auf funktionelle Unterschiede zwischen den Monozyten. GOFF et al. (1996) fanden Unterschiede in der Adhäsion boviner Monozyten an Plastik. Diejenigen Zellen, die nach drei Stunden nicht adhärent waren, produzierten nach Zytokin-Stimulation dreimal mehr NO je Zelle als die adhärente Monozyten-Population.
Üblicherweise werden Monozyten anhand ihrer Expression von CD14 identifiziert und mit CD14-spezifischen Antikörpern magnetisch separiert (HANLEY et al. 2004; VERRECK et al. 2004). Mit dieser Methode können Monozyten in einer Reinheit von mindestens 95%
erfasst werden, bei guter Vitalität und geringer Voraktivierung der Zellen. Der Nachteil dieser Methode besteht jedoch darin, dass CD14-negative oder schwach positive Monozyten mit
dieser Methode nicht erfasst werden und dem Untersucher nicht für nachfolgende Analysen zur Verfügung stehen. Somit kommt es möglicherweise zu Missinterpretationen der Ergebnisse, da nur CD14-positive, nicht aber CD14-negative oder schwach positive Monozyten in der Versuchsdurchführung erfasst werden. CD172a (SIRPα) hingegen wird ubiquitär auf Monozyten und neutrophilen Granulozyten des peripheren Blutes exprimiert (VAN BEEK et al. 2005). Für die in der vorliegenden Arbeit durchgeführte Charakterisierung monozytärer Subpopulationen des Rindes wurden daher mononukleäre Zellen des Blutes in einem ersten Schritt von polymorphkernigen Granulozyten (neutrophilen Granulozyten) separiert. Nachfolgend wurden bovine Monozyten anhand ihrer CD172a-Expression durchflusszytometrisch erfasst. In Vorversuchen konnte gezeigt werden, dass das CD172a-Molekül nicht auf anderen bovinen mononukleären Zellen exprimiert wird. Dies schloss explizit die Expression auf T-Zellen, B-Zellen und NK-Zellen aus, sodass mit sehr hoher Wahrscheinlichkeit davon ausgegangen werden kann, dass bovines CD172a selektiv auf Monozyten exprimiert wird. MORENO et al. (2010) machten sich für Studien über porzine monozytäre Subpopulation ebenso die Monozyten-exklusive CD172a-Expression in mononukleären Zellen des Blutes zu Nutzen. Ihr Ansatz war jedoch indirekt: sie führten eine magnetische Zellseparation mononukleärer Zellen mit einem Gemisch aus monoklonalen Antikörpern gegen CD3, CD8α und CD45RA durch und konnten in der T-, B- und NK-Zell-depletierten Zellsuspension mehr als 95% CD172a-positive Zellen erzielen. WATERS et al.
(2009) wiesen in einem Gewebekultur-Modell die essentielle Bedeutung der Expression von CD172a auf Makrophagen für die Formation vielkerniger Riesenzellen aus diesen im Kontext der bovinen Tuberkuloseinfektion nach. CD172a-positive Zellen zeigten dendritische Zell-/Makrophagen-Morphologie, phagozytierten lebendes Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guerin (BCG) und koexprimierten u.a. MHC-Klasse-II und CD80/86. All dies weist darauf hin, dass aus CD172a-positiven Monozyten funktionelle Makrophagen entstehen können.
Bovine CD172a-positive Monozyten konnten in einem nächsten Schritt anhand ihrer Expression von CD14 in CD14-positive und CD14-negative Monozyten eingeteilt werden.
CD14-positive Monozyten stellten mit 71,8% den Hauptteil der Monozyten, während 28,4%
der Monozyten CD14-negativ oder sehr schwach positiv waren. Monozyten-Subpopulationen sind in der Literatur bisher für Mensch, Maus und Schwein beschrieben. So werden humane Monozyten anhand ihrer CD14- und CD16-Expression in drei Subpopulationen eingeteilt:
klassische (CD14++CD16-), intermediäre (CD14++CD16+) und nicht-klassische Monozyten (CD14+CD16++). Klassische Monozyten stellen mit etwa 90% die größte Subpopulation unter den Monozyten dar. Die nicht-klassischen Monozyten entsprechen aufgrund ihrer sehr schwachen Expression von CD14 den in der vorliegenden Arbeit charakterisierten bovinen CD14-negativen Monozyten. Murine Monozyten werden anhand ihrer Expression von Ly6C und CD62L in zwei verschiedene Subpopulationen eingeteilt: klassische ‚inflammatorische‘
GR1+ Monozyten (Ly6ChiCD62L+), die humanen CD14++CD16- Monozyten entsprechen, und nicht-klassische ‚residente‘ GR1- Monozyten (Ly6CloCD62L-) analog zu humanen
klassische murine Monozyten nur zu ca. 50% zu den Monozyten des Blutes bei. Beim Schwein werden Monozyten-Subpopulationen basierend auf ihrer differenziellen CD163-Expression charakterisiert. Porzine CD163- und CD163+ Monozyten unterscheiden sich in der Expression von Zelloberflächenmolekülen, dem Portfolio der Zytokinproduktion und der Empfänglichkeit für Virusinfektionen (SANCHEZ et al. 1999; CHAMORRO et al. 2000;
SANCHEZ-TORRES et al. 2003; CHAMORRO et al. 2004). Die CD163- Subpopulation entspricht hierbei den klassischen Monozyten des humanen und murinen Systems, CD163+ Monozyten sind als Analogon zu nicht-klassischen Monozyten zu sehen.
Im Folgenden wurde der Frage nachgegangen, ob sich die beiden bovinen Monozyten-Subpopulationen funktionell unterschiedlich verhalten. Der wesentliche Unterschied bestand in der stärkeren Aktivierbarkeit von CD14-positiven Monozyten durch CCL5. Obwohl keine Antikörper zum Nachweis der Expression von CCL5-Rezeptoren zur Verfügung standen, deutet dieses Ergebnis darauf hin, dass die CD14-positive Subpopulation monozytärer Zellen des Rindes die Rezeptoren für CCL5 (CCR1 und CCR5) stärker oder selektiv exprimieren als CD14-negative Monozyten. Die selektive Expression von Chemokinrezeptoren auf monozytären Subpopulationen wird ebenso in der Literatur für humane und murine Monozyten beschrieben. Während die humanen CD14++CD16- Monozyten den CC-Chemokin-Rezeptor 2 (CCR2) und CCR6 für die Migration aus dem Blut verwenden (SOEHNLEIN u. LINDBOM 2010), ist die Migration der CD14+CD16++ Monozyten ins Gewebe ausschließlich CX3CL1-vermittelt (ANCUTA et al. 2003). CD14++CD16+
Monozyten stellen zwar mit der Expression von CCR2 und CX3CR1 einen intermediären Phänotyp dar, sie können jedoch klar von CD14++CD16- und CD14+CD16++ Monozyten anhand ihrer selektiven Expression von CCR5 abgegrenzt werden (ANCUTA et al. 2003;
ROGACEV et al. 2011). Letzteres deckt sich mit der selektiven Stimulierbarkeit boviner CD14+ Monozyten durch CCL5. Murine klassische Monozyten zeigen ebenso wie humane klassische Monozyten eine hohe Expression an CCR2 bei gleichzeitig niedriger CX3CR1-Expression. Nicht-klassische murine Monozyten exprimieren wiederum stark CX3CR1 bei Abwesenheit von CCR2 (SOEHNLEIN u. LINDBOM 2010). Bei zusätzlicher Betrachtung der Expression von Tük4 und SLA-II auf porzinen Monozyten wurde festgestellt, dass CD163-Tük4+SLA-II- Monozyten, nicht jedoch CD163+Tük4-SLA-II+ Monozyten porzines CCL2 binden und zu diesem Chemokin hinwandern, analog dazu wurde in diesen Zellen CCR2 auf der mRNA-Ebene nachgewiesen (MORENO et al. 2010). Auch die Expression von CCR5 ist in porzinen Monozyten-Subpopulationen mit denen von Mensch und Maus vergleichbar niedrig (ANCUTA et al. 2003).
Die unterschiedlichen Monozytensubpopulationen zeigen auch in anderen Systemen klare funktionelle Unterschiede. Analog zu humanen CD16-positiven Monozyten produzieren porzine CD163+Tük4-SLA-II+ Monozyten höhere Mengen an TNF-α und besitzen ein größeres Potenzial der Antigenpräsentation (CHAMORRO et al. 2000; CHAMORRO et al.
2005). Eine klare funktionelle Trennung dieser verschiedenen Subpopulationen ist jedoch nicht immer möglich. So produzieren humane klassische Monozyten IL-10 nach
LPS-Stimulation, wohingegen murine klassische Monozyten pro-inflammatorische Zytokine wie TNF-α und IL-1 produzieren (SOEHNLEIN u. LINDBOM 2010).
Die Stimulation boviner CD14-positiver Monozyten führte nicht zu einer Aktivierung aller Zellen (Abbildung 29). Möglicherweise wird der CCR5 nicht auf allen Zellen gleichmäßig stark exprimiert und Zellen, die zu wenige Rezeptoren exprimieren, werden nicht ausreichend stimuliert. Wahrscheinlicher ist jedoch, dass die Population boviner CD14-positiver Monozyten ein Gemisch der aus den humanen System bekannten Populationen von CD14++CD16+ und CD14++CD16- Monozyten darstellt. Während die CD14++CD16+
Zellen den CCR5 exprimieren, fehlt die CCR5-Expression auf CD14++CD16- Monozyten (ANCUTA et al. 2003; ROGACEV et al. 2011).
In der Annahme (für die in dieser Arbeit erste Hinweise erhalten wurden), dass bovine Monozyten-Subpopulationen analog zum humanen System eingeteilt werden können, lässt sich erklären, weshalb innerhalb der CD14-positiven Population nicht alle Zellen durch CCL5 aktivierbar waren. Diejenigen Zellen, die nicht mit einer Erhöhung der intrazellulären Calciumkonzentration reagierten, hatten möglicherweise einen CD14++CD16- Phänotypen, welcher keinen Rezeptor für CCL5 exprimiert. Des Weiteren kann die fehlende Aktivierbarkeit der CD14-negativen Monozyten ebenso auf eine fehlende Expression von CCR1 und CCR5 zurückzuführen sein.
5.5 Chemokin-vermittelte Effekte auf die In-vitro-Differenzierung boviner Monozyten