Chemokin-vermittelte Effekte auf die In-vitro-Differenzierung boviner Monozyten

Weise verschiedene Makrophagentypen entstehen ist immer noch sehr strittig. Hier wurde der Frage nachgegangen, ob Wirtsfaktoren die Differenzierung einwandernder Monozyten beeinflussen. Da Chemokine die ersten Mediatoren sind, welche Monozyten veranlassen in ein bestimmtes Gewebe einzuwandern, fokussierten sich die Studien auf den Einfluss von CCL2 und CCL5 auf die gerichtete Differenzierung boviner Makrophagen in vitro.

Effekte auf den Phänotyp in-vitro-differenzierter boviner Makrophagen

Im Verlauf der Differenzierung boviner Monozyten ohne Chemokinzusatz (Medium-MdM) nahm die CD163-Expression stetig zu, während die S100A8/A9-Expression über die Zeit abnahm. Monozyten hatten an Tag 0 einen S100A8/A9^highCD163^low-Phänotyp, der sich bei Tag 7 Makrophagen in einen S100A8/A9^lowCD163^high-Phänotyp änderte. Dies könnte bedeuten, dass S100A8/A9 als Marker für frisch rekrutierte Makrophagen angesehen werden könnte, der im Verlauf der Differenzierung verloren geht, während CD163 eher in gereiften Makrophagen und weniger stark in Monozyten und frisch ins Gewebe migrierten Makrophagen vorkommt. Dies ist konform mit Angaben in der Literatur: in Monozyten wird S100A8/A9 stark exprimiert, welches während der In-vitro-Differenzierung zu Makrophagen jedoch deutlich herunterreguliert wird (ZWADLO et al. 1988b; ROTH et al. 1992).

S100A8/A9-positive Makrophagen werden als frisch rekrutierte, Monozyten-ähnliche

hingegen ist beschrieben, dass es sich um Makrophagen im späten Differenzierungsstadium (M2 Makrophagen) handelt (ZENG et al. 1996; YAMATE et al. 2000). Dieser Pfad der Differenzierung scheint sich auch nicht in Anwesenheit von klassischen Entzündungsmediatoren zu ändern. Nach einer in Revision befindlichen Studie von DUEVEL et al. (2012) erfolgte die Expression der beiden Proteine während der In-vitro-Differenzierung unter dem Einfluss von Prostaglandin E₂ (PGE₂) in gleicher Weise von S100A8/A9^highCD163^low-Monozyten zu S100A8/A9^lowCD163^high-Makrophagen.

Der Zusatz von Chemokinen zu Monozyten änderte diesen in der Literatur beschriebenen Differenzierungspfad jedoch drastisch: differenzierten die Monozyten unter CCL2 oder CCL5 aus, so führte dies zu einer signifikanten Zunahme der Expression von S100A8/A9 über die Dauer der Differenzierung (Abbildung 30), während sich umgekehrt die Expression von CD163 nahezu nicht änderte bzw. signifikant geringer war als in Medium-MdM (Abbildung 31). Dies belegt zunächst, dass S100A8/A9 nicht nur ein Molekül früher, jugendlicher Monozyten-ähnlicher Makrophagen darstellt, sondern auch in reifen Makrophagen exprimiert sein kann. Denkbar ist, dass die Stimulation mit CCL2 oder CCL5 zu Makrophagen mit pro-inflammatorischem Phänotyp führt, sodass S100A8/A9, dem pro-inflammatorische Eigenschaften zugeschrieben werden (siehe 5.1), heraufreguliert wird und die Expression von CD163, welches eher mit anti-inflammatorischen Eigenschaften in Verbindung gebracht wird (siehe 5.1), herunterreguliert wird. Auf die Frage der Korrelation zwischen Phänotyp und Funktion wird weiter unten bei der Besprechung der Genexpression in Makrophagen noch genauer eingegangen. Studien über die Effekte von Chemokinen auf den Phänotyp von Monozyten/Makrophagen sind rar. Im Gegensatz zu der oben genannten Hypothese wird eine Rolle von CCL2 in der Induktion von M2-Makrophagen beschrieben. ROCA et al. (2009) untersuchten den Einfluss von CCL2 auf die Expression des Mannose-Rezeptors CD206 in CD14-positiven Monozyten und fanden eine mehr als zweifache Heraufregulation des Rezeptors, der als M2-Marker gilt. In diesem Experiment wurden die Zellen für 48 Stunden mit 100 ng/mL CCL2 inkubiert. Dies ist die ca. neunfach geringere Menge an CCL2, das in der vorliegenden Arbeit eingesetzt wurde, sodass diese gegenläufigen Beobachtungen eventuell als Konzentrationseffekte anzusehen sind. Darüber hinaus wird für CCL2 eine Beteiligung sowohl in der Initiation einer Entzündung durch Anlockung pro-inflammatorischer Monozyten als auch in der Resolution durch Beendigung des Leukozyteneinstroms beschrieben (SOEHNLEIN u. LINDBOM 2010). Die Rolle von CCL5 in einer Entzündung wird in der Literatur ebenfalls kontrovers diskutiert. In einer Studie über die Polarisierung von Alveolarmakrophagen (AM) bei Rauchern wurde gezeigt, dass AM von Rauchern durch Herunterregulation von M1-verwandten pro-inflammatorischen Genen gekennzeichnet waren. Unter den herunterregulierten Genen befand sich CCL5, das hier also im Kontext mit pro-inflammatorischen M1-Makrophagen genannt wird (SHAYKHIEV et al.

2009). CCL5 wird unter anderem aus apoptotischen neutrophilen Granulozyten freigesetzt, sodass an anderer Stelle die Rolle von CCL5 eher in der Resolution einer Entzündung durch Beendigung des Leukozyteneinstroms gesehen wird (ARIEL et al. 2006).

Die Differenzierung boviner Monozyten in der simultanen Anwesenheit von CCL2 und CCL5 erbrachte keinen synergistischen oder additiven Effekt auf die Expression von S100A8/A9 und CD163. Unter CCL2+5 differenzierte Makrophagen verhielten sich in der Expression o.g.

Proteine wie Makrophagen, die unter jeweils nur einem Chemokin differenzierten.

Vermutlich spielt es für die Steuerung der Differenzierung boviner Monozyten hin zu S100A8/A9^highCD163^low-Makrophagen nicht die entscheidende Rolle, welcher der Chemokinrezeptoren für CCL2 und CCL5 aktiviert wird, sondern dass einer oder mehrere dieser Chemokinrezeptoren aktiviert werden.

In den Versuchen zur Chemokin-induzierten intrazellulären Calciumerhöhung boviner Monozyten zeigte CCL2 im Gegensatz zu CCL5 nahezu keine Potenz, bovine Monozyten zu aktivieren (4.4.2). In den durchgeführten In-vitro-Differenzierungsstudien führte die Differenzierung in Anwesenheit von CCL2 jedoch zu einer nahezu identischen Änderung der Expression von S100A8/A9 und CD163 auf Makrophagen wie CCL5 (siehe oben). Dieser Wiederspruch – auf der einen Seite das fehlende Aktivierungspotenzial von CCL2 in frisch separierten Monozyten, auf der anderen Seite die deutliche Änderung des Makrophagen-Phänotyps bei In-vitro-Differenzierungsstudien – ist vermutlich darin begründet, dass CCR2, der Rezeptor für CCL2, erst im Verlauf der Differenzierung boviner Monozyten stärker exprimiert wird. Bovine Monozyten, die aufgrund des fehlenden Rezeptors kaum auf CCL2 ansprechen, werden zu Makrophagen, die CCR2 im Verlauf der Reifung stärker exprimieren und somit durch CCL2 aktiviert werden können. Im humanen System ist die Expression von CCR2 auf Monozyten jedoch nachgewiesen, diese wird im Verlauf der Reifung zu Makrophagen herunter- und die Expression von CCR1 und CCR5 heraufreguliert (FANTUZZI et al. 1999; KAUFMANN et al. 2001). Analog dazu geht die Differenzierung boviner Monozyten in Makrophagen mit einer gesteigerten Expression von CCR5 und einer verminderten Expression von CCR2 auf mRNA-Ebene einher (WIDDISON et al. 2010). Vor diesem Hintergrund ist die Hypothese, dass CCR2 im Verlauf der Differenzierung boviner Monozyten stärker exprimiert wird, eher unwahrscheinlich. Ein wahrscheinlicherer Erklärungsansatz ist, dass im bovinen System die Bindung von CCL2 an seinen Rezeptor CCR2 ohne Erhöhung der intrazellulären Calciumkonzentration einhergeht. CCR2 kommt in zwei Isoformen vor, CCR2A und CCR2B, die sich nur in ihrem C-terminalen Ende unterscheiden (CHARO et al. 1994). CCR2A wird als Hauptisoform auf mononukleären Zellen und Zellen der glatten Gefäßmuskulatur exprimiert, während Monozyten und aktivierte NK-Zellen vorrangig CCR2B exprimieren. Die CCL2-vermittelte Chemotaxis geschieht in CCR2A-positiven Zellen ohne Calciummobilisierung, in CCR2B-positiven Zellen wird jedoch Calcium freigesetzt (SANDERS et al. 2000; CHO et al. 2007). Möglicherweise wird CCR2A überwiegend auf den Monozyten des Rindes exprimiert, sodass die beobachteten CCL2-vermittelten Effekte in bovinen Monozyten hauptsächlich ohne Erhöhung der intrazellulären Calciumkonzentration stattfinden. Eine Expressionsstudie auf mRNA-Ebene könnte helfen, diese Fragen zu klären, wurde in dieser Arbeit jedoch nicht durchgeführt.

Effekte auf die Genexpression in-vitro-differenzierter boviner Makrophagen

Um den funktionellen Phänotyp der in-vitro-differenzierten Makrophagen zu charakterisieren, wurde die Expression von Genen, die für die klassische Aktivierung von Makrophagen stehen (iNOS, IL-12), und von solchen, die der alternativen Aktivierung zugeordnet werden (Arginase, IL-10) (GORDON 2003), sowie von CXCL1 und CXCL8 als neutrophile Granulozyten-aktivierende Chemokine gemessen. Dies geschah in unstimulierten und LPS-stimulierten Zellen. LPS wurde eingesetzt, da es die Genexpression in Makrophagen direkt aktiviert (BOLDRICK et al. 2002; NAU et al. 2002).

Die Anwesenheit von CCL2 oder CCL5 während der Differenzierung boviner Makrophagen (CCL2-MdM, CCL5-MdM) hatte keinen Einfluss auf die Basisexpression von iNOS und IL-12. Diese war im Vergleich zu Medium-differenzierten Makrophagen (Medium-MdM) unverändert niedrig. Aufgrund dieser unveränderten Basisexpression von iNOS und IL-12 scheinen CCL2 und CCL5 nicht im Sinne einer klassischen Aktivierung auf in-vitro-differenzierte Makrophagen zu wirken. Die Stimulation mit LPS führte in Medium-MdM zu einer Hochregulation der Expression von iNOS sowie IL-12. In LPS-stimulierten CCL2- und CCL5-MdM wurde keine veränderte Genexpression im Vergleich zu unstimulierten CCL2/CCL5-MdM gemessen. Dies bedeutet, dass CCL2 und CCL5 die Zellen LPS-insensitiv gemacht haben.

Ein fast identisches Muster der Genexpression konnte für Arginase und IL-10 gemessen werden. Auch für diese beiden Gene, die als Indikatoren für eine alternative Aktivierung von Makrophagen gelten (GORDON 2003), wurde in CCL2- und CCL5-MdM keine veränderte Basisexpression ermittelt. Daraus kann geschlossen werden, dass CCL2 und CCL5 auch nicht im Sinne einer alternativen Aktivierung auf in-vitro-differenzierte Makrophagen wirken.

Zudem wurde die Expression der beiden Gene nach LPS-Stimulation nicht wie in den Medium-MdM gesteigert. Somit scheint es durch die beiden Chemokine zu einem Phänomen gekommen zu sein, welches an die Endotoxin-Toleranz von Makrophagen erinnert, da sich die Genexpression in CCL2- und CCL5-MdM im Gegensatz zu Medium-MdM durch LPS nicht steigern ließ. Endotoxin-Toleranz (ET) ist ein Phänomen, bei dem Zellen, die niedrigen Konzentrationen von Endotoxinen (z. B. LPS) ausgesetzt sind, in einen vorübergehenden refraktären Zustand übergehen, in dem sie nicht auf nachfolgende Endotoxin-Stimulationen reagieren können. Sie entwickeln eine Art Toleranz gegenüber Endotoxin (BISWAS u.

LOPEZ-COLLAZO 2009). Monozyten/Makrophagen sind diejenigen Zellen, die in vivo hauptsächlich für die Endotoxin-Toleranz verantwortlich sind (CAVAILLON u. ADIB-CONQUY 2006). In-vitro-Studien belegen ebenfalls, dass Monozyten/Makrophagen nach Exposition mit suboptimalen Endotoxin-Dosen nicht auf folgende LPS-Stimulationen reagieren können (DOBROVOLSKAIA u. VOGEL 2002; FOSTER et al. 2007; DEL FRESNO et al. 2009). Endotoxin-tolerante Zellen reagieren mit einer Herunterregulation von Genen pro-inflammatorischer Zytokine und Chemokine wie TNF-α, IL-6, IL-12, IL-1β, CCL3, CCL4 und CXCL10 (FOSTER et al. 2007; MAGES et al. 2007; DEL FRESNO et al.

2009; DRAISMA et al. 2009). Gene anti-inflammatorischer Zytokine wie IL-10, TGF-β und

IL-1RA werden hingegen hochreguliert (FOSTER et al. 2007; MAGES et al. 2007; DEL FRESNO et al. 2009; DRAISMA et al. 2009). Die Hochregulation dieser Gene deutet vielmehr auf eine profunde Gen-Neuprogrammierung als auf eine komplette Herunterregulation durch LPS (CAVAILLON u. ADIB-CONQUY 2006; FOSTER et al.

2007; FOSTER u. MEDZHITOV 2009). Viele der Charakteristiken Endotoxin-toleranter Monozyten/Makrophagen spiegeln diejenigen alternativ aktivierter M2-Makrophagen wider (DEL FRESNO et al. 2009). Endotoxin-tolerante Monozyten einem bestimmten Makrophagen-Phänotyp zuzuordnen ist jedoch eine zu grobe Vereinfachung, da der Phänotyp Endotoxin-toleranter Monozyten je nach Kontext, Stimulus und Art der Toleranz variiert (CAVAILLON u. ADIB-CONQUY 2006). Durch die Behandlung von Zellen mit immunsuppressiven Zytokinen können manche, jedoch nicht alle Aspekte des Phänotyps Endotoxin-toleranter Zellen reproduziert werden (MEDVEDEV et al. 2006). Dies untermauert die Hypothese, dass Makrophagen durch CCL2 und CCL5 in eine Art Endotoxin-Toleranz verfallen, da manche Charakteristiken wie die fehlende IL-12-Induktion vorhanden waren, andere Merkmale, wie z. B. die Hochregulation von IL-10, fehlten jedoch.

Da die Fähigkeit, Effektorzellen wie neutrophile Granulozyten an den Ort der Entzündung zu locken, ein wichtiger Schritt in der initialen Phase einer Entzündung darstellt, wurde auch die Genexpression von CXCL1 und CXCL8 gemessen. Diese beiden Gene wurden in Makrophagen, die in Anwesenheit von CCL2 und CCL5 differenzierten, selektiv hochreguliert. CXCL1 ist ein selektiver Ligand für CXCR2, während CXCL8 an CXCR1 und CXCR2 bindet (MANTOVANI et al. 2004a). Die Hochregulation beider Chemokingene in Makrophagen deutet auf eine besonders effektive Anlockung neutrophiler Granulozyten an den Entzündungsherd hin. Neben seiner chemotaktischen Fähigkeit gilt sowohl CXCL1 als auch CXCL8 weiterhin als pro-angiogenetisch (ZAJA-MILATOVIC u. RICHMOND 2008).

Dies ist konform mit der Beobachtung, dass CCL2- und CCL5-differenzierten Makrophagen nicht eindeutig ein pro- oder anti-inflammatorischer Charakter zugeschrieben werden kann.

Die Zellen haben zwar einen vermeintlich pro-inflammatorischen Phänotyp durch die deutliche Expression von S100A8/A9, jedoch werden diesem Protein auch anti-inflammatorische Eigenschaften zugeschrieben. So legen die Bindung von reaktiven Sauerstoffspezies und die Chelatbildung mit Zink eine Bedeutung von S100A8/A9 für die Resolution einer Entzündung nahe (PERERA et al. 2010). Weiterhin deutet das Genexpressionsprofil der Makrophagen weder in die pro-, noch in die anti-inflammatorische Richtung, da weder die Genexpression von iNOS und IL-12, noch diejenige von Arginase und IL-10 unter CCL2 oder CCL5 hoch- oder herunterreguliert wurde. Die Stimulation mit LPS konnte die Genexpression von CXCL1 und CXCL8 in CCL2- und CCL5-MdM nicht weiter steigern. Dies ist als ein weiterer Hinweis für die Hypothese anzusehen, dass die Anwesenheit von CCL2 oder CCL5 während der Differenzierung zu einer Art Endotoxin-Toleranz boviner Makrophagen führt.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass CCL2 und CCL5 in gleicher Weise einen deutlichen Einfluss sowohl auf den Phänotyp als auch auf das Genexpressionsprofil

in-vitro-differenzierter Makrophagen nehmen. CCL2- und CCL5-differenzierten Makrophagen kann jedoch aufgrund des Phänotyps und des Genexpressionsprofils kein eindeutiger pro- oder anti-inflammatorischer Charakter zugeschrieben werden.

6 Zusammenfassung

Constanze Frank Charakterisierung boviner Monozyten-Subpopulationen und deren In-vitro-Differenzierung in Makrophagen

Die funktionelle Polarisierung von Makrophagen hat einen entscheidenden Einfluss auf die Immunantwort gegen einwandernde Keime wie auch auf die Resolution einer Entzündung und Gewebeneubildung. Makrophagen-Plastizität ist ein bekanntes Phänomen im humanen und murinen System, über die Plastizität boviner Makrophagen ist jedoch wenig bekannt.

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden in bovinem Zitzengewebe Makrophagensubtypen anhand der Expression von S100A8/A9 (MAC387) und CD163 (AM-3K) nachgewiesen. Die Makrophagen waren nahezu ausschließlich einfach positiv und traten an Detaillokalisationen in unterschiedlicher Häufigkeit auf: CD163-positive Zellen waren signifikant häufiger perivaskulär zu finden, während S100A8/A9-positive Zellen sich in größerer Anzahl subepithelial befanden. Um einen Einfluss des Laktationsstadiums zu untersuchen, wurde das Vorkommen von Makrophagensubtypen in mittlaktierenden und in peripartalen Tieren miteinander verglichen. Für CD163-positive Makrophagen waren keine Unterschiede in Anzahl und Verteilungsmuster positiver Zellen feststellbar, während signifikant mehr S100A8/A9-positive Zellen in der peripartalen Gruppe im Vergleich zu mittlaktierenden Tieren detektiert werden konnten.

In einem zweiten Teil wurden Genexpressionsanalysen in bovinem Zitzengewebe mittels quantitativer rtPCR durchgeführt. Aufgrund fehlender Empfehlungen für bovines Zitzengewebe wurden UXT und RPS9 erstmals als Referenzgene für bovines Zitzengewebe geprüft und erfolgreich eingesetzt (r = 0,81; p < 0,0001). Die Mehrzahl der analysierten Kandidatengene (S100A8, S100A9, CXCL1, CCL3 und CCL5) zeigten nahezu keine Unterschiede in der Expression zwischen der mittlaktierenden Gruppe und der peripartalen Gruppe. Die Genexpression von S100A8 und S100A9 war in der Fürstenberg’schen Rosette höher als in der Zitzenzisterne. Für CD163 und CXCL8 wurde eine höhere Genexpression in der Zitzenzisterne der peripartalen Gruppe erfasst (verglichen mit der Fürstenberg’schen Rosette der peripartalen Gruppe und verglichen mit der Zitzenzisterne der mittlaktierenden Gruppe). Die Expression von CD163 war jedoch von einer starken Varianz geprägt (CV = 69,9%).

Monozyten sind die Vorläuferzellen, aus denen sich Makrophagen nach Einwanderung ins Gewebe differenzieren. In einem weiteren Teil der Arbeit konnte gezeigt werden, dass bovine Monozyten in einem Gemisch aus mononukleären Zellen des Blutes anhand ihrer exklusiven Expression von CD172a identifiziert werden können. Innerhalb der Monozyten wurden durch die differenzielle Expression von CD14 eine größere CD14-positive (71,8%) und eine kleinere CD14-negative oder schwach positive Monozyten-Subpopulation (28,4%) erfasst.

Funktionelle Unterschiede der Monozyten-Subpopulationen ergaben sich nach Stimulation mit den Chemokinen CCL2 und CCL5. Die CCL5-vermittelte Zellaktivierung war signifikant stärker als die CCL2-vermittelte. So führte CCL5 ab einer Konzentration von 10 nmol/L zu

einem signifikanten Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration, CCL2 hingegen erst ab 100 nmol/L. Darüber hinaus wurden CD14-positive Monozyten durch CCL5 signifikant stärker aktiviert als CD14-negative Monozyten.

Um zu untersuchen, ob Wirtsfaktoren die gerichtete Differenzierung von Monozyten beeinflussen, wurden Monozyten in Anwesenheit von CCL2 und CCL5 zu Makrophagen differenziert. Der Einfluss von CCL2 und CCL5 auf die In-vitro-Differenzierung boviner Monozyten wurde hierbei phänotypisch und anhand von Genexpressionsmessungen untersucht. Die Differenzierung boviner Monozyten in Anwesenheit von CCL2, CCL5 oder CCL2+5 (je 100nmol/L) führte zu einer signifikanten Zunahme der S100A8/A9-Expression und zu einer signifikant verminderten CD163-Expression im Vergleich zu Makrophagen, die ohne Chemokinzusatz differenzierten. Die Basis-Genexpression von CXCL1 und CXCL8 wurde durch die Differenzierung unter CCL2 oder CCL5 hochreguliert. Diese ließ sich durch eine Aktivierung der Zellen mit LPS nicht erhöhen. Sowohl anti-inflammatorische Mediatoren (IL-10 und Arginase) als auch pro-inflammatorische Mediatoren (IL-12 und iNOS) zeigten hingegen keine veränderte Basisexpression in CCL2- oder CCL5-differenzierten Makrophagen im Vergleich zu Makrophagen, die ohne Chemokinzusatz differenzierten. Auch deren Expression ließ sich durch LPS-Stimulation im Gegensatz zu Medium-differenzierten Makrophagen nicht signifikant erhöhen. Dies deutet darauf hin, dass CCL2 und CCL5 eine Form der Endotoxin-Toleranz von Makrophagen induzieren können.

In der vorliegenden Arbeit konnte prinzipiell gezeigt werden, dass sich die Differenzierung von Monozyten in unterschiedliche Makrohagenphänotypen in vitro steuern lässt. Wenn die unterschiedliche Zusammensetzung der Makrophagenpopulationen in vivo - wie sie für den Vergleich Peripartum/Mittlaktation gezeigt wurde - für die Gesamtreaktivität des Gewebes nach Erregerkontakt entscheidend ist, dann können diese Ergebnisse mittelfristig dafür verwendet werden, prophylaktisch die Gewebebesiedelung lokal im Euter/in der Zitze zu steuern.

7 Summary

Constanze Frank Characterization of bovine monocyte subpopulations and their in vitro differentiation into macrophages

Functional polarization of macrophages has an important impact on the immune response to invading pathogens as well as on the resolution of the inflammation and tissue remodeling.

Macrophage plasticity is a well known phenomenon in humans and mice, yet little is known about macrophages plasticity in the bovine system.

Within the scope of this research macrophage subtypes have been identified in bovine teat tissue according to their expression of S100A8/A9 (monoclonal antibody MAC387) or CD163 (monoclonal antibody AM-3K). Positive macrophages were almost mutually exclusive and showed differential distribution patterns; CD163-positive cells were preferentially located around blood vessels whereas S100A8/A9-positive cells were more abundant in subepithelial locations. The distribution pattern of these macrophage subtypes was compared between peripartum and mid-lactating cows to analyze the influence of the lactation cycle. CD163-positive macrophages revealed no differences between the groups whereas significantly more S100A8/A9-positive macrophages were detected in peripartum cows compared to mid-lactating cows.

In the next step, gene expression analyses in bovine teat tissue were done by quantitative rtPCR. Due to lacking recommendations for bovine teat tissue, UXT and RPS9 were tested and successfully used as reference genes for bovine teat tissue (r = 0.81; p < 0.0001). The majority of analyzed candidate genes (S100A8, S100A9, CXCL1, CCL3 and CCL5) showed hardly any differences between mid-lactating and peripartum cows. Gene expression of S100A8 and S100A9 was higher in the Fürstenberg’s Rosette compared to the teat cistern.

CD163 and CXCL8 showed higher gene expression in the teat cistern of peripartum cows (compared to mid-lactation). However, CD163 gene expression was highly variable (CV = 69.9%).

Monocytes are the precursor cells for macrophages after entering tissues. The obtained results demonstrated that bovine monocytes can be distinguished from mononuclear blood cells via their selective expression of CD172a. Furthermore, bovine monocyte subpopulations could be identified as CD14-positive (71.8%) and CD14-negative or weak positive monocytes (28.4%). These subpopulations showed functional differences after stimulation with chemokines CCL2 and CCL5. CCL5-mediated activation was significantly stronger than CCL2-mediated cell activation. The rise in intracellular calcium concentration via CCL5 was significant at ≥ 10 nmol/L whereas CCL2 induced a significant increase of intracellular calcium only when used at ≥ 100 nmol/L. Furthermore, CCL5 activated the CD14-positive subpopulation significantly stronger than the CD14-negative subpopulation.

Monocytes were differentiated into macrophages in the presence of CCL2 and CCL5 in order to analyze whether host factors influence the differentiation of monocytes. The impact of CCL2 and CCL5 on phenotype and gene expression profile was analysed. The presence of CCL2, CCL5 or CCL2+CCL5 (100 nmol/L each) gave rise to macrophages with significantly upregulated S100A8/A9 expression and significant downregulation of CD613 expression (compared to macrophages differentiated without chemokines). The basal gene expression of CXCL1 and CXCL8 was upregulated in CCL2 and CCL5 differentiated macrophages.

Im Dokument Charakterisierung boviner Monozyten-Subpopulationen und deren In-vitro-Differenzierung in Makrophagen (Seite 91-0)