt in Tiermodellen zu einer Verbesserung (GONZALO et al. 1998).
CCL2 ist auch im Zusammenhang mit kardiovaskulären Erkrankungen von Bedeutung; so trägt CCL2 zur Atherosklerose via Rekrutierung von Monozyten in das Subendothel bei (DAWSON et al. 1999) und in einem Modell von BORING et al. (BORING et al. 1998) wurde eine verminderte arterielle Lipidablagerung in Abwesenheit von CCL2 oder CCR2 aufgezeigt. Chemokine und deren Rezeptoren wurden in vielen Tumoren detektiert. So korreliert die Expression von CCL2 in entartetem Gewebe in hohem Maße mit der Infiltration Tumor-assoziierter Makrophagen, Angiogenese und schlechter Überlebensrate bei Brustkrebs
(VALKOVIC et al. 2002). Jedoch werden CCL2 auch anti-tumorale Eigenschaften zugeschrieben; es verstärkt die zytostatische Aktivität gegen Tumorzellen nach Zugabe zu Makrophagen in Gewebekultur und induziert die Expression von Fas-Liganden und somit die Apoptose von Zellen (ZACHARIAE et al. 1990). Zusammenfassend spielt CCL2 eine wichtige Rolle im Entzündungsgeschehen durch die Rekrutierung von Monozyten und anderen Immunzellen ins Gewebe, durch Sekretion von Zytokinen und somit für den Fortgang der inflammatorischen Reaktion.
2.8.2 CCL4
Über CCL4, ein weiteres Monozyten-aktivierendes CC-Chemokin, ist wenig bekannt.
Humanes CCL4 besteht aus 69 Aminosäuren, ist 7,6 kDa groß und auf Chromosom 17 lokalisiert. Auch unter dem Namen MIP-1β (macrophage inflammatory protein 1-β) bekannt, wird es von Endotoxin-stimulierten Makrophagen produziert. CCL4 aktiviert neutrophile, basophile und eosinophile Granulozyten und induziert die Synthese und Freisetzung pro- inflammatorischer Zytokine wie IL-1, IL-6 und TNF-α aus Makrophagen und Fibroblasten (COLOBRAN u. JUAN 2007). Darüber hinaus vermittelt es die Migration von Monozyten und IL-2-stimulierten T-Zellen durch Bindung an den CC-Rezeptor CCR5, welcher von diesen Zellen exprimiert wird (BAGGIOLINI 1998). Zum Zeitpunkt der Versuchsdurchführungen im Rahmen der vorliegenden Arbeit stand rekombinantes bovines CCL4 nicht zur Verfügung, sodass mit CCL4 keine Versuche durchgeführt werden konnten.
2.8.3 CCL5
CCL5, auch als RANTES (Regulated upon Activation Normal T cell Expressed and Secreted) bezeichnet, besteht aus 68 Aminosäuren und besitzt ein Molekulargewicht von 7 kDa (APPAY u. ROWLAND-JONES 2001). Wie alle CC-Chemokine ist es auf Chromosom 17 lokalisiert. CCL5 induziert die Leukozytenmigration über Bindung an die G-Protein- gekoppelten Rezeptoren (GPCR) CCR1, CCR3, CCR4 und CCR5, wobei CCR1 und CCR5 auf Monozyten exprimiert werden (SAMSON et al. 1996). Es vermittelt die Migration von T- Zellen und Monozyten, aber auch von basophilen und eosinophilen Granulozyten, NK-Zellen, dendritischen Zellen und Mastzellen (SCHALL 1991). Die Produktion von CCL5, vorwiegend durch CD8+ T-Zellen, aber auch von Epithelzellen, Fibroblasten und Thrombozyten ist ein wichtiger Aspekt im Entzündungsgeschehen. CCL5 kann durch die Induktion der NO-Produktion in Makrophagen antimikrobielle Eigenschaften aufweisen (VILLALTA et al. 1998), jedoch kommen diesem Chemokin auch schädliche Eigenschaften durch die Rekrutierung von Immunzellen und Förderung entzündlicher Prozesse zu; so wurde eine gesteigerte CCL5-Expression mit einer Vielzahl entzündlicher Prozesse wie z. B.
allogene Transplantatabstoßungen, Atherosklerose, Arthritis, atopische Dermatitis, Asthma, Überempfindlichkeitsreaktionen vom verzögerten Typ, Glomerulonephritis, Endometriose,
Morbus Alzheimer und verschiedenen Tumoren assoziiert (ROSSI u. ZLOTNIK 2000;
APPAY u. ROWLAND-JONES 2001). Die Rolle von CCL5 in diesen Erkrankungen wird in der Induktion der Leukozytenmigration in die entzündeten Bereiche gesehen (MEURER et al.
1993). In der frühen Phase der Tumorentstehung wird CCL5 mit der Induktion und Promotion des Tumors assoziiert, während es in späteren Phasen mit Angiogenese und Metastasierung in Verbindung gebracht wird (APPAY u. ROWLAND-JONES 2001). Die Bedeutung von CCL5 für virale Erkrankungen, besonders für HIV, wird kontrovers diskutiert; so gibt es Studien, die einen antiviralen Effekt für CCL5 in vitro aufzeigen (MCKENZIE et al. 1996; ZANUSSI et al. 1996; POLO et al. 1999), jedoch wurde auch eine Förderung der HIV-Infektion beschrieben (SCHMIDTMAYEROVA et al. 1996; KINTER et al. 1998; YE et al. 2004). Eine wichtige Entdeckung für die Bedeutung des Chemokinsystems in der Pathogenese der HIV- Infektion wurde bei Menschen gemacht, die sich trotz mehrfacher Exposition mit HIV nicht infizierten. Diese Individuen hatten eine Mutation des CCR5-Gens, welche die CCR5- Rezeptorexpression an der Zelloberfläche unterdrückte (BERGER et al. 1999).
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass CCL5 entscheidende Bedeutung für die Entzündungskaskade besitzt, indem es Leukozyten an den Ort des Geschehens rekrutiert und sowohl pro- als auch anti-inflammatorische Eigenschaften aufweist.
3 Methoden
3.1 Gewinnung einzelner Leukozytenpopulationen des Blutes
Für die Gewinnung von Leukozytenpopulationen wurde Blut von zehn gesunden, im Zyklus befindlichen Holstein Friesian Kühen mit einem mittleren Alter von sieben Jahren aus der Klinik für Rinder der Tierärztlichen Hochschule Hannover genommen. Blutproben wurden morgens um 8 Uhr durch Punktion der Vena jugularis unter sterilen Kautelen nach Stauung des Gefäßes mit einer Staukette nach Witte (9.2.1) gewonnen. Eingesetzt wurde das Vacutainersystem mit heparinisierten Röhrchen (Natrium-Heparinat, 170 I.U.).
Gewinnung von mononukleären Zellen
Gerinnungsgehemmtes Vollblut wurde im Verhältnis 3:2 mit PBS (9.2.4) verdünnt und in 50 mL Röhrchen über Lymphozytenseparationsmedium® (9.2.2) geschichtet. Die anschließende Zentrifugation wurde über 30 Min. bei 4°C und 1000 x g ohne Bremse durchgeführt.
Während dieser Zentrifugation kam es zu einer Auftrennung der einzelnen Zellpopulationen aufgrund ihrer spezifischen Dichte. Zwischen dem Blutplasma und dem Lymphozytenseparationsmedium® befand sich die ‚Interphase‘ mit mononukleären Zellen (MNC; lymphoide Zellen und Monozyten) und Anteilen der Thrombozytenfraktion.
Unterhalb des Lymphozytenseparationsmediums® befanden sich die Erythrozyten und die polymorphkernigen Granulozyten (PMN).
Die Interphase wurde mit einer weitlumigen Pipette abgesaugt und in ein 50 mL Röhrchen mit vorgelegtem PBS (5 mL) überführt. Nach Auffüllen mit PBS auf 50 mL wurden drei Waschschritte durchgeführt (je 10 Min., 4°C; 500 x g, 250 x g und 100 x g), um die Thrombozyten weitgehend zu entfernen. Nach dem ersten Waschschritt wurden kontaminierende Erythrozyten im Zellpellet durch hypotone Lyse entfernt: nach Zugabe von 20 mL A. dest. und ständigem Schwenken für 20 Sek. wurden 20 mL 2-fach konzentriertes PBS (9.2.4) zugegeben. Zwischen den einzelnen Zentrifugationsschritten wurden die Zellen durch Aufschütteln des Pellets resuspendiert und in 45 mL PBS aufgenommen. Das letzte Zellpellet wurde in Zellkulturmedium aufgenommen, die Zellen gezählt und auf die gewünschte Konzentration eingestellt. Durch dieses Verfahren konnten MNC-Populationen mit einer Reinheit und Vitalität von 95 bis 99 % gewonnen werden. Die Ausbeute betrug 0,5 bis 1,1 x 106 MNC/mL Vollblut.
Gewinnung von Monozyten
Die Gewinnung von Monozyten aus mononukleären Zellen erfolgte über die Positiv-Selektion von Monozyten anhand ihres CD172a Oberflächenmarkers in einem magnetischen Separationssystem. Die nach der Dichtezentrifugation (s. o.) gewonnenen mononukleären Zellen wurden in 5 mL MACS-Puffer (9.2.4) aufgenommen und über einen 30 µm Nylonfilter
(9.2.2) gegeben, um Zellaggregate zu entfernen. Der Filter wurde zweimal mit jeweils 5 mL MACS-Puffer gespült und die filtrierte Zellsuspension bei 300 x g und 4°C für 10 Min.
zentrifugiert. Das Zellpellet wurde mit einem unmarkierten Mouse-anti-human-CD172a- Antikörper (Einsatz 1:90 in MIF-Puffer) (9.2.5) für 20 Min. bei 4°C inkubiert und anschließend mit MACS-Puffer (9.2.4) gewaschen (300 x g, 4°C, 10 Min.). Die Zellen wurden gezählt und je 1 x 107 Zellen wurden 80 µL MACS-Puffer und 20 µL eines mit Micro Beads gekoppelten Human-anti-mouse-Antikörpers (9.2.5) dazugegeben. Nach einer Inkubationszeit von 15 Min. bei 4°C wurden die Zellen zentrifugiert (300 x g, 4°C, 10 Min.) und in 3 mL MACS-Puffer aufgenommen. Für die magnetische Separation der CD172a- positiven Zellen wurde eine MACS-Säule (9.2.2) in die Separationseinheit (9.1) eingespannt und mit 3 mL MACS-Puffer gespült. Die Zellsuspension wurde über die Säule gegeben und der Durchlauf in einem 15 mL Röhrchen aufgefangen. Anschließend wurde die Säule dreimal mit jeweils 3 mL MACS-Puffer gespült. Die Spülfraktion wurde in einem gesonderten Gefäß aufgefangen. Zur Elution der in der Säule durch das anliegende Magnetfeld festgehaltenen CD172a-positiven Zellen wurde die Säule aus dem Magnetfeld herausgenommen und mit 5 mL MACS-Puffer gespült.
Von den MNC und von den Zellfraktionen Durchlauf und Eluat wurde je ein Aliquot mit einem PE-ALEXA 647-gekoppelten Mouse-anti-human-CD172a-Antikörper (Einsatz 1:2000 in MIF-Puffer) (9.2.5) für 10 Min. bei 4°C inkubiert. Direkt im Anschluss wurden diese Aliquote im Durchflusszytometer auf den prozentualen Anteil der CD172a-positiven Population überprüft.
Die im Eluat befindlichen Monozyten wiesen eine Reinheit von > 95% auf. Die Monozyten wurden bei 300 x g und 4°C für 10 Min. zentrifugiert, in I10F+ (9.2.4) aufgenommen und auf die gewünschte Konzentration eingestellt.
3.2 Generierung von Makrophagen aus Blutmonozyten in vitro
Makrophagen, die aus Blutmonozyten in vitro generiert wurden (bMdM, blood monocyte derived macrophages), werden im Weiteren als „MdM“ bezeichnet. Die Blutmonozyten wurden separiert (s. o.) und in I10F+ auf eine Zellzahl von 8 x 105 Monozyten/mL eingestellt.
Die Monozyten wurden anschließend in 24-well Platten (9.2.2) zu je 4 x 105 Zellen je well pipettiert. Die Reifung zu MdM fand über sieben Tage bei 37°C und 5% CO2 statt. Die Zellen wurden im Invertmikroskop auf Adhärenz und Kontamination überprüft. Kontaminierte Zellkulturen wurden verworfen.
Differenzierung von Makrophagen unter dem Einfluss von CCL2 und CCL5
Um den Einfluss von CCL2 und CCL5 (9.2.3) auf die Differenzierung von MdM zu prüfen, wurde den Monozyten zu Beginn der Differenzierung bovines rekombinantes CCL2, CCL5 oder beide Chemokine in einer finalen Konzentration von 100 nmol/L zugesetzt. Alle Ansätze
