Mit Hilfe der Antikörper MAC387 und AM-3K wurden zwei verschiedene Makrophagensubtypen in bovinem Zitzengewebe nachgewiesen. Durch das Anfertigen von
Serienschnitten konnte gezeigt werden, dass die Antikörper ein einfach positives Färbemuster mit nahezu keinen doppelt positiven Zellen zeigten. Zellen, die MAC387-positiv waren, waren nicht AM-3K-positiv und solche, die AM-3K-positiv waren, waren nicht MAC387-positiv. Makrophagen in situ nehmen also entweder den einen oder den anderen Phänotypen an, Mischtypen kommen nicht vor. Makrophagen differenzieren aus Monozyten, die auf einen chemotaktischen Reiz hin ins Gewebe einwandern. Eine Hypothese zur Entstehung von Makrophagensubtypen ist, dass sich diese Makrophagen im weiteren Verlauf in pro- oder inflammatorische Makrophagen entwickeln, je nachdem, ob sie von einem pro- oder anti-inflammatorischen Wirtsmillieu umgeben sind. Ein weiterer Erklärungsansatz für die beobachteten verschiedenen Makrophagensubtypen besteht darin, dass durch das vorherrschende Chemokin- und Zytokinmillieu im Zielwirtsgewebe bereits nur bestimmte Monozytensubtypen aus dem Blut ins Gewebe auswandern. Diese unterschiedlichen Monozytensubtypen differenzieren direkt weiter zu verschiedenen spezifischen Makrophagensubtypen ohne gemeinsamen Makrophagen-Vorläufer. Das Vorhandensein dieser ausschließlich einfach positiven Makrophagen in bovinem Zitzengewebe spricht dafür, dass das Millieu an sezernierten Zytokinen und Chemokinen in bovinem Zitzengewebe nicht durchweg einheitlich ist. Die Ausschüttung verschiedener Portfolios an Faktoren führte vermutlich je nach vorherrschendem Wirtsmillieu zur Entstehung der MAC387-positiven oder der AM-3K-positiven Makrophagen. Dieses exklusive Färbemuster für MAC387- und AM-3K-positive Zellen deckt sich mit DUEVEL (2010), die ebenso nahezu ausschließlich einfach MAC387- oder AM-3K-positive Zellen in bovinem Zitzengewebe fand. Diese klare Abgrenzung in der Nachweisbarkeit der Makrophagensubtypen weist überdies auf die funktionelle Heterogenität hin. Es wurde beschrieben, dass es sich bei AM-3K-positiven Makrophagen um Makrophagen im späten Differenzierungsstadium (M2-Makrophagen) handelt (ZENG et al. 1996; YAMATE et al. 2000), wohingegen MAC387-positive Makrophagen mit frisch rekrutierten, Monozyt-ähnlichen Makrophagen (M1-Makrophagen) genannt wurden (STRIZ u. TREBICHAVSKI 2004).
Das Zitzenepithel als Innenauskleidung der Zitze stellt die erste Barriere gegen galaktogen eindringende Erreger dar. In Anbetracht der besonderen Bedeutung von Makrophagen für die Initiierung der Entzündung durch Sekretion von Neutrophilen-Chemokinen wurde das Vorhandensein von Makrophagensubtypen in dieser Detaillokalisation genauer analysiert.
Das perivaskuläre Gewebe als Ort der Emigration von Monozyten aus dem Blutstrom in das Zielgewebe und nachfolgend der Differenzierung in Makrophagen wurde als zweite wichtige Detaillokalisation auf die gleiche Weise untersucht. Das Vorkommen AM-3K-positiver und MAC387-positiver Zellen in den Detaillokalisationen subepitheliales und perivaskuläres Gewebe wurde analysiert, um ein genaueres Bild vom Verteilungsmuster der Makrophagensubtypen in für die Erregerbekämpfung wichtigen Bereichen der Zitze zu bekommen. AM-3K-positive und MAC387-positive Zellen zeigten ein differenzielles Färbemuster im Hinblick auf die Detaillokalisation; so waren AM-3K-positive Zellen signifikant häufiger perivaskulär als subepithelial zu finden, während MAC387-positive
MAC387-positiver Zellen im subepithelialen Bereich ist es denkbar, dass dieser Makrophagensubtyp eine Rolle in der initialen Erregerbekämpfung spielt durch die Ausschüttung von Chemokinen, welche neutrophile Granulozyten in das subepitheliale Gewebe locken, welche wiederum für die rasche Erregereliminierung von entscheidender Bedeutung sind. AM-3K-positive Makrophagen hingegen waren hauptsächlich im perivaskulären Gewebe ansässig, sodass dieser Subtyp weniger bedeutend für die initiale Phase der Entzündung scheint. Diese Unterschiede im Verteilungsmuster AM-3K-positiver und MAC387-positiver Zellen im subepithelialen und perivaskulären Gewebe sind in Übereinstimmung mit DUEVEL (2010).
Dem Gewebe der Fürstenberg’schen Rosette und der Zitzenzisterne kommt besondere Bedeutung für die Immunabwehr der Zitze zu, da hier der erste direkte Kontakt des Erregers mit dem Wirtsgewebe stattfindet. Diese beiden Lokalisationen wurden in Bezug auf Vorhandensein und Verteilung von Makrophagensubtypen einander gegenübergestellt. Das Verteilungsmuster und auch die relative Anzahl der beobachteten Makrophagensubtypen unterschieden sich nicht zwischen der Fürstenberg’schen Rosette und der Zitzenzisterne. Dies lässt auf ein gleichartiges Muster an sezernierten Chemokinen und Zytokinen in diesen beiden Lokalisationen der bovinen Zitze schließen und folglich auch auf ein gleichartiges Verteilungsmuster AM-3K-positiver und MAC387-positiver Zellen. Im Vergleich zur Zitzenzisterne sind Leukozyten in größerer Anzahl am distalen Ende der Zitzenzisterne am Übergang zum Strichkanal (Fürstenberg’sche Rosette) zu finden. Lymphozyten und Monozyten sind die vorherrschenden Zelltypen in der epithelialen Auskleidung der Zitzenzisterne. Jedoch beruht die Zunahme an Leukozyten im Bereich der Fürstenberg’schen Rosette hauptsächlich auf Plasmazellen, die den vorherrschenden Zelltyp im subepithelialen Bindegewebe darstellen (NICKERSON u. PANKEY 1983).
Aufgrund des gehäuften Auftretens besonders schwerer Formen der Mastitis in der peripartalen Periode liegt die Vermutung nahe, dass Kühe in der Phase um die Geburt ein gegenüber der Mittlaktation verändertes Portfolio an Immunzellen in der Zitze besitzen.
Daher wurden die Anwesenheit und das Verteilungsmuster verschiedener Makrophagensubtypen zwischen mittlaktierenden und peripartalen Kühen verglichen. Bei AM-3K-positiven Makrophagen wurde kein Unterschied im Verteilungsmuster festgestellt.
Für MAC387 hingegen war in peripartalen Kühen ein deutlicher Anstieg positiver Zellen gegenüber mittlaktierenden Kühen zu verzeichnen. Denkbar ist, dass durch eine hormonell bedingte Dysregulation der Immunantwort in dem Zeitraum um die Geburt zwar mehr MAC387-positive Zellen in die Zitze einwandern, diese jedoch in ihrer Funktion gehemmt sind. So ist in der letzten Woche vor der Geburt zwar die Anzahl an Makrophagen im Zitzengewebe am höchsten, jedoch haben die Zellen eine verringerte Phagozytosekapazität (SORDILLO u. STREICHER 2002b). Diese kann bspw. durch eine Abnahme der IgM-Konzentration im Milchdrüsensekret bedingt sein (WALLER 2000). In mittlaktierenden Kühen könnten auf der anderen Seite die im Zitzengewebe in geringerer Anzahl präsenten MAC387-positiven Makrophagen einen größeren protektiven Effekt gegenüber einwandernden Keimen ausüben. Ein möglicher Erklärungsansatz für das gleichbleibende
Verteilungsmuster AM-3K-positiver Makrophagen in mittlaktierenden und peripartalen Kühen könnte sein, dass dieser Makrophagensubtyp keine primäre Bedeutung für die Erregereliminierung, sondern vielmehr eine Rolle in der Resolution der Entzündung und Wiederherstellung der Homöostase spielt. Übereinstimmend damit wird in der Literatur AM-3K-positiven Makrophagen eine anti-inflammatorische Rolle zugeschrieben (PHILIPPIDIS et al. 2004).
Der Antikörper MAC387 erkennt den Heterokomplex aus S100A8 und S100A9 (BRANDTZAEK et al. 1988), der als S100A8/A9 oder Calprotectin bezeichnet wird.
S100A8/A9 ist Bestandteil von neutrophilen Granulozyten und Monozyten. Residente Gewebemakrophagen gelten als S100A8/A9-negativ (ROTH et al. 1992). Die intrazelluläre Expression von S100A8/A9 in humanen Monozyten wird durch IL-1β, TNF-α und LPS induziert (STRIZ u. TREBICHAVSKI 2004; KIDO et al. 2005). Die S100A8/A9-Expression in Makrophagen wird mit frisch rekrutierten, Monozyten-ähnlichen Makrophagen unter pro-inflammatorischen Bedingungen (M1-Makrophagen) assoziiert (STRIZ u. TREBICHAVSKI 2004). Damit könnten die beim Rind nachgewiesenen MAC387-positiven Makrophagen stimulierte Zellen darstellen. Eigene Differenzierungsstudien, in denen unter dem Einfluss von Monozyten-stimulierenden Chemokinen Makrophagen in vitro generiert wurden, sprechen allerdings gegen diese Hypothese (siehe 5.5). Des Weiteren waren MAC387-positive Makrophagen negativ für MHC-Klasse-II (siehe unten), was als weiteres Indiz gegen diese Theorie gewertet werden kann, wenn man davon ausgeht, dass eine verstärkte MHC-Klasse-II-Expression auf aktivierten Makrophagen zu beobachten ist (KAMPHORST et al.
2010). Gleichzeitig stellt sich die Frage, ob die eher perivaskulär lokalisierten AM-3K-positiven Makrophagen dann die eigentlichen Gewebsmakrophagen darstellen. Für diese Hypothese spricht das gleichbleibende Verteilungsmuster AM-3K-positiver Makrophagen unabhängig vom Laktationsstadium. So wurden keine Unterschiede in der Anzahl und Lokalisation AM-3K-positiver Makrophagen zwischen mittlaktierenden und peripartalen Kühen festgestellt (siehe oben). Jedoch sind AM-3K-positive Zellen vermehrt perivaskulär zu finden. Dies könnte darauf hindeuten, dass sie wichtige Schaltstellen darstellen, die Signale von Epithel-nahen Zellen in Signale umwandeln, die zur Rekrutierung von Zellen führen, welche für die Resolution einer Entzündung wichtig sind. Wenn AM-3K-positive Makrophagen die eigentlichen Gewebsmakrophagen darstellen, würde dies ebenso bedeuten, dass aus diesen Zellen durch Stimulation mit inflammatorischen Molekülen oder bakteriellen Produkten (z. B. LPS; sog. M1-Stimuli) die oben beschriebenen MAC387-positiven und AM-3K-negativen Makrophagen entstehen. In einem gerade zur Revision eingereichten Paper von Duevel et al. wurde versucht, diese Frage zu beantworten. In-vitro-Differenzierungsstudien konnten zeigen, dass bovine Monozyten S100A8/A9 stark und CD163 hingegen nur schwach exprimieren. Im Laufe der Differenzierung in bovine Makrophagen wird die S100A8/A9-Expression herunterreguliert, wohingegen die S100A8/A9-Expression von CD163 während der In-vitro-Differenzierung verstärkt wird. Diese Zeitkinetik der Expression von S100A8/A9 und von CD163 während der Differenzierung von Monozyten zu Makrophagen in vitro spricht klar
Makrophagen durch Stimulation z. B. mit LPS MAC387-positive AM-3K-negative Makrophagen entstehen können.
Blickt man auf die Funktion von S100A8/A9, so ist eine Beteiligung an einer Vielzahl inflammatorischer Prozesse zu finden. Zahlreiche Studien konnten eine exzellente Korrelation des Serumspiegels von S100A8/A9 mit der entzündlichen Aktivität in Patienten mit rheumatoider Arthritis (RA) belegen (BRUN et al. 1994; KANE et al. 2003). Aktivierte S100A8/A9-positive Makrophagen befinden sich unter den ersten Zellen, die bei RA-Patienten in die entzündeten Bereiche des Synoviums einwandern (ODINK et al. 1987b;
ZWADLO et al. 1988b). Neben der RA wird eine Beteiligung von S100A8/A9 u.a. in juveniler idiopathischer Arthritis (FROSCH et al. 2000), systemischem Lupus erythematosus (HAGA et al. 1993; FROSCH et al. 2004), der Inflammatory Bowel Disease, Morbus Crohn und ulzerativer Colitis (LUGERING et al. 1995; TIBBLE u. BJARNASON 2001) assoziiert.
Diesem Heterokomplex aus S100A8 und S100A9 werden jedoch nicht nur pro-inflammatorische, sondern auch anti-inflammatorische Eigenschaften zugeschrieben. So wird die Expression von S100A8/A9 in den späten Phasen einer Entzündung durch IL-10 induziert.
Eine Vielzahl anti-inflammatorischer Eigenschaften wie die Bindung von Reaktiven Sauerstoffspezies und die Chelatbildung mit Zink legen daher eine Bedeutung von S100A8/A9 für die Resolution einer Entzündung nahe (PERERA et al. 2010).
Der Scavenger Rezeptor CD163, der als Ligand für AM-3K fungiert, bindet und beseitigt im Blut befindliche Hämoglobin-Hapotglobin-Komplexe. Dieser restriktiv auf Makrophagen exprimierte Rezeptor wird der späten anti-inflammatorischen Antwort zugeordnet (HOGGER et al. 1998; YAMATE et al. 2000; KRISTIANSEN et al. 2001). Die Sekretion anti-inflammatorischer Proteine von Makrophagen ist mit CD163 assoziiert (PHILIPPIDIS et al.
2004). AM-3K-positiven Makrophagen ist daher eine anti-inflammatorische Rolle (M2-Makrophagen) zuzuschreiben. Neben diesen anti-inflammatorischen Eigenschaften ist CD163 jedoch auch an der Produktion pro-inflammatorischer Zytokine beteiligt; eine Kreuzvernetzung von CD163 mit CD163-spezifischen monoklonalen Antikörpern induziert die Sekretion von NO, IL-1β, IL-6 und TNF-α (VAN DEN HEUVEL et al. 1999; POLFLIET et al. 2006). Zusammenfassend werden dem Scavenger Rezeptor CD163 sowohl pro- als auch anti-inflammatorische Eigenschaften zugeschrieben, dieser kann daher als Immunmodulator bezeichnet werden.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die beiden hier nachgewiesenen Makrophagen-assoziierten Proteine CD163 und S100A8/A9 multifunktionale Moleküle sind und deren Nachweis nicht automatisch auf deren momentane Rolle in einem Entzündungsprozess schließen lässt. Mithin kann die alleinige Expression von S100A8/A9 oder CD163 nicht als Kriterium für die funktionellen Eigenschaften der in bovinem Zitzengewebe lokalisierten Makrophagensubtypen herangezogen werden.
Exemplarisch für Einzeltiere wurden Zitzengewebeschnitte mit MHC-Klasse-II markiert. Die deutlich überwiegende Anzahl MAC387-positiver Makrophagen war negativ für MHC-Klasse-II. Die Expression von MHC-Klasse-II auf der Zellmembran von Monozyten und Makrophagen wird bei erfolgter Aktivierung heraufreguliert (KAMPHORST et al. 2010). Die
fehlende MHC-Klasse-II-Expression in MAC387-positiven Makrophagen spricht gegen einen aktivierten Zustand dieser Zellen und ist als weiteres Indiz gegen die Hypothese zu sehen, dass es sich bei MAC387-positiven Makrophagen um stimulierte Zellen handelt. Dies ist in Übereinstimmung mit FITZPATRICK et al. (1992) und MALLARD et al. (1998), die peripartal eine verringerte MHC-Klasse-II-Expression in bovinen Makrophagen nachwiesen.
In einer Studie über die Expression verschiedener Zelltypen in porzinem Milchdrüsengewebe war hingegen die Anzahl MHC-Klasse-II-positiver Zellen um die Geburt, während der Mittlaktation und nach dem Absetzen unverändert (MAGNUSSON 1999).
5.2 Expression ausgewählter Chemokine und Proteine in bovinem Zitzengewebe