Tierärztliche Hochschule Hannover
Ko-Kultur primärer boviner Hepatozyten und Makrophagen: Einfluss auf Zellfunktionalität und
-viabilität
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von Teresa Maria Fischbach
Donaueschingen
Hannover 2018
1. Gutachterin: Frau JProf. Dr. Marion Schmicke (geb. Piechotta) 2. Gutachterin: Frau Prof. Dr. Christiane Pfarrer
Tag der mündlichen Prüfung: 22.05.2018
Für meine Eltern
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Teile dieser Arbeit wurden bereits der Öffentlichkeit vorgestellt bzw. zur Vorstellung eingereicht:
T. Fischbach, M. Schmicke (Piechotta)
Influence of macrophages in a co-culture with bovine hepatocytes on hepatocyte functionality and viability
26. Jahrestagung der Fachgruppe „Innere Medizin und klinische Labordiagnostik“ der DVG
02.02.2018 - 03.02.2018
S. Witte, T. Fischbach, Y.Brockelmann, M. Schmicke (Piechotta)
Influence of glucose and macrophages on growth hormone receptor expression in primary bovine hepatocytes
8th International Congress on Endocrinology 01.12.2018-04.12.2018
Inhaltsverzeichnis
i
Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG... 1
2 LITERATUR ... 3
Leber ... 3
2.1.1 Anatomie der Leber ... 3
2.1.2 Histologische Zusammensetzung der Leber ... 3
Kultivierung primärer boviner Hepatozyten ... 6
2.2.1 Entzündungsreaktion ... 6
2.2.2 Dedifferenzierung kultivierter Hepatozyten ... 7
Ko-Kultivierung primärer boviner Hepatozyten mit Kupfferzellen ... 11
2.3.1 Wechselwirkungen zwischen Hepatozyten und Kupfferzellen ... 15
2.3.2 Aktivierung von Makrophagen ... 19
Einsatz von Entzündungshemmern in Hepatozytenkulturen ... 22
2.4.1 Glukokortikoide ... 23
2.4.2 DHEA ... 25
2.4.3 Acetylsalicylsäure ... 26
3 MATERIAL UND METHODEN ... 29
Leberzell-Isolation ... 29
3.1.1 Aufreinigung boviner primärer Hepatozyten ... 33
3.1.2 Gewinnung boviner Kupfferzellen ... 34
Kultivierung primärer boviner Hepatozyten ... 36
ii
3.2.1 Ko-Kultivierung der Hepatozyten mit Kupfferzellen über 7 Tage in drei
verschiedenen Kulturformen ... 36
3.2.2 Inkubationsversuch mit verschiedenen Entzündungshemmern ... 39
3.2.3 Konservierung der Zell- und Mediumproben ... 40
Morphologische Beurteilung der Hepatozyten ... 41
3.3.1 Live/Dead Färbung ... 41
3.3.2 Immunhistologische Darstellung der Hepatozyten in Kultur ... 42
3.3.3 Nachweis von Kupfferzellen mit Latex beads ... 43
Laboranalysen... 45
3.4.1 Proinflammatorische Zytokine ... 45
3.4.2 Harnstoff ... 48
Bestimmung der Genexpression in Hepatozyten ... 50
3.5.1 RNA-Extraktion ... 50
3.5.2 Bestimmung der RNA-Konzentration ... 50
3.5.3 cDNA-Synthese mit DNase Verdau ... 51
3.5.4 Quantitative Real-Time PCR ... 53
Auswertung ... 56
3.6.1 Berechnung der relativen Menge der mRNA-Expression ... 56
3.6.2 Statistische Auswertung ... 57
4 ERGEBNISSE... 29
Isolation von primären Hepatozyten ... 58
Isolation von Kupfferzellen ... 60
Reinheit der Hepatozytenmonokultur ... 63
4.3.1 Einfluss der Kulturform auf die Hepatozytenmorphologie ... 66
4.3.2 Einfluss der Kulturform auf die Harnstoffkonzentration im Kulturmedium .... 71
4.3.3 Ergebnisse der Genexpressionsanalyse ... 72
Inhaltsverzeichnis
iii
4.3.4 Zytokinkonzentrationen im Kulturmedium in Abhängigkeit der Kulturform ... 76
Vergleichende Betrachtung verschiedener Entzündungshemmer ... 78
4.4.1 Harnstoffkonzentration im Kulturmedium in Abhängigkeit des Entzündungshemmers ... 78
4.4.2 Ergebnisse der mRNA-Expressionsanalyse ... 79
4.4.3 Zytokinkonzentration im Kulturmedium in Abhängigkeit des Entzündungshemmers ... 84
5 DISKUSSION ... 86
Isolation von Hepatozyten und Kupfferzellen aus bovinen Lebern ... 87
Nachweis der Kulturreinheit ... 94
Ko-Kultivierung von Hepatozyten mit Kupfferzellen... 96
5.3.1 Stoffwechselfunktion der Hepatozyten in Abhängigkeit der Kulturform ... 97
5.3.2 Dedifferenzierung der Hepatozyten in Abhängigkeit der Kulturform ... 100
5.3.3 Wachstumshormonrezeptorexpression in Abhängigkeit der Kulturform ... 100
5.3.4 Inflammatorische Reaktion in Abhängigkeit der Kulturform ... 101
Vergleichende Betrachtung verschiedener Entzündungshemmer ... 104
5.4.1 Stoffwechselfunktion in Abhängigkeit des Entzündungshemmers ... 104
5.4.2 Inflammatorische Reaktion in Abhängigkeit des Entzündungshemmers ... 104
5.4.3 Dedifferenzierung der Hepatozyten in Abhängigkeit des Entzündungshemmers 106 5.4.4 Wachstumshormonrezeptorbeeinflussung in Abhängigkeit des Entzündungshemmers ... 108
6 AUSBLICK ... 109
7 ZUSAMMENFASSUNG ... 111
8 SUMMARY ... 114
iv
9 LITERATURVERZEICHNIS ... 116
10 ANHANG ... 130
Chemikalien ... 130
Verbrauchsmaterialien ... 131
Kits ... 132
Antikörper ... 132
Geräte ... 133
Ergebnisse der LIVE-DEAD®-Färbung ... 134
Vergleich von Housekeeper-Genen ... 135
Mittelwert ± Standardabweichung der Genexpressionen in den Kulturen HKCd, HKCid und HMC in Abhängigkeit der Kulturdauer ... 136
Mittelwert ± Standardabweichung der Harnstoffkonzentration im Zellkulturüberstand in den Kulturen HKCd, HKCid und HMC in Abhängigkeit der Kulturdauer ... 137
Mittelwert ± Standardabweichung der Genexpressionen in den Kulturen HKCid und HMC in Abhängigkeit des Entzündungshemmers ... 138
Mittelwert ± Standardabweichung der Harnstoffkonzentration im Zellkulturüberstand in den Kulturen HKCid und HMC in Abhängigkeit des Entzündungshemmers ... 139
11 DANKSAGUNG ... 140
Abkürzungsverzeichnis
v
Abkürzungsverzeichnis
18S 18S ribosomale Ribonukleinsäure
°C Grad Celsius
µl Mikroliter
µm Mikrometer
AS Aminosäuren
AST Aspartat-Aminotransferase
ATP Adenosintriphosphat
bp Basenpaare
cDNA komplementäre Desoxyribonukleinsäure
CO2 Kohlenstoffdioxid
Ct Threshold cycle
Dexa Dexamethason
DNA Desoxyribonukleinsäure
DNase Desoxyribonuklease
dNTPs Desoxyribonukleosidtriphosphate
E Effizienz
EGTA Ethylenglycol-bis(aminoethylether)-N,N,N‘,N‘-tetraacetat ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay
FBS Fetales bovines Serum
g Gramm
GAPDH Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase
GHR Growth hormone receptor (Wachstumshormon-Rezeptor) GHR1A Growth hormone receptor, Variante 1A
vi
GHRtot Growth hormone receptor total variants
GOI Gene of interest
h Stunde
H Hepatozyten
HIF-1α Hypoxie-induzierter Faktor 1-alpha
HMC Hepatocyte monoculture
HKCd Hepatocyte-Kupffercell-Coculture in direct contact HKCid Hepatocyte-Kupffercell-Coculture in indirect contact HEPES Hydroxyethylpiperazin-Ethansulfonsäure
HNF4α Hepatocyte nuclear factor 4 alpha
IGF Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor, Insulin-like growth factor
IL Interleukin
ITS Insulin-Transferrin-Selenium
KC Kupffer cells
LPS Lipopolysaccharide
mg Milligramm
ml Milliliter
mm Millimeter
mRNA Messenger Ribonukleinsäure
MuLV-Reverse Transkriptase
Murine Leukemia Virus-Reverse Transkriptase
n Anzahl
ng Nanogramm
n.s. Nicht signifikant
Abkürzungsverzeichnis
vii
NF-κB Nuclear factor-kappa-B
NF-κBIα Nuclear factor-kappa-B-Inhibitor alpha
O2 Sauerstoff
P Phosphat
PBS Phosphat-gepufferte Salzlösung
PCR Polymerase-Ketten-Reaktion
PFA Paraformaldehyd
PG Prostaglandin
qPCR quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion
RNase Ribonuklease
rRNA Ribosomale Ribonukleinsäure
Ref Referenzgen
RT Raumtemperatur
RT-qPCR Quantitative Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion
SD Standardabweichung
TBS Tris-buffered saline
TNF-α Tumor-Nekrose-Faktor alpha
ß-HBS ß-Hydroxybuttersäure
V. Vena
VZ Quotient aus Viabilität und Zellzahl
WEM William’s E Medium
WIZ Warme Ischämiezeit
ZV Quotient aus Zellzahl und Viabilität
ZZ Zellzahl
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Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Leberperfusion ... 31
Abbildung 2: Formel zur Einstellung der Dichte für die Dichtegradientenzentrifugation (Biochrom GmbH, Berlin). ... 33
Abbildung 3: Zentrifugationsschritte nach Perfusion. ... 35
Abbildung 4: schematische Darstellung der Kulturformen ... 37
Abbildung 5: schematische Darstellung der Plattenbelegung des Ko-Kulturversuches ... 38
Abbildung 6: Schematische Darstellung der Plattenbelegungdes Entzündungshemmerversuches ... 40
Abbildung 7: Zellen in Kultur direkt nach Aussaat ... 58
Abbildung 8: Kupfferzellen in Kultur . ... 61
Abbildung 9: Immunhistologische Darstellung der Hepatozyten ... 64
Abbildung 10: Darstellung der Kupfferzellen in der Hepatozytenzellkultur mithilfe von Fluorenzenz- markierter Latex beads ... 65
Abbildung 11: Hepatozyten in Sandwichkonfiguration unter inversen Phasenkontrastmikroskop ... 69
Abbildung 12: LIVE-DEAD®-Färbung von HMC, HKCd und HKCid ... 70
Abbildung 13: Effekt der Kulturdauer und des Kulturmodells auf die Harnstoffkonzentration in dem Kulturmediumin Abhängigkeit der Kulturdauer ... 71
Abbildung 14: Effekt von Kulturdauer und Kulturform auf die mRNA-Expression von Albumin (a), HNF4α (b) und GHR1a (c) ... 75
Abbildung 15: Effekt verschiedener Entzündungshemmer auf die Harnstoffkonzentration im Kulturmediumin Abhängigkeit des Entzündungshemmers ... 78
Abbildung 16: Effekt verschiedener Entzündungshemmer auf die relative mRNA-Expression von NFκB- Inhibitor-α, Vimentin, GHRtot und GHR1A . ... 83
Tabellenverzeichnis
ix
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Funktionen verschiedener von Kupfferzellen produzierten Zytokinen, modifiziert nach Roitt
(1993) ... 17
Tabelle 2: Stimuli für klassische und alternativ aktivierte Makrophagen ... 21
Tabelle 3: Zusammensetzung der Stammlösungen ... 32
Tabelle 4: Perfusionspuffer für die Isolation primärer boviner Hepatozyten und Kupfferzellen. ... 32
Tabelle 5: Zusammensetzung der verwendeten Kulturmedien ... 38
Tabelle 6: Konzentrationen der Entzündungshemmer im Medium. ... 39
Tabelle 7: Zusammensetzung der Puffer, die für die Durchführung des Bovinen IL-6 ELISA (ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA) benötigt wurden... 46
Tabelle 8: Verdünnung der Reagenzien, die für die Durchführung des Bovinen TNF-α ELISA (ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA) benötigt wurden... 47
Tabelle 9: Reaktionsmixe zur Bestimmung der Harnstoffkonzentration gemäß dem Urea Assay Kit. ... 49
Tabelle 10: Reagenzien des für die cDNA-Synthese verwendeten Mastermixes ... 52
Tabelle 11: Zusammensetzung des Mastermix für die quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion. 54 Tabelle 12: Informationen zu den in der quantitativen Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion verwendeten Primern. ... 55
Tabelle 13: Zellzahlen, Viabilität und Adhäsion der isolierten bovinen Hepatozyten ... 59
Tabelle 14: Zellzahlen, Viabilität und Reinheit der isolierten Kupfferzellen ... 62
Tabelle 15: TNF-α Konzentration in ng/ml im Kulturmedium von HKCd, HKCid und HMC in Abhängigkeit der Kulturdauer ... 76
Tabelle 16: Il-6 Konzentration in pg/ml im Kulturmedium von HKCd, HKCid und HMC in Abhängigkeit der Kulturdauer ... 77
Tabelle 17: TNF-α Konzentration in ng/ml im Kulturmedium von HKCid und HMC in Abhängigkeit von verschiedenen Entzündungshemmern... 84
Tabelle 18: IL-6 Konzentration in pg/ml im Kulturmedium von HKCid und HMC in Abhängigkeit von verschiedenen Entzündungshemmern. ... 85
Tabelle 19: Auswertung der LIVE-DEAD®-Färbung. Es wurden pro Kulturform (HMC, HKCd, HKCid) jeweils in 4 Gesichtsfeldern die lebenden (grün gefärbten) und toten (rot gefärbten) Hepatozyten ausgezählt... 134
x
Tabelle 20: Vergleich der Genexpression verschiedener Housekeeper ... 135 Tabelle 21: Mittelwert ± Standardabweichung der Harnstoffkonzentration im Zellkulturüberstand in den Kulturen HKCd, HKCid und HMC in Abhängigkeit der Kulturdauer ... 137 Tabelle 22: Mittelwert ± Standardabweichung der Genexpressionen in den Kulturen HKCid und HMC in Abhängigkeit des Entzündungshemmers ... 138 Tabelle 23: Mittelwert ± Standardabweichung der Harnstoffkonzentration im Zellkulturüberstand in den Kulturen HKCid und HMC in Abhängigkeit des Entzündungshemmers ... 139
EINLEITUNG
1
1 EINLEITUNG
Die Transitionsphase, welche die letzten drei Wochen der Trächtigkeit bis drei Wochen nach der Abkalbung umfasst, ist eine kritische Phase der Milchkuh, da ein plötzlich stark steigender Energiebedarf durch das Einsetzen der Laktation bei verminderter Futteraufnahme vor der Kalbung zu einer stark negativen Energiebilanz führt (Drackley 1999). Erhöhte GH- Konzentrationen stellen durch die Förderung der Lipolyse die Energieversorgung und das Einsetzen der Laktation sicher. Zugunsten einer erhöhten Insulinsensitivität kommt es bei Hochleistungsmilchkühen in den letzten drei Wochen praepartum zu einer Wachstumshormon (Growth hormone, GH)-Resistenz infolge einer verminderten Ansprechbarkeit des Wachstumshormon-Rezeptors Variante 1A (Growth hormone receptor, GHR1A) in der Leber (Lucy et al. 1998). Die verminderte Expression des GHR hat eine reduzierte Produktion des Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktors 1 (Insulin-like Growth Factor 1, IGF-1) zur Folge.
Durch einen negativen Feedback-Mechanismus wird in der Hypophyse vermehrt GH ausgeschüttet, welches als Insulin-Antagonist eine Insulinresistenz bewirkt (Renaville et al.
2002). Die hormonellen und metabolischen Mechanismen in der Transitionsphase werden demnach unter anderem durch Veränderungen der GHR1A Genexpressionen bestimmt und diese Adaptation beginnt bereits vor der Geburt (Loor et al. 2005). Ein detailliertes Wissen über die Mechanismen der GHR1A Regulation sind Grundlage für das Verständnis der peripartalen Stoffwechseladaptation der Milchkuh.
Da bei in vivo Untersuchungen viele nicht erfassbare Faktoren auf das Stoffwechselgeschehen einwirken, sind in vitro Modelle für die gezielte Untersuchung einzelner Faktoren und Faktorenkombinationen eine sinnvolle Ergänzung zu Tierversuchen. Mit dem Ziel, die Funktion und den Einfluss der Hormone der somatotropen Achse auf metabolische Erkrankungen während der Transitperiode von Milchkühen zu erfassen, wurde in der Arbeitsgruppe von Frau JProf. Schmicke in den vergangenen Jahren ein Isolations- und Kultivierungsprotokoll für primäre bovine Hepatozyten etabliert (Ehrhardt und Schmicke 2016). Der hepatische Energiemetabolismus wird beeinflusst durch Zytokine, Akute-Phase- Proteine und den Gehalt an nicht veresterten freien Fettsäuren, die beim Abbau von Fettgewebe freigesetzt werden (Loor et al. 2005). Die Bedeutung der regulatorisch wirkenden Makrophagen in der Leber, der Kupfferzellen, wurde allerdings in bisherigen Untersuchungen
2
der Arbeitsgruppe von Frau JProf. Schmicke und auch in anderen Studien über Leberkulturmodelle aus Kälbern und Büffeln (Panda et al. 2015; Zhang et al. 2016) außer Acht gelassen. Um die Zellfunktionalität und -vitalität der Hepatozyten in Kultur zu erhalten, verwendeten Ehrhardt und Schmicke (2016) Dexamethason als entzündungshemmenden Zusatz des Zellkulturmediums. Bei einer Konzentration von 100 nM konnten Ehrhardt und Schmicke (2016) eine deutliche Verbesserung im Erhalt morphologischer und funktioneller Funktionen, wie den Erhalt von Polarität, Bildung von gallengangsähnlicher Kanälchen und Albuminsynthese, im Gegensatz zu der Kontrolle ohne Entzündungshemmer feststellen. Witte et al. (2018) konnten zeigen, dass Dexamethason zu einer verminderten Expression von GHR1A in Hepatozytenkulturen führt.
Daraus ergeben sich folgende Ziele für die hier vorliegende Arbeit:
1. Die mithilfe der von Witte et al. (2017) etablierten Isolationstechnik gewonnenen Zellen sollen mit einem Hepatozytenmarker immunhistologisch angefärbt werden, um die Zellen eindeutig als Hepatozyten identifizieren zu können. Mit immunfluorezenzmarkierten Latex beads soll die Hepatozytenkultur desweiteren auf das Vorhandensein von Kupfferzellen überprüft werden.
2. Der Einfluss von Kupfferzellen auf die Hepatozytenkultur soll untersucht werden. Ziel ist es dafür, Kupfferzellen aus der bovinen Leber zu gewinnen und ein Ko- Kultursystem mit primären Hepatozyten zu etablieren. Dabei soll auch der Einfluss des Abstandes zwischen den Kulturpartnern berücksichtigt werden.
3. Der Einfluss von Hydrocortison, DHEA und Aspirin auf die Nutzbarkeit als Entzündungshemmer in Hepatozytenzellkulturen im Vergleich zu Dexamethason wird geprüft. Zudem auch, ob die Hepatozytenzellkultur auch ohne Zusatz eines solchen Entzündungshemmers ausreichende Vitalität zeigt.
LITERATUR
3
2 LITERATUR
Leber
2.1.1 Anatomie der Leber
Die Leber der Wiederkäuer lässt sich in einen Lobus hepatis sinster, Lobus hepatis dexter, Lobus quadratus und einen prominenten, den rechten Leberrand überragenden Lobus caudatus einteilen. Sie ist von einer straffen, bindegewebigen Kapsel, der GLISSON-Kapsel, umgeben (Salomon 2015). Die morphologische Baueinheit der Leber stellen die Leberläppchen, die Lobuli hepatis, dar. Sie sind von unregelmäßiger, länglicher und im Querschnitt sechseckiger Gestalt mit einem Quer- und Längsdurchmesser von etwa 1,0-1,5 bzw. 1,5-2,0 mm (Bucher 1992). Die Leberläppchen scheinen unter dem Mikroskop enganliegend und sind nur durch dünne Bindegewebssepten voneinander getrennt. An jeder Ecke der hexagonal geformten Lobuli befinden sich periportale Felder, die GLISSON-Trias, welche Lymphgefäße, Nervenfasern und die Lebertrias, bestehend aus Aa. und Vv.
Interlobulares und jeweils einem Gallengang, enthalten (König und Liebich 2012).
2.1.2 Histologische Zusammensetzung der Leber
Die Leber setzt sich zu 80% aus Parenchymzellen, den Hepatozyten, und zu 20% aus nicht- parenchymalen Zellen (non-parenchymal cells; NPC) zusammen. Die nicht-parenchymalen Zellen bestehen neben den Sinusendothelzellen, den hepatischen Sternzellen, aus den hepatischen Makrophagen. Hepatozyten stellen die Mehrheit der gesamten Leberzellpopulation dar und führen die meisten metabolischen Funktionen aus. Hepatozyten sind radiär auf die Zentralvenen zulaufende, in ein- bis zweischichtigen Leberzellbalken angeordnete, polygonale Epithelzellen mit einem oder mehreren runden Zellkernen (Joest 1937). Jeweils an der basolateralen Seite der Hepatozyten finden sich in den Innenräumen dieser dreidimensionalen Gebilde weitlumige, fenestrierte Blutkapillaren, die auch als Lebersinusoide bezeichnet werden (Holtmann 2009). Im Gegensatz zu anderen Blutgefäßen weisen diese Sinusoide weder eine Basalmembran noch einen geschlossenen Zellverband des
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Endothels auf. Die Sinusendothelzellen bilden zahlreiche Lücken, wodurch das Plasma des Pfortaderblutes aus den Kapillaren austreten kann und in dem zwischen Leberzellen und Gefäßendothel gelegenen DISSÉ-Raum in unmittelbaren Kontakt mit den Hepatozyten treten kann (Salomon 2015). So wird der Flüssigkeits- und Materialaustausch zwischen dem Blut in den Sinusoiden und den Hepatozyten geregelt und die freie Diffusion von Substanzen, nicht aber diejenige von Partikeln, zwischen dem Blut und der Hepatozytenoberfläche ermöglicht.
Sinusendothelzellen haben außerdem eine ausgeprägte endozytotische Kapazität, die sie zu einem wichtigen Bestandteil des retikuloendothelialen Systems macht (Bouwens et al. 1992).
An der apikalen Seite sind die Hepatozyten durch Desmosomen und Tight junctions dicht miteinander verbunden (Holtmann 2009). Die so entstehenden engen Spalträume zwischen den Hepatozyten stellen die Gallenkapillaren dar, welche nur durch Zonulae occludentes abgedichtet sind, damit der Übertritt von Gallenflüssigkeit in den DISSÉ-Raum und die Lebersinusoide verhindert wird (Salomon 2015).
Im Lumen der Sinusoide sind hepatische Gewebsmakrophagen lokalisiert, die bedarfsweise aus dem Blut einwandern. Die Makrophagen der Leber stammen von mononuklearen Stammzellen aus dem Knochenmark ab, die sich direkt oder über im Blut zirkulierende Monozyten zu Subpopulationen von Gewebemakrophagen und eng verwandten myeloiden dendritischen Zellen differenzieren (Gale et al. 1978). Makrophagen exprimieren zahlreiche Rezeptoren, mit deren Hilfe sowohl wirtsfremde als auch wirtseigene bzw. pathologisch veränderte Zellen erkannt werden können. Durch Endozytose, Phagozytose und Abgabe von Signalsubstanzen, einschließlich Zytokinen, Wachstumsfaktoren und Metaboliten, bilden Makrophagen einen Schutzmechanismus gegen Endo- und Exotoxine, können intrahepatische Gewebeschäden erkennen und sind damit Teil des sogenannten mononukleären Phagozytosesystems (MPS) (Roitt 1993; Tizard 2009). Die Makrophagen der Leber werden nach ihrem Entdecker Karl Wilhelm von Kupffer auch als Kupfferzellen bezeichnet (Haubrich 2004). Je nach Lokalisation unterscheiden sich Makrophagen in Morphologie und Phänotyp. In der Leber weisen sie eine irreguläre, sternförmige Form mit zottiger Oberfläche auf (Kmiec 2001). Mit 35% bilden sie den größten Anteil der nicht-parenchymalen Zellen der Leber. In der Gefäßwand der Lebersinusoide, aber auch im DISSÉ-Raum, befinden sich die hepatischen Sternzellen, die auch als Itozellen bezeichnet werden. Sie stellen eine Leber- assoziierte Population von großen körnigen Lymphozyten dar, die die Fähigkeit besitzen,
LITERATUR
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Tumorzellen zu eliminieren, und wahrscheinlich auch eine Rolle bei der antiviralen Verteidigung der Leber spielen (Bouwens et al. 1992). In ihrer inaktiven Form haben sie vor allem die Funktion eines Vitamin-A-Speichers und der Regulation des Gefäßtonus durch Produktion extrazellulärer Matrixkomponenten. Durch Entzündungsprozesse, welche durch unterschiedlichste Noxen, wie zum Beispiel Verfettung, Medikamente, hepatische Virentoxine, ausgelöst werden können, werden diese Zellen aktiviert. Sie differenzieren sich vornehmlich zu Myofibroblasten (bindegewebsproduzierende Zellen), die zu Proliferation, Kontraktion, Fibrogenese und Chemotaxis fähig sind (Salomon 2015).
6
Kultivierung primärer boviner Hepatozyten
Erste Versuche, Hepatozyten aus Lebern zu isolieren, tätigte Anderson bereits im Jahr 1953.
Seitdem war die Optimierung der Isolation und Kultivierung primärer Hepatozyten Ziel zahlloser Studien (Bojar et al. 1976; Guguen-Guillouzo et al. 1986; Seglen 1976). Zum heutigen Zeitpunkt ist die Isolation und Kultivierung von primären Hepatozyten soweit vorangeschritten, dass in vitro Modelle für die pharmakologische wie auch toxologische Forschung eine zunehmende Bedeutung erlangt haben. Um in vivo Stoffwechselvorgänge in vitro nachvollziehen zu können, ist es erforderlich, dass typische hepatische Funktionen und metabolische Stoffwechselvorgänge der Hepatozyten auch in Kultur erhalten bleiben. Diese umfassen unter anderem das Verstoffwechseln endogener und exogener Substanzen, wie Zellprodukte oder Medikamente, die Verwertung oder Speicherung von Aminosäuren, Kohlenhydraten und Fettsäuren, die Proteinsynthese, vor allem Albumin und Transferrin, und die situationsangepasste Aktivierung inflammatorischer und immunbedingter Reaktionen während krankhafter Zustände (Kmiec 2001).
2.2.1 Entzündungsreaktion
Bei der Isolation boviner Hepatozyten stellt sich das Problem, dass von dem Tod des Tieres bis zur Entnahme und Kühlung der Leber einige Zeit vergeht. Hierbei werden die Zellen durch die sogenannte warme Ischämiezeit, der Zeit zwischen des Aussetzens der Blutzufuhr bis zur Entnahme und Kühlung des Lebergewebes, erheblich geschädigt (Ikeda et al. 1992).
Die Zellen sind nach dem Tod des Tieres immer noch stoffwechselaktiv, die Sauerstoffversorgung wird durch die Unterbrechung der Blutzufuhr allerdings gestoppt. Die Hypoxie, der die Hepatozyten in Folge ausgesetzt sind, führt zu einer Umstellung von aerober auf anaerobe Energiebereitstellung. Das dabei anfallende Laktat führt zu einer Übersäuerung des Gewebes. Da Enzymfunktionen in saurem pH aufgehoben werden, kommt es zu einem Erliegen der Stoffwechselfunktionen und damit auch der Energieversorgung der Zellen (Murphy und Horrocks 1993). Der Stillstand ATP-abhängiger Zellmembranpumpen führt zu einem Zusammenbruch der Homöostasemechanismen. Unkontrollierter Einstrom von extrazellulärem Natrium und ein darauf durch ansteigenden intrazellulären osmotischen Druck folgender Wassereinstrom führt nach dem Überschreiten einer Toleranzgrenze zur
LITERATUR
7
Zellnekrose (Carini et al. 1995). Nach Absterben benachbarter Zellen und der damit verbundenen Freisetzung von schädigungsassoziierten molekularen Mustern (Damage- associated molecular patterns; DAMPs) sezernieren Gewebsmakrophagen, als Hauptmediatoren der Entzündungsreaktion (Kmiec 2001), primäre proinflammatorische Zytokine wie Interferon-γ (INF-γ), Interleukin- 6 (IL-6) und Tumor Nekrose Faktor-α (TNF- α). Unter dem Einfluss primärer proinflammatorischer Zytokine werden immunkompetente Zellen (u.a. Endothelzellen, Fibroblasten, Makrophagen, Granulozyten und Lymphozyten) aktiviert (Bode und Heinrich 2001; Chen und Nunez 2011). Wird die Leber zeitnah nach der Tötung entnommen und gekühlt, kann die Entzündungsreaktion weitestgehend unterbunden werden, denn durch eine Temperatur von 4°C wird die Stoffwechselrate und damit der Sauerstoffbedarf gesenkt (Olinga et al. 1998). Doch auch das Lösen der Leberzellen aus dem Zellverband mittels Kollagenaseverdau im Verlauf der Isolation und die Reperfusion des Lebergewebes führen zu Schäden der Leberzellen. Während ischämisch bedingte Gewebeschäden hauptsächlich auf eine zelluläre Nekrose zurückzuführen sind, ruft die Reperfusion eine entzündliche Reaktion vorrangig durch die Aktivierung der Kupfferzellen hervor. Kupfferzellen, bei denen während der kalten Ischämie keine signifikanten strukturellen Veränderungen festzustellen sind, bilden bei Reperfusion der Leber eine starke Vakuolisierung und Aufrauung der Zell-Oberfläche aus. Die Phagozytoserate wird gesteigert und eine große Anzahl proinflammatorischer Mediatoren, freier Radikale, TNFα, Interleukine (IL-1, IL-6), Prostaglandine und Stickstoffmonoxid (NO) sezerniert (Schemmer et al. 2005).
Diese Sekretion proinflammatorischer Zytokine, allen voran IL-6, führt in Folge zu einer entzündlichen Reaktion auch in den Hepatoyzten (Bode und Heinrich 2001).
2.2.2 Dedifferenzierung kultivierter Hepatozyten
Allgemein wird die Differenzierung von einem ursprünglich epithelialen zu einem mesenchymalen Zelltyp als „epithelial-mesenchymal transition“ (EMT) bezeichnet. In vivo kann EMT in verschiedenen Situationen beobachtet werden. Kalluri und Weinberg (2009) charakterisieren drei verschiedene Arten von EMT: Typ 1-EMTs werden in Zusammenhang mit Organentwicklung – beziehungsweise der Embryogenese – bei der Entwicklung der verschiedenen Keimblätter beobachtet (Thiery und Sleeman 2006). Typ 2-EMTs sind mit
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Entzündungen assoziiert und treten als Teil eines Reparaturprozesses auf, sobald eine Entzündung abebbt. Typ-3-EMTs treten in neoplastischen Zellen auf. Den Typ 2-EMT kann man auch in vitro beobachten. In vitro sind der Verlust der Zytoarchitektur und Hypoxie während der Ischämiezeit und der Perfusion während der Isolation ausschlaggebende Auslöser der zuvor beschriebenen Entzündungsreaktionen (siehe auch Kapitel 2.2.1). Es werden eine Vielzahl von Zellen rekrutiert, darunter am prominentesten aktivierte Makrophagen und residente Fibroblasten, die durch die Freisetzung von Wachstumsfaktoren diese EMT auslösen können. Als einer der stärksten EMT-Induktoren gilt dabei der transformierende Wachstumsfaktor (TGF)-β, aber auch der Epithelwachstumsfaktor (Meyer et al. 2013), der Fibroblastenwachstumsfaktor (Strutz et al. 2002), und der Hypoxie-induzierte Faktor (Higgins et al. 2007) spielen eine Rolle bei EMT. Darüber hinaus setzen aktivierte Makrophagen Chemokine frei, woraufhin Epithelzellen, die diese Signale empfangen, Kernmembranschädigung und den fokalen Abbau von Typ IV Kollagen und Laminin induzieren (Kalluri und Weinberg 2009). So wird das hepatozelluläre Gleichgewicht in Richtung eines proliferationsorientierten und somit weniger differenzierten Zellphänotyps verschoben (Elaut et al. 2006; Paine und Andreakos 2004; Vinken et al. 2014). Dabei lässt sich die Manifestation von EMT in zwei vorwiegend parallel ablaufende Prozesse differenzieren: zum einen in den Prozess der teilweisen oder vollständigen Auflösung der epithelialen Differenzierungseigenschaften und zum anderen in die gleichzeitige Ausbildung mesenchymaler Eigenschaften. Marker dieser zellbiologischen Veränderungen sind der Austausch des Zelladhäsionsmoleküls E-Cadherin durch N-Cadherin in den adhärenten Übergängen von Zellen, die EMT durchlaufen und auch die Expression neuer Zytoskelettfilamente wie die Zwischenfilamente, die Vimentin oder spezifische Cytokeratine enthalten (Kalluri und Weinberg 2009).
Hepatozyten, die in vitro kultiviert werden, verlieren nach wenigen Tagen ihre quadratische Morphologie, flachen ab und bilden spindelförmige fibroblastenähnliche Ausläufer (Guguen- Guillouzo und Guillouzo 2010). Wesentliche Merkmale primärer Hepatozyten, wie die Zellpolarität, Bildung gallengangsähnlicher Kanälchen und der dadurch ermöglichte Gallentransport, enzymatische Aktivitäten und metabolische Funktionen gehen dabei schrittweise verloren. Dieser EMT stellt ein Merkmal der sogenannten Dedifferenzierung von Hepatozyten in vitro dar (Godoy et al. 2010), wobei diese Dedifferenzierung einen Verlust
LITERATUR
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zelltypischer Merkmale eigentlich ausdifferenzierter Zellen anzeigt. O’Neill et al. (2014) zeigen, dass dedifferenzierte primäre Hepatozyten sogenannte duktale Eigenschaften erwerben und dadurch eine partielle Transdifferenzierung von Hepatozyten zu einem Gallengang-Phänotyp vollziehen.
Darauf basierend wurde in den vergangenen Jahren an vielen Ansätzen für die Optimierung von Kulturbedingungen geforscht, um die Dedifferenzierung zu verhindern, beziehungsweise im kleinstmöglichen Rahmen zu halten. Copple (2010) verdeutlichte, auf dem Hypoxie- induzierenden Faktor basierend, die Auswirkung von Hypoxie bei dem EMT-Geschehen, indem er EMT von Hepatozyten aus Mäuselebern, welche 1% O2 ausgesetzt waren, mit Hepatozyten, die unter Raumluft kultiviert wurden, verglich. Er konnte bei den Hepatozyten, die der Hypoxie ausgesetzt waren, eine deutliche Expression von α-Muskel-Actin, Vimentin, Snail und Fibroblasten-spezifischem Protein-1 feststellen, während die Expression von E- Cadherin und Zona-Occludens-1 deutlich verringert war. Dem entgegen zeigten jüngste Studien von Guo et al. (2017), dass hohe Sauerstoffkonzentrationen die Dedifferenzierung der Leberzellen begünstigen, während niedrige Konzentrationen positive Auswirkungen zu haben scheinen. Die Autoren argumentierten mit der physiologisch niedrigen Sauerstoffumgebung von Hepatozyten, die beim Menschen eine Konzentration von 5,4 ± 0,7% ausmacht. So wurde durch die Senkung der Sauerstoffkonzentration von 21% O2 auf 5% O2 die Albuminproduktion, die Glykogenspeicherung, die LDL-Aufnahme und der CYP450- vermittelte Arzneimittelmetabolismus verbessert und die epitheliale Morphologie aufrechterhalten. Zusätze anderer Wachstumsfaktoren, in den meisten Studien handelte es sich hierbei um EGF, führen zu einer erhöhten Produktion von Albumin und einer Hepatozytenproliferation bei gleichzeitiger Erhöhung der Vimentin- und Cytokeratin- Expression, die interessanterweise keine Veränderung der Epithel-Morphologie nach sich zieht (Pagan et al. 1997). In mehrwandigen Ko-Kultursystemen, auf elastomeren Schablonen für menschliche Leberzellen und Maus-3T3-J-Fibroblasten basierend, können Hepatozyten ihre phänotypischen Funktionen für mehrere Wochen beibehalten (Khetani und Bhatia 2008).
Denselben Ansatz verfolgen Godoy et al. (2009) mit einer 3D-Kultur der Hepatozyten. Sie zeigen, dass durch die Verwendung weicher Kollagengele in der Sandwichkultur die Hochregulation der EMT-Marker-Expression vermieden und die runde Form und Polarität der Hepatozyten zu großen Teilen bewahrt werden kann. Dies stellt eine erhebliche Verbesserung
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zu der konventionellen Verwendung starren Kollagens in Monolayern dar, welches schnell zu einer fibroblastenähnlichen Morphologie, einem Verlust der Polarität und der Hochregulation von EMT-Markern wie Vimentin führt. In dem Versuch, die in vivo-Mikroumgebung der Leber nachzuahmen, wurde in vitro mit der Ko-Kultivierung von Hepatozyten und nicht- parenchymalen Zellen zur Konservierung und Modulation des Hepatozyten-Phänotyps experimentiert. Die Zellinteraktionen zwischen parenchymalen Zellen und nicht- parenchymalen Nachbarn modulieren sowohl das Zellwachstum (siehe Kapitel 2.3.2) als auch die (De-)Differenzierung der Zellen. Da Makrophagen durch die Freisetzung von Wachstumsfaktoren während der Zellisolation einen bedeutenden Einfluss auf die Dedifferentierung der Hepatozyten haben, ist bei der Ko-Kultivierung mit diesen Zellen die Art der Makrophagenaktivierung für Differenzierung oder Dedifferenzierung der Hepatozyten von Bedeutung (Meyer et al. 2013). Godoy et al. (2010) untersuchten den Einfluss von Insulin und Dexamethason auf die Dedifferenzierung. Sie kamen zu dem Ergebnis, dass Dexamethason der Ausbildung der Fibroblastoid-Form vorbeugt, wobei das Expressionsniveaus sowohl von Vimentin als auch von Snail-1 reduziert wird, während Insulin die Bildung von Gallen Canaliculi begünstigt. Auch die Behandlung der Zellen mit DMSO zeigte eine positive Beeinflussung zugunsten höherer Albuminspiegel und gleichzeitig reduzierter Cytokeratinspiegel im Vergleich zu nicht behandelten Zellen (Pagan et al. 1997).
Darüber hinaus hemmt es die Zellproliferation, den Erwerb der fibroblastenähnlichen Morphologie und die für die EMT typische Vimentin-Expression.
LITERATUR
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Ko-Kultivierung primärer boviner Hepatozyten mit Kupfferzellen
Um spezifische Zell-Zell-Wechselwirkungen und Einflüsse von nicht-parenchymalen Zellen auf Hepatozyten zu charakterisieren, aber auch mit dem Ziel, hepatische Funktionen von Hepatozyten in Kultur optimal aufrecht zu erhalten, wurden in den vergangenen Jahrzehnten verschiedenste Ko-Kulturmodelle entwickelt. Je nach Fragestellung der Studien wurden unterschiedliche hepatische NPC-Fraktionen, wie Kupfferzellen, Sinusendothelzellen oder hepatische Sternzellen entweder einzeln oder kombiniert verwendet. Die Verwendung nur einer der NPC-Fraktionen kann im Hinblick auf die Möglichkeit der Methode, die Mehrfachfunktionalität der Leber darzustellen, kritisiert werden (Bale et al. 2016), hat aber auch Vorteile, wenn es darum geht, die Kommunikation zwischen zwei verschiedenen Zelltypen zu untersuchen. In anfänglichen Studien wurden die Hepatozyten mit dem gesamten NPC-Material ohne vorherige Aufteilung der einzelnen Fraktionen ko-kultiviert (Shimaoka et al. 1987). Da diese Methode keine Kontrolle der Mengenverhältnisse jeweiliger Zellfraktionen zulässt, war mit ihr keine Charakterisierung der Funktionen einzelner NPC- Fraktionen möglich. Mittlerweile existieren komplexe Protokolle, die es ermöglichen, jede NPC-Fraktion einzeln zu isolieren (Bale et al. 2016). Neben der Ko-Kultivierung hepatischer nicht-parenchymaler Zellen, wurden zahlreiche Studien beschrieben, in denen extrahepatische nicht-parenchymale Zellen, wie beispielsweise Peritonealmakrophagen (Keller et al. 2009), canine Nierenepithelzellen (Donato et al. 1991) oder dermale Fibroblasten von Ratten (Goulet et al. 1988) mit Hepatozyten ko-kultiviert wurden. Eine Alternative für Ko-Kulturen von Hepatozyten mit hepatischen Kupfferzellen besteht in der Verwendung von blut-abgeleiteten Makrophagen, mit dem entscheidenden Vorteil, dass man die durch den Isolationsprozess unweigerlich erfolgende Aktivierung der Kupfferzellen aus der Leber umgeht (Godoy et al.
2013). Verschiedene Autoren bewerteten die Ko-Kultivierung mit extrahepatischen NPC kritisch, weil sie die Funktionen der spezialisierten Zellen in der Leber nicht reproduzieren können (Bhatia et al. 1999; Godoy et al. 2013). Daher wurden verschiedene Verfahren beschrieben, Makrophagen aus demselben Lebergewebe zu isolieren, aus dem auch die Hepatozyten stammen. In einem Großteil der Studien wurde die nicht-parenchymalen Zellfraktion nach Pronase- oder Kollagenase-Verdau der Leber durch einen Ein-Dichte- Gradienten-Zentrifugationsschritt angereichert, und die Kupfferzellen aus der NPC-Fraktion durch Zentrifugal-Elutriierung isoliert (Bale et al. 2016; Olynyk und Clarke 1998). Smedsrød
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et al. (1985) veröffentlichten ein Protokoll für die Aufbereitung von hepatischen Makrophagen und Sinusendothelzellen aus der Maus. Durch einen Zentrifugationsschritt wurden die parenchymalen Zellen von den nicht-parenchymalen Zellen (NPC) getrennt.
Durch eine Dichtezentrifugation mit zwei unterschiedlichen Dichtegradienten konnten die Kupfferzellen zusammen mit den Sinusendothelzellen aus der übrigen NPC-Fraktion selektiert werden. Für die weitere Auftrennung machten sich Smedsrød et al. die selektive Adhäsion von Kupfferzellen an unbehandeltem Glas oder Plastik zunutze. Wenige Minuten nach der Aussaat der Zellen auf diese Oberfläche konnte das Medium mitsamt den Sinusendothelzellen heruntergespült werden, wobei nur noch die Kupfferzellen an der Oberfläche haften blieben. Andere Protokolle beschreiben die Aufreinigung von NPC- Material durch Fluorescence-basierte Zellsortierung (fluorescence-activated cell sorting;
FACS) (He et al. 2015). Auch die Zellaufreinigung mittels Magnet-gekoppelter Antikörper (Miltenyi et al. 1990), die Makrophagen-spezifische Oberflächenantigene binden, wurde beschrieben. Bei den verschiedenen Verfahren und Autoren betrug die Zellausbeute ungeachtet der Tierart des Spenders durchschnittlich 80-120 x 10^6 Kupfferzellen pro Leber.
In der Literatur sind verschiedene strukturelle Methodiken zur Ko-Kultivierung von primären Hepatozyten mit Makrophagen beschrieben. Koike et al. (1996) arbeiteten mit einem Monolayer, auf welchem die Makrophagen in direkten Kontakt mit den Hepatozyten ausgesät wurden. Vergleichend entwickelten sie ein Sandwich-System, bei dem die Hepatozyten direkt mit Makrophagen beschichtet und danach erst die zweite Kollagenschicht aufgetragen wurde.
Während der morphologische Status der Hepatozyten in Sandwichkultur für bis zu drei Wochen weitestgehend aufrechterhalten blieb, begannen sich in dem Monolayer nach schon etwa drei Tagen sowohl Kupfferzellen als auch Hepatozyten abzulösen. Das hier gewonnene Ergebnis einer positiven Auswirkungen der Nutzung einer Sandwichkonfiguration deckt sich mit Ergebnissen aus Studien mit Monokulturen und lässt sich mit der durch die zweite Kollagenschicht ermöglichte Aufrechterhaltung der kubitalen Zellmorphologie über apikale und basale Membranen erklären (Dunn et al. 1989). Leberzellen im Monolayer dagegen bilden ein Aktin-Zytoskelett aus, bekommen dadurch ein "Fibroblasten-artiges" Aussehen und sterben innerhalb von wenigen Tagen (Guguen-Guillouzo und Guillouzo 2010). Als weiterer Effekt der Ko-Kultivierung von Hepatozyten mit NPC-Material konnte eine signifikant erhöhte Harnstoffsynthese festgestellt werden (Koike et al. 1996).
LITERATUR
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In beiden Modellen von Koike et al. ist ein direkter Kontakt von Hepatozyten zu Makrophagen gegeben. Dementgegen beschreiben Bader et al. (1996) ein Modell, bei dem sich die Hepatozyten getrennt von der NPC-Fraktion zwischen zwei Kollagenschichten befinden. Die NPC-Fraktion aus demselben Isolationsverfahren wurde im Anschluss über die zweite Kollagenschicht gegeben. Mit diesem Modell beziehen sich Bader et al. auf die in vivo Situation, in welcher die hepatischen nicht-parenchymalen Zellen von parenchymalen Zellen durch eine extrazelluläre Matrix (ECM) getrennt sind und nur durch das Sinusendothel hindurch miteinander kommunizieren (siehe Kapitel 2.1.2). Neben der Ausbildung von gallengangsähnlichen Kanälchen an interzellulären Kontaktzonen durch die kubitalen Hepatozyten konnte beobachtet werden, dass sich auch die nicht-parenchymalen Zellen ähnlich den in vivo beobachteten Begebenheiten formierten. Die Kupfferzellen siedelten sich auf Endothelzellen an, während die durch ihre intrazytoplasmatischen Lipidtröpfchen identifizierten Ito-Zellen sich gleichmäßig auf der Kollagenoberfläche verteilten. Ein ähnliches Modell verwenden auch Bale et al. (2016) mit der Besonderheit, dass die Kupfferzellen nicht direkt auf die zweite Kollagenschicht gegeben wurden, sondern zusammen mit den Endothelzellen erst 24 Stunden in einem sogenannten „Transwell“
kultiviert wurden, bevor sie dem Hepatozytensandwichmodell zugefügt wurden. Dies ermöglicht nicht nur eine Erholung von dem mit einer Entzündungsreaktion assoziierten Isolationsprozess, sondern auch die einfache Trennung der Zellfraktionen für gegebenenfalls folgende Zellanalysen. Auch verschiedene andere Studien lassen erkennen, dass unter anderem der Abstand zwischen Makrophagen und Hepatozyten und der direkte Zell-Zell- Kontakt eine entscheidende Rolle bei der Ausprägung der die Hepatozyten schädigenden Entzündungsreaktion durch Makrophagen spielen. So erweisen sich in vitro die Bedingungen, die einen direkten Zell-Zell-Kontakt zwischen Makrophagen und Hepatozyten ermöglichen, als besonders schädlich für Hepatozyten. Nach einer Stimulation mit Lipopolysacchariden (LPS) werden in Ko-Kulturen von Hepatozyten mit Kupfferzellen in direktem Zell-zu-Zell Kontakt bis zu zehnfach höhere TNF-α und IL-6-Konzentrationen gemessen als in Monokulturen oder in Ko-Kulturen mit indirektem Zell-zu-Zell Kontakt (Hoebe et al. 2001;
Wu et al. 2006). Auch die Freisetzung reaktiver Sauerstoffspezies in das Kulturmedium ist in Ko-Kulturen mit direktem Kontakt der beiden Zelltypen zueinander signifikant erhöht(Hoebe et al. 2001). Bei Ko-Kulturen, in denen lediglich interzelluläre Kommunikation zwischen
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Makrophagen und Hepatozyten über lösliche Mediatoren ermöglicht wird, konnten hepatoprotektive Effekte von den Makrophagen auf die Hepatozyten festgestellt werden.
Nach einer Stimulation mit LPS weisen diese Kulturen erhöhte Konzentrationen der anti- inflammatorischen Zytokine IL-10 und IFN-β auf, während die TNF-α Konzentrationen signifikant niedriger sind als in der Monokultur (Petrasek et al. 2012). Auch Zinchenko et al.
(2006) zeigten in ihrer Studie, dass durch mikrostrukturierte Ko-Kulturen von Hepatozyten und Kupfferzellen, in welchen die relative Nähe eines Zelltyps zu einem anderen genau kontrolliert werden kann, hepatozelluläre Funktionen besser erhalten werden können.
LITERATUR
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2.3.1 Wechselwirkungen zwischen Hepatozyten und Kupfferzellen
Die über 500 der Leber zugeschriebenen Funktionen erfordern ein vielschichtiges, weitestgehend noch unverstandenes Zusammenspiel von parenchymalen und nicht- parenchymalen Zellen. Dieses ist eng mit der komplexen Anordnung der verschiedenen hochspezialisierten Zelltypen verbunden, die in den sinusförmigen Einheiten vertreten sind.
Die Insulin-Sensitivität der Hepatozyten beispielsweise ist vorwiegend durch Kupfferzellen bestimmt. Hierbei steigert Glucagon die Synthese von PGE2-, PGF2-alpha- und PGD2- Synthese in Kupffer-Zellen. Da Prostaglandine eine Glucagon-antagonistische Wirkung besitzen, kommt es zur Inhibition der Glucagon-stimulierten Gylgogenolyse (Hespeling et al.
1995). Solche Interaktionen sind für die Milchkuh bisher nur rudimentär verstanden und die Etablierung des Ko-Kultursystems in Zusammenhang mit dieser Arbeit trägt dazu bei, das komplexe Zusammenspiel in der Leber zwischen endokrinen und immunen Faktoren zukünftig besser verstehen zu können. Auch der oxidative Stoffwechsel in Parenchymzellen kann durch von Kupfferzellen synthetisierten und sezernierten Faktoren direkt moduliert werden. Hepatozyten, die mit Makrophagen ko-kultiviert wurden, weisen im Vergleich zu Kontrollen ohne Kupfferzellen eine Abnahme der Fettsäureoxidation um etwa 25% auf (Nguyen et al. 2015). Neben der Hauptfunktion der Nährstoffaufnahme und-speicherung in der Leber besteht eine überlebenswichtige Aufgabe in der Immunabwehr. In vivo werden potentiell schädigende Stoffe wie Darm-assoziierte Mikroorganismen, aber auch Toxine und Medikamente über die Portalvene in die Leber transportiert. Aufgrund ihrer Lokalisation in dem Lumen der Lebersinusoide, wo sie den Endothelzellen anhaften, gehören Kupfferzellen zu den ersten Zelltypen, die mit diesen Substanzen konfrontiert sind. Auf den entzündlichen Stimulus angepasst, ändert sich der Phänotyp der Kupfferzellen und damit auch seine Kommunikation mit der Umwelt. Für ein besseres Verständnis dieser Zell-zu-Zell- Interaktionen wurden in den vergangenen Jahren vermehrt in vitro-Versuche mit gesonderten Ko-Kulturen von Hepatozyten und Kupfferzellen durchgeführt. Ergebnisse dieser Studien zeigten immer wieder, dass Kupfferzellen sowohl im physiologischen als auch im pathologischen Zustand eine wichtige Rolle bei der Modulation von Hepatozyten spielen. In Abwesenheit von entzündlichen Reizen sind Kupffer-Zellen in Ko-Kulturen in der Lage, die Hepatozyten-Proteinsynthese zu stimulieren (West et al. 1989), wohingegen Kupfferzellen auf anfängliche Schädigungen und Entzündungen mit einer Sekretion von
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proinflammatorischen Enzymen reagieren. In Tabelle 1 sind die Funktionen der wichtigsten von Kupfferzellen produzierten Zytokine dargestellt. Durch interzelluläre Kommunikation über lösliche Mediatoren sind Hepatozyten in der Lage, proinflammatorische Funktionen der Kupfferzellen zu modulieren und hepatoprotektive Effekte auszulösen. So synthetisieren LPS- stimulierte Kupfferzellen in vitro signifikant mehr IL-10 und IFN-β, wenn sie mit primären Hepatozyten ko-kultiviert werden. Gleichzeitig können niedrigere TNF-α-Werte festgestellt werden (Bale et al. 2016; Petrasek et al. 2012). Die Leber zeichnet sich durch eine bemerkenswerte Regenerationsfähigkeit aus. Nach partieller Hepatektomie kommt es in Nagetiermodellen innerhalb von zehn Tagen zu einer kompletten Wiederherstellung der ursprünglichen Lebermasse (Kren und Steer 1996). Eine dominante Rolle in diesem Regenerationsgeschehen wird auch hier vorrangig den Kupfferzellen durch die Produktion zahlreicher Wachstumsfaktoren und immunmodulierender Mediatoren beigemessen (Selzner et al. 2003; Meijer et al. 2000). Eine Kupfferzellverarmung, die mit verminderten TNF-α- und IL-6-Spiegeln (N. Selzner et al. 2003), einer geringen Expression von IL-10, HGF und TGF- b1 (Meijer et al. 2000) assoziiert ist, führt zu einer signifikant verschlechterten Regeneration nach partieller Heparektomie. Selzner et al. schlussfolgern aus ihren Versuchen, dass ein Versagen der Regeneration aus der Unfähigkeit der Leber resultiert, eine adäquate Entzündungsreaktion zu erzeugen. TNF-α und IL-6, die im Rahmen der Akuten-Phase- Reaktion von Kupfferzellen sezerniert werden, stellen die wichtigsten Wachstumsfaktoren bei der Hepatozytenproliferation in vivo dar. Tiere, deren Leber ischämisch vorbeschädigt war, zeigten signifikant niedrigere IL-6-Konzentrationen. Die Regenerationsrate nach partieller Hepaektomie war hier bedeutend eingeschränkt. Die Zugabe von IL-6 führte zu einer wieder verbesserten Regeneration (Selzner et al. 1999). In Ko-Kulturen von Hepatozyten mit Kupfferzellen hat IL-6 zudem eine fördernde Wirkung auf die IGFBP-1- und IGFBP-4- Expression der Hepatozyten und die IGFBP-3-Expression in Kupfferzellen, während es die Expression von IGF-I supprimiert (Lelbach et al. 2001). Neben GH, dem Hepatozyten- Wachstumsfaktor (Hepatocyte-growth-factor, HGF) und dem epidermalen Wachstumsfaktor (epidermal-growth-factor, EGF) werden während der Leberregeneration vorrangig die IGF- und IGFBP-Expression stimuliert (Godoy et al. 2013; Mohn et al. 1991). Zirkulierendes IGF- 1 ist vorwiegend an IGFBP-3 gebunden, welches insbesondere von Kupfferzellen exprimiert wird (Scharf et al. 1996).
LITERATUR
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Tabelle 1: Funktionen verschiedener von Kupfferzellen produzierten Zytokinen modifiziert nach Roitt (1993)
Zytokine Herkunft Funktion
Interleukine
IL-1 Makrophagen Proliferation aktivierter B- und T- Zellen
Induktion von PGE2 und Zytokinen durch Makrophagen
Induktion von IL-6, IFN-β1 und GM-CSF Induktion von Fieber, Akute-Phase-Proteinen
IL-6 CD4-T,
Makrophagen, Mastzellen, Fibroblasten
Wachstum und Differenzierung von T-und B-Zell- Effektoren und hämatopoetischer Vorläuferzellen Akute-Phase-Proteine
IL-10 T-Zellen, Makrophagen
Wirksamer Inhibitor von Makrophagen und T-Zellen Hemmung von IFN-γ Sekretion
IL-12 B-Zellen, Makrophagen
Aktivierung von NK-Zellen
IL-13 TH2-Helfer-Zellen stimuliert Differenzierung von B-Lymphozyten inhibiert die Aktivierung von Makrophagen Tumor-Nekrosefaktoren
TNF-α Makrophagen Makrophagenaktivierung Nekrosen im Tumorgewebe
TNF- β CD4-T Induktion von Akute-Phase-Proteinen Aktivierung von Phagozyten
Induktion von IFN-γ, TNF-α, IL-1, GM-CSF
18 Interferone IFN-γ TH1-Zellen,
(Makrophagen)
MHC-I- und MHC-II-Hochregulierung Makrophagenaktivierung
Andere GM-CSF T-Zellen,
Makrophagen Fibroblasten, Endothelzellen, Mastzellen
Aktivierung von Makrophagen
Wachstum von Granulozyten und Makrophagen- Kolonien
GM-CSF = Granulozyten-Monozyten-Kolonie-stimulierende Faktor; IL = Interleukin; IFN = Interferon; NK-Zellen = natürliche Killerzellen; PG = Prostaglandin; TNF = Tumor-Nekrose-Faktor
LITERATUR
19 2.3.2 Aktivierung von Makrophagen
Ende des 19. Jahrhunderts entdeckte Elie Metchnikoff bei der Beobachtung von Starfischlarven Zellen, die in der Lage waren, Partikel aufzunehmen, die in den Verdauungstrakt der Larven gelegt worden waren. Für diese erstmalige Beschreibung der Phagozytose erlangte Elie Metchnikoff Anfang des 20. Jahrhunderts den Nobelpreis für Physiologie und Medizin (Gordon 2008; Kaufmann 2008). Heute differenziert man diese Zellen, die Metchnikoff damals noch generalisierend als Phagozyten bezeichnete, in Granulozyten, Monozyten, Makrophagen und natürliche Killerzellen. Die größte Population von ortständigen Gewebemakrophagen des Körpers stellen die Kupffer-Zellen, die sich als residente Makrophagen in der Leber befinden, dar. Durch ihre Lokalistation im Endothelium der Leberblutgefäße besteht ihre Aufgabe darin, Pathogene zu phagozytieren, bevor diese über den Blutkreislauf in das Lebergewebe gelangen. Darüber hinaus eliminieren Kupfferzellen apoptotische endogene Zellen und recyceln Nährstoffe durch Verdauung von Stoffwechselnebenprodukten aus Geweben. Bei der Ausführung dieser Aufgaben befinden sich diese Zellen normalerweise im Ruhezustand, können aber durch eine Vielzahl von Signalen im Rahmen einer Entzündungsreaktion aktiviert werden (Duque und Descoteaux 2014).
Die Funktion und Anzahl der potentiell hemmenden oder aktivierenden Faktoren in einer Gewebsmikroumgebung von Makrophagen ist sehr vielfältig und auch Makrophagen- aktivierende Stimuli wie zum Beispiel LPS können eine Vielzahl verschiedener Genexpressionen induzieren (Stout et al. 2005). Trotzdem lassen sich die Reaktionsmuster von leberständigen Makrophagen auf angeborene oder adaptive Immunsignale grob, wie folgt, in drei verschiedene Gruppen einteilen (Mosser und Edwards 2009).
Klassisch aktivierte Kupfferzellen, außerdem als M1-Makrophagen bezeichnet, werden als Reaktion auf eine Kombination von zwei Signalen gebildet. IFNγ, welches beispielsweise durch angeborene Immunzellen, wie natürliche Killerzellen oder Makrophagen selber produziert wird, stellt das erste Signal dar (Gordon und Martinez 2010). Das zweite Signal erfolgt durch die Aktivierung von toll-like Rezeptoren (TLRs), intrazellulären Mustererkennungsrezeptoren und Interleukin-1-Rezeptoren (IL-1R) durch bestimmte molekulare Muster (Tabelle 2). Die TLR-Aktivierung führt zur Ausschüttung pro-
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inflammatorischer Zytokine (z.B.: IL-1, IL-6, TNF-α, TGF-β, INF-γ, EGF und LIF, etc.) (Gordon und Martinez 2010).
Alternativ aktivierte Kupfferzellen, oder M2-Makrophagen entstehen unter dem Einfluss von Interleukin 4 und/oder Interleukin 13 (Stein et al. 1992; Wynn et al. 2014) (Tabelle 2). Sie verfügen über antiinflammatorische Funktionen und haben eine große Bedeutung bei der Wundheilung. Diese Makrophagen sind keine Antigen-präsentierenden Zellen, haben aber eine regulatorische Funktion, indem sie eine T-Zell-Proliferation und möglicherweise die klassische Aktivierung weiterer Makrophagen im Umfeld supprimieren können.
Eine dritte Gruppe stellen, als Untergruppe der alternativ aktivierten Kupfferzellen, die regulatorischen Kupfferzellen dar. Wie bei der klassischen Aktivierung werden bei der Aktivierung regulatorischer Makrophagen zwei Signale benötigt (Tabelle 2). Als Priming- Signal können neben apoptotischen Zellen oder IL-10 Prostaglandine, Immunkomplexe, Adeninnukleotide oder Glukokortikoide dienen. Das zweite Signal stellt die Stimulation über TLRs dar (Mosser und Zhang 2010). Cvetanovic et al. (2004) zeigten, dass es bei der Bindung von apoptotischen Zelltrümmern an TLR zu einer sofortigen Hemmung der proinflammatorischen Zytokin-Gen-Transkription kommt. In einem in vitro Modellsystem konnten Voll et al. (1997) zeigen, dass die Anwesenheit von apoptotischen Zellen während der Monozytenaktivierung deren IL-10-Sekretion erhöht und die Sekretion der proinflammatorischen Zytokine TNF-α, IL-1 und IL-12 senkt.
Einmal aktivierte Makrophagen können, sobald der die Aktivierung initiierende Reiz durch Phagozytose entfernt wird, wieder in den präinflammatorischen Phänotyp zurückgelangen.
Makrophagen können ihren funktionellen Phänotyp in Reaktion auf fortschreitende Veränderungen der Umweltsignale schrittweise verändern. So ist es den leberständigen Makrophagen möglich, von einem funktionellen Phänotyp zu einem anderen überzugehen , wenn sich die mikroumweltlichen Einflüsse ändern (Stout et al. 2005).
LITERATUR
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Tabelle 2: Stimuli für klassische und alternativ aktivierte Makrophagen
IL = Interleukin; IFN = Interferon; TGF = Transforming growth factor; TLR = Toll like receptor
Makrophagenaktivierung Stimulus
Klassisch 1. Signal:
2. Signal:
IFN-γ (und proinflammatorische Zytokine) Bakterielle Lipoproteine (durch TLRs) Bakterielle DNA (durch TLRs)
Parasitische Proteine/Lipoproteine (durch TLRs) Hypoxie
abnorme Matrix
Alternativ
Regulierend 1. Signal:
2. Signal:
IL-4, IL-13 IL-10
Glukokortikoide, apoptotische Zellen, TGF-β Bakterielle Lipoproteine (durch TLRs) Bakterielle DNA (durch TLRs)
Parasitische Proteine/Lipoproteine (durch TLRs) Hypoxie
abnorme Matrix
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Einsatz von Entzündungshemmern in Hepatozytenkulturen
Um die oben beschriebene inflammatorische Reaktion, die während der Isolation von Hepatozyten, vor allem durch Makrophagen bedingt, auftritt, zu unterbinden, und mit dem Ziel, die Dedifferenzierungstendenz der Zellen zu supprimieren, ist der Einsatz von Entzündungshemmern in der Kultur üblich. In Modellen, die in der Forschung im Themenbereich Toxikologie oder Leberversagen verwendet werden, ist die Zugabe von Entzündungshemmern oft nicht von Vorteil, da eventuell auftretende entzündliche Reaktionen, die zum Beispiel durch zu testende Substanzen hervorgerufen werden, verdeckt werden. Auch Studien mit Kurzzeitmodellen kommen oft ohne Entzündungshemmer aus (Mátis et al. 2016; Petrasek et al. 2012; Severgnini et al. 2012). Sollen jedoch in Langzeitstudien physiologische Funktionen der Hepatozyten, wie zum Beispiel der Zellstoffwechsel oder die Funktion und Regulation zellspezifischer Gene untersucht werden, ist Entzündungshemmung von Vorteil, da es sonst schnell zu einem Verlust der Zellfunktionalität der Hepatozyten kommt (Powanda et al. 1972). Dabei stellen die am häufigsten verwendeten Entzündungshemmer Dexamethason, Hydrocortison und Prednisolon Vertreter der Glukokortikoide dar (Auth et al. 1998; Bale et al. 2016; Dunn et al. 1991). Als relativ kostengünstiges und leichtlösliches Agens wird auch Dimethylsulfoxid (DMSO; 1%) häufig als Mediumzusatz verwendet (Panda et al. 2015). Als nicht-steroidaler Entzündungshemmer findet auch Aspirin in der Zellkultur Anwendung (Sakitani et al. 1997).
Die durch diese Substanzen verursachte Entzündungshemmung setzt im Grunde an zwei verschiedenen Punkten in der Entzündungskaskade an. Einen davon stellt der NF-κB- Signalweg dar. NF-κB ist ein dimerer Transkriptionsfaktor, der unter anderem Entzündungsreaktionen induziert. NF-κB wird in inaktiven zytoplasmatischen Komplexen durch κB-Inhibitorproteine (inhibitor of kappa B; IκB) gebunden und in dieser Form gehemmt. Proinflammatorische Zytokine, LPS, Wachstumsfaktoren und Antigenrezeptoren induzieren die Phosphorylierung der IκB-Proteine, woraufhin diese durch einen zellulären Kinasekomplex (IKK) proteosomal abgebaut werden. Dadurch freigesetzte NF-κB-Dimere sind nun in der Lage, zum Zellkern zu gelangen und dort spezifische Zielgene zu aktivieren, die dann wiederum die Expression von zahlreichen Genen regulieren, die unter anderem die angeborene und adaptive Immunität, Entzündung, Stressreaktionen, B-Zell-Entwicklung und
LITERATUR
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lymphoide Organogenese beeinflussen (Lawrence 2009). Neben der Aktivierung des NF-κB- Signalwegs stellt die Hemmung der Prostaglandinbiosynthese durch Eingriff in den Arachidonsäurestoffwechsel einen weiteren Angriffspunkt der Entzündungshemmung dar. Da den vorgeschlagenen Entzündungshemmern unterschiedliche pharmakodynamische Wirkungen zu Eigen sind, variiert sowohl Intensität und Spezifität der Entzündungshemmung.
2.4.1 Glukokortikoide
In der Zellkultur sind Glukokortikoide die am häufigsten eingesetzten Entzündungshemmer.
Glukokortikoide sind physiologische Hemmer entzündlicher Reaktionen. Das natürliche Glukokortikoid Cortisol (Hydrocortison) wird in einem zirkadianen Rhythmus in der Nebennierenrinde aus Cholesterol gebildet. Der im Hypothalamus gebildete Corticotropin releasing factor (CRF) fördert im Hypophysenvorderlappen die Ausschüttung von Adrenocortikotropen Hormon (ACTH), welches wiederum die Cortisolbildung in der Zona fasciculata der Nebennierenrinde stimuliert. Die Ausschüttung proinflammatorischer Zytokine im Rahmen eines entzündlichen Geschehens stimuliert die Hypothalamus-Hypophysen- Nebennierenachse und damit eine vermehrte Sekretion von CRH und ACTH (Herman et al.
2016). Dexamethason, welches in der Zellkultur eingesetzt wird, hat eine 30- bis 40-mal stärkere glukokortikoide Potenz als das physiologische Cortisol oder das dementsprechende synthetische Hydrocortison (Karow und Lang-Roth 2018). Der Zusatz von Dexamethason wirkt sich in vitro positiv auf die Synthese von Leberproteinen wie Albumin mRNA aus, deren Konzentration ohne Zusatz von Entzündungshemmern nach einem Tag in Kultur sinkt (Moshage et al. 1985). Da die gemessene Albumin-Konzentrationen zwar im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollen signifikant höhere Werte aufweisen, aber zu keinem Zeitpunkt die Werte von frisch isolierten Zellen übersteigen, ist unklar, ob Dexamethason einen stimulierenden, einen stabilisierenden Effekt oder sogar eine Kombination aus beiden ausübt (Moshage et al. 1985). Wie bereits in Kapitel 2.2.2 erwähnt, hat Dexamethason auch einen positiven Einfluss auf den Erhalt epithelialer Eigenschaften der Hepatozyten in Kultur.
Hepatozyten in Kulturen ohne den Zusatz von Dexamethason dagegen nehmen spindelförmige Gestalt an und gleichzeitig gehen wesentliche enzymatische Aktivitäten und metabolische Funktionen verloren (Guguen-Guillouzo und Guillouzo 2010).
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Im Zytoplasma von Lymphozyten und Makrophagen befinden sich Glukokortikoidrezeptoren (GR), die im unligierten Zustand an Hitzeschockproteinrezeptoren gebunden sind. Die Bindung von Glukokortikoiden bewirkt die Dissoziation des Hitzeschockproteins und damit die Aktivierung der GR. Der Kortikoid-Rezeptor-Komplex transloziert vom Zytoplasma in den Zellkern, wo er durch die Bindung an „glucocorticoid responsive elements“ Zielgene entweder exprimiert oder auch supprimiert (Karow und Lang-Roth 1999). Ein Großteil der immunsupprimierenden Wirkungen von Glukokortikoiden wird durch die Hemmung des oben genannten Transkriptionsfaktors NF-κB vermittelt. Glukokortikoide können nach Bindung an Glukokortikoidrezeptoren NF-κB durch direkte Protein-Protein-Wechselwirkung hemmen (Karow und Lang-Roth 1999). Darüber hinaus sind Glukokortikoide in der Lage, die Transkription des IκBα-Gens zu induzieren, was zu einer erhöhten IκBα-Proteinsynthese führt. Wenn NF-κB aus IκBβ durch Stimulation mit TNF-α freigesetzt wird, bindet NF-κB schnell an das durch den Einfluss von Glukokortikoiden synthetisierte IκBα, wodurch die Menge an NF-κB, die an dem Zellkern ankommt, deutlich reduziert wird (Auphan et al. 1995;
Dekruyff et al. 1998; Scheinman et al. 1995). Das hat zur Folge, dass die Synthese zahlreicher proinflammatorischer Proteine, unter anderem die der proinflammatorischen Zytokine (IL-1, IL-2, IL-6), unterdrückt wird. In Ko-Kulturen mit Kupfferzellen wurde selbst eine LPS- induzierte Ausschüttung von TNF-α in der Anwesenheit von 1 µM Dexamethason um 80%
gesenkt, während die IL-6-Konzentration vollständig unterdrückt wurde. Die Ergebnisse von Rose et al. (2017) zeigen, dass Dexamethason hauptsächlich die Konzentrationen an proinflammatorischen Zytokinen, wie IL-6, IL-1α, IL-12, Granulozyten-Makrophagen- Kolonie-stimulierender Faktor und TNF-α deutlich reduziert, während antiinflammatorische Zytokine, wie IL-10 und IL-4 nur minimal beeinflusst werden. Mozo et al. (2004) wiederum konnten eine erhöhte IL-10-Expression in mit Dexamethason und anderen Steroiden vorbehandelten Monozyten nachweisen. Die Effekte der Glukokortikoide stellen sich dabei dosisabhängig und proportional zu der Steroidpotenz dar (Mozo et al. 2004; Rose et al. 2017).
Durch die Induktion der Synthese des Hemmproteins Lipocortin, das die Phospholipase A2- Synthese inhibiert, die die Verstoffwechselung von Phospholipiden zu Arachidonsäure leitet, greifen Glukokortikoide außerdem in den Arachidonsäurestoffwechsel ein. Da Glukokortikoide somit einen Schritt früher in den Arachidonsäurestoffwechsel eingreifen als NSAIDs, hemmen sie zusätzlich zu der Prostaglandinsynthese auch die Leuktriensynthese.
LITERATUR
25 2.4.2 DHEA
Dehydroepiandrosteron (DHEA) wird als Vorläufer der Sexualsteroide, katalysiert von Cytochrom P 450, über einige Schritte aus Cholesterol metabolisiert (Miller 2002). Den Hauptbildungsort von DHEA stellt die Zona reticularis der Nebennierenrinde dar, die Sekretion erfolgt primär in sulfatierter Form (DHEAS). Um allerdings eine biologische Wirkung entfalten zu können, muss DHEAS zu DHEA umgewandelt werden. Die dafür benötigten Sulfatasen werden in verschiedenen Zellen exprimiert, unter anderem in Monozyten und Makrophagen (Hennebold und Daynes 1994; Ruoff und Daniel 1991). In Hoden und Ovarien wird DHEA dann weiter zu Androgenen und Östrogen metabolisiert (Labrie et al. 2005). Doch nicht nur als Vorläufer der Sexualsteroide spielt DHEA eine grundlegende Rolle. DHEA moduliert die Endothelfunktion, reduziert Entzündungen, verbessert die Insulinsensitivität, den Blutfluss, die zelluläre Immunität, den Knochenstoffwechsel, die sexuelle Funktion, unterstützt die Neuroprotektion und verbessert auch die kognitive Funktion (Traish et al. 2011). Vor allem in der Immunregulation wird DHEA eine Bedeutung beigemessen, wobei die im Serum lösliche Form von DHEA, DHEAS, um einiges weniger wirkungsvoll bzw. funktionslos ist (Padgett und Loria 1998).
Dies unterstreichen Studien, in denen die Mortalität von Mäusen während viraler Infektionen durch die Behandlung mit DHEA um 50 bis 90% reduziert werden konnten (Loria 1992).
Gundlach et al. (2017) konnten im Rahmen einer Studie an der Tierärztlichen Hochschule Hannover bei gesunden Rindern eine im Blut zirkulierende DHEA-Konzentration von 2,5 µg/ml feststellen. Die Konzentration des Vorgängers DHEAS mit 28,8 µg/ml war demgegenüber höher. Bei Tieren, welche sich in einem entzündlichen Prozess befanden, konnte eine signifikante Erhöhung der DHEA-Konzentration festgestellt werden, während die Konzentration von DHEAS gleich blieb, beziehungsweise eher abnahm. Padgett und Loria (1998) wiesen DHEA einen entzündungshemmenden Effekt nach, der dadurch begründet ist, dass Makrophagen in der Sekretion proinflammatorischer Zytokine supprimiert werden. Die Studien von Iwasaki et al. (2004) liefern einige Hinweise darauf, dass dieser Effekt durch eine Hemmung der Transkriptionsfaktoren NF-κB und AP1 vermittelt wird. Dabei war der hemmende Effekt von DHEA auf die NF-κB-abhängige Transkription nach Stimulation mit TNF-α oder IL-1β signifikant stärker als die Hemmung der basalen NF-κB-abhängigen Transkription. Im Gegensatz dazu wird durch aktivierte Glukokortikoidrezeptoren sowohl
