Chemokine sind kleine Proteine aus 60 bis 100 Aminosäuren mit vier konservierten Cysteinen, die zwei essenzielle Disulfidbrücken bilden (Cys1 – Cys3 und Cys2 – Cys4).
Anhand der Reihenfolge und Anzahl aufeinander folgender Cysteine am N-Terminus werden Chemokine in vier Kategorien eingeteilt: CXC, CC, CX3C und C. Gene, die für humane CXC-Chemokine kodieren, befinden sich auf Chromosom 4, wohingegen die Gene für CC-Chemokine auf Chromosom 17 zu finden sind. CC-Chemokine einer Kategorie können nur an den Rezeptor derselben Kategorie binden (LEONARD u. YOSHIMURA 1990). Chemokine werden als Antwort auf Signale wie pro-inflammatorische Zytokine sezerniert und haben ihre Bedeutung in der selektiven Rekrutierung von Immunzellen anhand eines Konzentrationsgefälles, dem sogenannten Chemokingradienten. (CALLEWAERE et al.
2007). Sie bestehen aus drei wichtigen Domänen: die flexible N-terminale Domäne, die große Schleife und die α-Helix. Die N-terminale Domäne ist besonders wichtig für die Rezeptorbindung und -aktivierung (CLARK-LEWIS et al. 1991). Bisher sind ca. 50 Chemokine für den Menschen beschrieben mit einer molaren Masse von 8 bis 12 kDa und einer Sequenzhomologie von < 20% bis > 90%. Chemokine vermitteln Chemotaxis durch G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCR), deren Aktivierung zur Aktivierung intrazellulärer Signalkaskaden und letztendlich zur Chemotaxis führt. Binnen Sekunden nach Stimulation ist eine Erhöhung der intrazellulären Calciumkonzentration (BAGGIOLINI 1998) und eine eindrucksvolle Veränderung der Zellgestalt (shape change) durch Neuformation und Retraktion von Lamellipodien zu beobachten. Weiterhin induzieren Chemokine die Hochregulation und Aktivierung von Integrinen, die Leukozyten befähigen, an die Endothelzellen der Blutgefäße zu binden und nachfolgend ins Gewebe auszuwandern (SPRINGER 1994).
Chemokine und -rezeptoren sind i. d. R. promiskuitiv, indem mehrere Chemokine an denselben Rezeptor binden können und ein Chemokin für gewöhnlich Ligand für verschiedene Rezeptoren ist. Ein weiteres Merkmal des Chemokinsystems ist die Redundanz;
dies bedeutet, dass verschiedene Chemokine und -rezeptoren dieselbe Funktion erfüllen
können. Dies trägt zur Robustheit des Systems bei, da der Ausfall eines Chemokins/Rezeptors durch ein anderes Chemokin/einen anderen Rezeptor kompensiert werden kann (MANTOVANI 1999). Alle Chemokine sind durch Duplikation aus einem gemeinsamen Vorläufer hervorgegangen (DEVRIES et al. 2006; NOMIYAMA et al. 2010). Viele Chemokine und Chemokinrezeptoren befinden sich durch Tandemgenduplikation auf sogenannten Cluster-Regionen der Chromosomen. Cluster-Chemokine zeigen oft speziesspezifische Unterschiede, was vermutlich auf die unterschiedliche Pathogenexposition verschiedener Spezies zurückzuführen ist (NOMIYAMA et al. 2010).
In der Literatur werden CCL2, CCL4 und CCL5 als Chemoattraktoren für Monozyten beschrieben (SOZZANI et al. 1993), an anderer Stelle wird zusätzlich CCL3 genannt (DAVID u. MORTARI 2000). CCR1, CCR2, CCR5 und CXCR4 gelten als Chemokinrezeptoren für Monozyten (SAMSON et al. 1996; SU et al. 1996; BLEUL et al.
1997; FRADE et al. 1997; XU et al. 2000), jedoch werden auch CCR7, CCR8, CXCR1, CXCR2 und CX3CR1 genannt (WIDDISON u. COFFEY 2011).
2.8.1 CCL2
CCL2 ist das zuerst beschriebene humane CC-Chemokin. Humanes CCL2 besteht aus 76 Aminosäuren, besitzt ein Molekulargewicht von 13 kDa (VAN COILLIE et al. 1999) und ist auf Chromosom 17 lokalisiert. Die Freisetzung von CCL2 erfolgt entweder konstitutiv oder nach Induktion durch oxidativen Stress, Zytokine oder Wachstumsfaktoren. CCL2 wird u. a.
von Endothelzellen, Fibroblasten, Epithelzellen, glatten Muskelzellen, Mesangiozyten, Astrozyten, Monozyten und Mikrogliazellen gebildet (CUSHING et al. 1990; STANDIFORD et al. 1991; BROWN et al. 1992; BARNA et al. 1994), jedoch gelten Monozyten und Makrophagen als Hauptquelle von CCL2 (YOSHIMURA et al. 1989a; YOSHIMURA et al.
1989b). Monozyten werden durch CCL2 an den Ort aktiver Entzündungen rekrutiert (AJUEBOR et al. 1998). Knockout Mäuse für CCL2 und dessen Rezeptor CCR2 sind zwar vital, jedoch zeigen sie eine abnormale Rekrutierung von Monozyten und der Zytokinproduktion (LU et al. 1998). Die Expression von CCL2 ist mit der Entwicklung einer Th2-Antwort assoziiert (CHENSUE et al. 1995; HANDEL u. DOMAILLE 1996) und CCL2 verstärkt die IL-4-Ausschüttung aus T-Zellen (KARPUS et al. 1997). Darüber hinaus ist CCL2 in Th2-vermittelten Immunerkrankungen wie Asthma in großem Maße exprimiert und eine Neutralisierung führt in Tiermodellen zu einer Verbesserung (GONZALO et al. 1998).
CCL2 ist auch im Zusammenhang mit kardiovaskulären Erkrankungen von Bedeutung; so trägt CCL2 zur Atherosklerose via Rekrutierung von Monozyten in das Subendothel bei (DAWSON et al. 1999) und in einem Modell von BORING et al. (BORING et al. 1998) wurde eine verminderte arterielle Lipidablagerung in Abwesenheit von CCL2 oder CCR2 aufgezeigt. Chemokine und deren Rezeptoren wurden in vielen Tumoren detektiert. So korreliert die Expression von CCL2 in entartetem Gewebe in hohem Maße mit der Infiltration Tumor-assoziierter Makrophagen, Angiogenese und schlechter Überlebensrate bei Brustkrebs
(VALKOVIC et al. 2002). Jedoch werden CCL2 auch anti-tumorale Eigenschaften zugeschrieben; es verstärkt die zytostatische Aktivität gegen Tumorzellen nach Zugabe zu Makrophagen in Gewebekultur und induziert die Expression von Fas-Liganden und somit die Apoptose von Zellen (ZACHARIAE et al. 1990). Zusammenfassend spielt CCL2 eine wichtige Rolle im Entzündungsgeschehen durch die Rekrutierung von Monozyten und anderen Immunzellen ins Gewebe, durch Sekretion von Zytokinen und somit für den Fortgang der inflammatorischen Reaktion.
2.8.2 CCL4
Über CCL4, ein weiteres Monozyten-aktivierendes CC-Chemokin, ist wenig bekannt.
Humanes CCL4 besteht aus 69 Aminosäuren, ist 7,6 kDa groß und auf Chromosom 17 lokalisiert. Auch unter dem Namen MIP-1β (macrophage inflammatory protein 1-β) bekannt, wird es von Endotoxin-stimulierten Makrophagen produziert. CCL4 aktiviert neutrophile, basophile und eosinophile Granulozyten und induziert die Synthese und Freisetzung pro-inflammatorischer Zytokine wie IL-1, IL-6 und TNF-α aus Makrophagen und Fibroblasten (COLOBRAN u. JUAN 2007). Darüber hinaus vermittelt es die Migration von Monozyten und IL-2-stimulierten T-Zellen durch Bindung an den CC-Rezeptor CCR5, welcher von diesen Zellen exprimiert wird (BAGGIOLINI 1998). Zum Zeitpunkt der Versuchsdurchführungen im Rahmen der vorliegenden Arbeit stand rekombinantes bovines CCL4 nicht zur Verfügung, sodass mit CCL4 keine Versuche durchgeführt werden konnten.
2.8.3 CCL5
CCL5, auch als RANTES (Regulated upon Activation Normal T cell Expressed and Secreted) bezeichnet, besteht aus 68 Aminosäuren und besitzt ein Molekulargewicht von 7 kDa (APPAY u. ROWLAND-JONES 2001). Wie alle CC-Chemokine ist es auf Chromosom 17 lokalisiert. CCL5 induziert die Leukozytenmigration über Bindung an die G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR) CCR1, CCR3, CCR4 und CCR5, wobei CCR1 und CCR5 auf Monozyten exprimiert werden (SAMSON et al. 1996). Es vermittelt die Migration von T-Zellen und Monozyten, aber auch von basophilen und eosinophilen Granulozyten, NK-T-Zellen, dendritischen Zellen und Mastzellen (SCHALL 1991). Die Produktion von CCL5, vorwiegend durch CD8+ T-Zellen, aber auch von Epithelzellen, Fibroblasten und Thrombozyten ist ein wichtiger Aspekt im Entzündungsgeschehen. CCL5 kann durch die Induktion der NO-Produktion in Makrophagen antimikrobielle Eigenschaften aufweisen (VILLALTA et al. 1998), jedoch kommen diesem Chemokin auch schädliche Eigenschaften durch die Rekrutierung von Immunzellen und Förderung entzündlicher Prozesse zu; so wurde eine gesteigerte CCL5-Expression mit einer Vielzahl entzündlicher Prozesse wie z. B.
allogene Transplantatabstoßungen, Atherosklerose, Arthritis, atopische Dermatitis, Asthma, Überempfindlichkeitsreaktionen vom verzögerten Typ, Glomerulonephritis, Endometriose,
Morbus Alzheimer und verschiedenen Tumoren assoziiert (ROSSI u. ZLOTNIK 2000;
APPAY u. ROWLAND-JONES 2001). Die Rolle von CCL5 in diesen Erkrankungen wird in der Induktion der Leukozytenmigration in die entzündeten Bereiche gesehen (MEURER et al.
1993). In der frühen Phase der Tumorentstehung wird CCL5 mit der Induktion und Promotion des Tumors assoziiert, während es in späteren Phasen mit Angiogenese und Metastasierung in Verbindung gebracht wird (APPAY u. ROWLAND-JONES 2001). Die Bedeutung von CCL5 für virale Erkrankungen, besonders für HIV, wird kontrovers diskutiert; so gibt es Studien, die einen antiviralen Effekt für CCL5 in vitro aufzeigen (MCKENZIE et al. 1996; ZANUSSI et al. 1996; POLO et al. 1999), jedoch wurde auch eine Förderung der HIV-Infektion beschrieben (SCHMIDTMAYEROVA et al. 1996; KINTER et al. 1998; YE et al. 2004). Eine wichtige Entdeckung für die Bedeutung des Chemokinsystems in der Pathogenese der HIV-Infektion wurde bei Menschen gemacht, die sich trotz mehrfacher Exposition mit HIV nicht infizierten. Diese Individuen hatten eine Mutation des Gens, welche die CCR5-Rezeptorexpression an der Zelloberfläche unterdrückte (BERGER et al. 1999).
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass CCL5 entscheidende Bedeutung für die Entzündungskaskade besitzt, indem es Leukozyten an den Ort des Geschehens rekrutiert und sowohl pro- als auch anti-inflammatorische Eigenschaften aufweist.
3 Methoden
3.1 Gewinnung einzelner Leukozytenpopulationen des Blutes
Für die Gewinnung von Leukozytenpopulationen wurde Blut von zehn gesunden, im Zyklus befindlichen Holstein Friesian Kühen mit einem mittleren Alter von sieben Jahren aus der Klinik für Rinder der Tierärztlichen Hochschule Hannover genommen. Blutproben wurden morgens um 8 Uhr durch Punktion der Vena jugularis unter sterilen Kautelen nach Stauung des Gefäßes mit einer Staukette nach Witte (9.2.1) gewonnen. Eingesetzt wurde das Vacutainersystem mit heparinisierten Röhrchen (Natrium-Heparinat, 170 I.U.).
Gewinnung von mononukleären Zellen
Gerinnungsgehemmtes Vollblut wurde im Verhältnis 3:2 mit PBS (9.2.4) verdünnt und in 50 mL Röhrchen über Lymphozytenseparationsmedium® (9.2.2) geschichtet. Die anschließende Zentrifugation wurde über 30 Min. bei 4°C und 1000 x g ohne Bremse durchgeführt.
Während dieser Zentrifugation kam es zu einer Auftrennung der einzelnen Zellpopulationen aufgrund ihrer spezifischen Dichte. Zwischen dem Blutplasma und dem Lymphozytenseparationsmedium® befand sich die ‚Interphase‘ mit mononukleären Zellen (MNC; lymphoide Zellen und Monozyten) und Anteilen der Thrombozytenfraktion.
Unterhalb des Lymphozytenseparationsmediums® befanden sich die Erythrozyten und die polymorphkernigen Granulozyten (PMN).
Die Interphase wurde mit einer weitlumigen Pipette abgesaugt und in ein 50 mL Röhrchen mit vorgelegtem PBS (5 mL) überführt. Nach Auffüllen mit PBS auf 50 mL wurden drei Waschschritte durchgeführt (je 10 Min., 4°C; 500 x g, 250 x g und 100 x g), um die Thrombozyten weitgehend zu entfernen. Nach dem ersten Waschschritt wurden kontaminierende Erythrozyten im Zellpellet durch hypotone Lyse entfernt: nach Zugabe von 20 mL A. dest. und ständigem Schwenken für 20 Sek. wurden 20 mL 2-fach konzentriertes PBS (9.2.4) zugegeben. Zwischen den einzelnen Zentrifugationsschritten wurden die Zellen durch Aufschütteln des Pellets resuspendiert und in 45 mL PBS aufgenommen. Das letzte Zellpellet wurde in Zellkulturmedium aufgenommen, die Zellen gezählt und auf die gewünschte Konzentration eingestellt. Durch dieses Verfahren konnten MNC-Populationen mit einer Reinheit und Vitalität von 95 bis 99 % gewonnen werden. Die Ausbeute betrug 0,5 bis 1,1 x 106 MNC/mL Vollblut.
Gewinnung von Monozyten
Die Gewinnung von Monozyten aus mononukleären Zellen erfolgte über die Positiv-Selektion von Monozyten anhand ihres CD172a Oberflächenmarkers in einem magnetischen Separationssystem. Die nach der Dichtezentrifugation (s. o.) gewonnenen mononukleären Zellen wurden in 5 mL MACS-Puffer (9.2.4) aufgenommen und über einen 30 µm Nylonfilter
(9.2.2) gegeben, um Zellaggregate zu entfernen. Der Filter wurde zweimal mit jeweils 5 mL MACS-Puffer gespült und die filtrierte Zellsuspension bei 300 x g und 4°C für 10 Min.
zentrifugiert. Das Zellpellet wurde mit einem unmarkierten Mouse-anti-human-CD172a-Antikörper (Einsatz 1:90 in MIF-Puffer) (9.2.5) für 20 Min. bei 4°C inkubiert und anschließend mit MACS-Puffer (9.2.4) gewaschen (300 x g, 4°C, 10 Min.). Die Zellen wurden gezählt und je 1 x 107 Zellen wurden 80 µL MACS-Puffer und 20 µL eines mit Micro Beads gekoppelten Human-anti-mouse-Antikörpers (9.2.5) dazugegeben. Nach einer Inkubationszeit von 15 Min. bei 4°C wurden die Zellen zentrifugiert (300 x g, 4°C, 10 Min.) und in 3 mL MACS-Puffer aufgenommen. Für die magnetische Separation der CD172a-positiven Zellen wurde eine MACS-Säule (9.2.2) in die Separationseinheit (9.1) eingespannt und mit 3 mL MACS-Puffer gespült. Die Zellsuspension wurde über die Säule gegeben und der Durchlauf in einem 15 mL Röhrchen aufgefangen. Anschließend wurde die Säule dreimal mit jeweils 3 mL MACS-Puffer gespült. Die Spülfraktion wurde in einem gesonderten Gefäß aufgefangen. Zur Elution der in der Säule durch das anliegende Magnetfeld festgehaltenen CD172a-positiven Zellen wurde die Säule aus dem Magnetfeld herausgenommen und mit 5 mL MACS-Puffer gespült.
Von den MNC und von den Zellfraktionen Durchlauf und Eluat wurde je ein Aliquot mit einem PE-ALEXA 647-gekoppelten Mouse-anti-human-CD172a-Antikörper (Einsatz 1:2000 in MIF-Puffer) (9.2.5) für 10 Min. bei 4°C inkubiert. Direkt im Anschluss wurden diese Aliquote im Durchflusszytometer auf den prozentualen Anteil der CD172a-positiven Population überprüft.
Die im Eluat befindlichen Monozyten wiesen eine Reinheit von > 95% auf. Die Monozyten wurden bei 300 x g und 4°C für 10 Min. zentrifugiert, in I10F+ (9.2.4) aufgenommen und auf die gewünschte Konzentration eingestellt.