Aufreinigung boviner primärer Hepatozyten

3 MATERIAL UND METHODEN

3.1.1 Aufreinigung boviner primärer Hepatozyten

Mittels einer anschließenden Dichtegradientenzentrifugation wurden vitale von toten Hepatozyten und anderen Zellen über ihre Dichte separiert (Abbildung 3). Hierfür wurde die Zellsuspension mithilfe der errechneten Zellzahl verdünnt, bis eine Zellzahl von 5-6 Millionen vitaler Zellen pro ml erreicht war. Eine 25%-ige Percoll-Lösung, die nach Berechnung mithilfe der Formel in Abbildung 2 eine Dichte von 1,036 g/ml aufwies, wurde in einem 50 ml Falcon vorgelegt und gut vermischt. Anschließend wurden 5 ml der Zellsuspension vorsichtig auf die Oberfläche aufgetragen. Hierbei sollten sich die Zellsuspension und die Percoll-PBS-Lösung nicht vermischen. Die Falconröhrchen wurden bei 4°C für 8 min mit 1 000 x g zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand mittels einer Pasteurpipette abgenommen und verworfen und das Zellpellet in WEM mit 10 % FBS aufgenommen. Es folgte ein weiterer Zentrifugationsschritt bei 60 x g für 3 min bei 4°C.

Der Überstand wurde erneut verworfen und das Zellpellet wieder in WEM aufgenommen.

Danach wurde erneut die Zellzahl und die Viabilität bestimmt.

Abbildung 2: Formel zur Einstellung der gewünschten Dichte für die Dichtegradientenzentrifugation (Biochrom GmbH, Berlin).

34 3.1.2 Gewinnung boviner Kupfferzellen

Die Kupfferzellen wurden aus derselben Leberzellisolation gewonnen wie die Hepatozyten.

Nach dem zweiten Zentrifugationsschritt wurde der Überstand, welcher größtenteils nicht-parenchymale Zellen enthält, in ein 50 ml Falcon überführt, welches daraufhin bei 300 x g für 5 min bei 4°C zentrifugiert wurde. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet in 10 ml William’s E Medium mit 10% FBS aufgenommen. Mittels einer Zwei-Dichtegradienten-Zentrifugation wurden Fibroblasten und Kupfferzellen von restlichen Hepatozyten und Zellfragmenten getrennt (Smedsrød et al. 1985). Hierfür wurde ein 50 ml Falcon vorbereitet, in dem 10 ml 25%iges Percoll über 10 ml 50%iges Percoll geschichtet wurden. Die Zellsuspension wurde vorsichtig aufgetragen und das Falcon 5 min bei 1350 x g und 4°C zentrifugiert. Zwischen den beiden Schichten befanden sich nach der Zentrifugation Kupfferzellen und Fibroblasten. Die weitere Auftrennung erfolgte über selektive Adhäsion der Kupfferzellen an unbehandeltes Plastik. Dafür wurde die Zellschicht zwischen den Dichtegradienten mit einer Pipette abgenommen, in Medium resuspendiert und nochmals 2 min bei 250 x g und 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde abermals vorsichtig mit der Pasteurpipette abgesaugt und das Sediment auf eine unbehandelte Plastikplatte gegeben. Als Kulturmedium diente WEM mit Zusatz von 10% FBS. Die Platte wurde dann zur Inkubation für 15 min in den Brutschrank bei 37 °C, 95 % Sauerstoff (O2) und 5 % Kohlenstoffdioxid (CO2) gestellt. Nach Ablauf dieser 20 min wurde das Medium zusammen mit nicht-adhärenten Zellen abgesaugt und die dem Plastik anhaftenden Kupfferzellen zweimal mit PBS gespült. Pro Well wurde 1 ml 1:10 Trypsin aufgetragen, welches 3 min bei 37°C inkubierte. Mittels WEM mit 10% FBS wurde die enzymatische Wirkung des Trypsins gestoppt. Die Zellen wurden nun durch Schwenken und zusätzlich mit einem Zellschaber gelöst und anschließend in einem 15 ml Falcon gepoolt. Die Zellen wurden 1 Minute bei 1300 x g zentrifugiert und anschließend der Überstand abgenommen. Das Pellet wurde in einem Volumen von 1 ml WEM aufgenommen und durch Vortexen bei 600 Umdrehungen/min resuspendiert. Es folgte eine Zählung und Beurteilung der Viabilität der Zellen mittels Trypanblau in einer Neubauerzählkammer, wie bereits oben beschrieben.

MATERIAL UND METHODEN

Abbildung 3: Zentrifugationsschritte nach Perfusion. Die durch die Perfusion gewonnene Zellsuspension (1), wird durch einen dreiminütigen Zentrifugationsschritt mit 60 x g in einen NPC-haltigen Überstand (2a) und ein Hepatozyten-haltiges Sediment (2b) unterteilt. Das NPC-Material wird durch eine 5-minütige Zentrifugation bei 300 g pelletiert (3). Dieses Pellet wird auf ein zwei-Dichte-Gradient-Kissen von 25% und 50% Percoll geladen (4). Nach einer fünfminütigen Zentrifugation bei 2300 x g sammeln sich Kupffer- und Endothelzellen zwischen den zwei Dichtegradienten (4a). Diese Schicht wird vorsichtig abgenommen und durch eine Zentrifugation bei 900 x g pelletiert (4b). Das Pellet wird auf unbehandelten Petriglasschalen ausplattiert (4c).

Währenddessen werden die Hepatozyten (2b) ausgezählt und ein 25% Dichtegradient mit 5 ml der mit Hepatozyten angereicherten Suspension (5000-6000 Zellen/ ml) beladen (5). Nach einem 8-minütigen Zentrifugationsschritt bei 1000 x g sammeln sich die aufgereinigten Hepatozyten als Pellet (6) und können daraufhin ausplattiert werden(7).

Kultivierung primärer boviner Hepatozyten

Spätestens einen Tag vor dem Versuch wurden 12-Well Platten mit 1 mg/ml Kollagen beschichtet. Dafür wurden 10 mg lyophilisiertes Kollagen mit 9 ml 0,2%-iger Essigsäure bedeckt und für etwa sechs Stunden zum Lösen bei 4°C in den Kühlschrank gestellt. Das gelöste Kollagen wurde daraufhin ausschließlich auf Eis weiterverarbeitet. Durch die Zugabe von 1 ml Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium mit Phenolrot konnte der pH-Wert der Kollagenlösung bestimmt werden. Mit 1 Molarer Natronlauge wurde dieser anschließend auf 7,4 eingestellt. Um die 12-Well Platten zu beschichten, wurden pro Well 165 µl Kollagen aufgetragen und durch vorsichtiges Schwenken möglichst gleichmäßig auf dem Wellboden verteilt. Die Kulturplatten wurden über Nacht bei 37°C in den Brutschrank gestellt, damit das Kollagen sich verfestigen konnte. Beschichtete, nicht verwendete Platten wurden in autoklavierten Plastiktüten eingeschweißt und konnten so bis zu 2 Wochen bei Raumtemperatur gelagert werden. Am Tag des Versuchs wurden die Platten nach der Leberperfusion während des ersten Zentrifugationsschrittes mit jeweils 1 ml/Well PBS gespült und daraufhin mit 1,5 ml/Well Adhäsionsmedium (Tabelle 5) befüllt. Bis zur Aussaat der Zellen nach der Aufreinigung mit Percoll wurden die Platten im Brutschrank aufbewahrt.

3.2.1 Ko-Kultivierung der Hepatozyten mit Kupfferzellen über 7 Tage in drei verschiedenen Kulturformen

Die Zellen für diesen Versuch stammten aus einem einzigen Tier, das in der Klinik für Rinder aufgrund einer Hüftluxation mit infauster Prognose euthanasiert wurde. Um den Einfluss von Kupfferzellen auf die Kultivierung von Hepatozyten zu beurteilen, wurden drei verschiedene Kultivierungsmodelle gewählt. Das erste Modell beinhaltete eine Ko-Kultur von Hepatozyten, die in direktem Kontakt mit den Kupfferzellen standen (HKCd). Dafür wurden die Kupfferzellen zeitgleich mit den Hepatozyten in einem Verhältnis von 1:6 (0,15Mio. KC:

0,5Mio. H pro Well) in die mit Adäsionsmedium befüllten Wells gebracht und durch Schwenken gleichmäßig verteilt. Nach drei Stunden Adhäsion im Brutschrank bei 37 °C, 95

% Sauerstoff (O2) und 5 % Kohlenstoffdioxid (CO2) wurde das Adhäsionsmedium mit einer Pasteuerpipette abgenommen und die Zellen zweimal mit einfachen PBS (37°C) gespült, um

MATERIAL UND METHODEN

tote Zellen zu entfernen. Daraufhin wurde die Adhäsion der Zellen an das Kollagen unter dem Mikroskop beurteilt. Dabei wurde durch Schätzung eine Adhäsionsanzahl, also die prozentuale Anzahl der Zellen, die nach dem Waschen nicht abgespült werden konnten, bestimmt. Nach der zweiten Spülung wurden 165 µl Kollagen für die zweite Kollagenschicht tropfenweise auf die Zellen gegeben. Daraufhin wurden die Platten wieder für 30 min in den Brutschrank gestellt, bis das Kollagen getrocknet war. Erst dann wurde je 1 ml/Well Erhaltungsmedium (Tabelle 5) hinzugefügt. Im Gegensatz zu dem ersten Modell wurde im zweiten Modell die gleiche Anzahl von Kupfferzellen erst nach dem Auftragen der zweiten Kollagenschicht in das Erhaltungsmedium gegeben. Dieses Modell ermöglichte daher lediglich einen indirekten Kontakt der Makrophagen mit den Hepatozyten über lösliche Mediatoren durch die Kollagenschicht hindurch (HKCid). Als Kontrolle diente ein drittes Modell, bestehend aus einer Hepatozytenmonokultur (HMC), ebenfalls in der Sandwichkonfiguration (Abbildung 4). Die verschiedenen Kultivierungsmodelle wurden mit je n = 12 auf insgesamt fünfzehn 12-Well Platten verteilt, um einem möglichen Platteneffekt vorzubeugen (Abbildung 5). Das Erhaltungsmedium wurde alle 24 Stunden abgesaugt und erneuert.

Abbildung 4: Schematische Darstellung der Kulturmodelle; HKCd: Ko-Kultur von Hepatozyten mit Kupfferzellen in direktem Kontakt zueinander; HKCid: Ko-Kultur von Hepatozyten mit Kupfferzellen in indirektem Kontakt (Trennung durch eine zweite Kollagenschicht); HMC: Mono-Kultur von Hepatozyten.

:Kupfferzellen :Hepatozyten

Tabelle 5: Zusammensetzung der verwendeten Kulturmedien

Reagenzien Hersteller Adhäsionsmedium Erhaltungsmedium

Williams’E Medium PAN-Biotech 500 ml 500 ml

FBS PAN-Biotech 55 ml -

Penicillin/Streptomycin

(10 000 U/ml /10 mg/ml)

PAN-Biotech 5 ml 5 ml

Gentamycin (50 mg/ml) PAN-Biotech 500 µl 500 µl

ITS (1 mg/ml) Sigma- Aldrich 5 µl 5 µl

Dexamethason (2 mg/ ml) Sigma- Aldrich 10 µl 10 µl

Aminosäuren Merck 5 ml 5 ml

L-Glutamin (200 mM) PAN-Biotech 10 ml 10 ml

Amphotericin B PAN-Biotech 5 ml 5 ml

FBS = fetales bovines Serum, ITS = Insulin-Transferrin-Selen

Abbildung 5: Schematische Darstellung der Plattenbelegung; HKCd: Ko-Kultur von Hepatozyten mit Kupfferzellen in direktem Kontakt zueinander; HKCid: Ko-Kultur von Hepatozyten mit Kupfferzellen in indirektem Kontakt (Trennung durch 2. Kollagenschicht); HMC: Mono-Kultur von Hepatozyten.

MATERIAL UND METHODEN

3.2.2 Inkubationsversuch mit verschiedenen Entzündungshemmern

Aus methodischen Gründen wurde dieser Versuch aufgeteilt. Daher stammen die für den Versuch verwendeten Zellen aus den Lebern drei verschiedener Kühe. Die Tiere wurden aufgrund unterschiedlicher Krankheitsvorgeschichten mit infauster Prognose (perforierender Klauendefekt, Hüftluxation, Polyarthritis) in der Klinik für Rinder in Hannover euthanasiert.

3.2.2.1 Zusammensetzung der verwendeten Medien

Sowohl im Adhäsionsmedium als auch im Erhaltungsmedium wurde Dexamethason durch je einen anderen Entzündungshemmer ersetzt. Vergleichend wurden DHEA in einer physiologischen Konzentration, DHEA in einer pharmakologischen Konzentration, Aspirin, DHEA in einer pharmakologischen Konzentration zusammen mit Aspirin, Hydrocortison und Dexamethason an Hepatozytenmonokulturen und Hepatozyten-Kupfferzell-Ko-Kulturen in direktem Kontakt (HKC) angewendet. Die verwendeten Konzentrationen sind Tabelle 6 zu entnehmen. Als Kontrolle diente Medium ohne den Zusatz von Entzündungshemmern. Um einem möglichen Platteneffekt vorzubeugen, wurden die verschiedenen Entzündungshemmer möglichst gleichmäßig auf insgesamt vierzehn 12-Well Platten verteilt (Abbildung 5). Das Erhaltungsmedium wurde alle 24 Stunden abgesaugt und erneuert. Nach vier Tagen in Kultur wurde das Medium entnommen und die Zellen gewonnen. Beides wurde bis zur weiteren Untersuchung bei -80°C eingefroren.

Tabelle 6: Konzentrationen der Entzündungshemmer im Medium

Probe Entzündungshemmer Konzentration in Medium

1 ohne -

2 DHEA physiologisch 8 ng/ml

3 DHEA pharmakologisch 8 µg/ml

4 DHEA pharmakologisch + Aspirin 8 µg/ml + 2µg/ml (≈ 10µM)

5 Aspirin 2µg/ml (≈ 10µM)

6 Hydrocortison 4µg/ml (≈ 10µM)

7 Dexamethason 0,04µg/ml ( ≈ 100 nM)

Abbildung 6: Schematische Darstellung der Plattenbelegung; HKC:

Ko-Kultur von Hepatozyten mit Kupfferzellen in indirektem Kontakt (Trennung durch 2. Kollagenschicht); HMC: Mono-Kultur von Hepatozyten

3.2.3 Konservierung der Zell- und Mediumproben

Die folgend beschriebenen Schritte wurden auf Eis durchgeführt. Der Mediumüberstand von je zwei Wells wurde abpipettiert und in 1,5 ml Eppendorfgefäßen gepoolt. Durch einen Waschschritt mit kaltem, einfachem PBS wurde das restliche Medium weitestgehend entfernt.

Bei den Ko-Kulturen von Hepatozyten und Kupfferzellen in indirektem Kontakt zueinander wurde die obere Kollagenschicht – und damit auch die Kupfferzellen – vorsichtig mit einer feinen Pinzette entfernt. Die Hepatozyten wurden mit einem Zellschaber abgelöst und mit einer Pipette aufgenommen. Um in der anschließenden PCR-Analyse ausreichend mRNA zur Verfügung zu haben, wurden die Zellen aus je zwei Wells in RNAse-freien 1,5 ml Eppendorfgefäßen gepoolt, sodass der Probenumfang pro zu testendem Entzündungshemmer n = 6 betrug. Die Proben wurden bei 4 °C für eine Minute mit 8 000 x g zentrifugiert und der Überstand mit überschüssigem Medium verworfen. Bis zu weiteren Analysen wurden die Proben bei - 80 °C gelagert.

MATERIAL UND METHODEN

Morphologische Beurteilung der Hepatozyten

3.3.1 Live/Dead-Färbung

Mit dem LIVE/DEAD Viability and Cytotoxicity Kit wurde an Tag 4 die Zellviablität in HMC, HKCd und HKCid dargestellt. Diese auf der Markierung mit Fluoreszenzfarbstoffen basierende Methode ermöglicht es, sowohl lebende als auch tote Zellen sichtbar zu machen.

Lebende Zellen können aufgrund ubiquitärer intrazellulärer Esterase-Aktivität des ersten Reagenzes, dem nicht-fluoreszierenden zellpermeablen Calcein AM (Komponente A), zu intensiv fluoreszierendem Calcein umbauen. Durch die in lebenden Zellen vorhandene Plasmaintegrität wird der Farbstoff in den Zellen erhalten und erzeugt eine intensive, gleichmäßig grüne Fluoreszenz. Im Gegensatz dazu tritt das zweite Reagenz, EthD-1 (Komponente B), in Zellen mit beschädigten Membranen ein und bindet dort an Nukleinsäuren, wodurch eine leuchtend rote Fluoreszenz erzeugt wird.

Um diese Färbung durchzuführen, wurden zuerst die bei -20°C gelagerten Reagenzien auf Raumtemperatur aufgewärmt und gevortext. In ein 1,5 ml Eppendorfgefäß wurde 1 ml serumfreies William’s E Medium (37 °C) vorgelegt und daraufhin 2 µl der Komponente B und 0,5 µl der Komponente A hinzugefügt. Nach der Hinzugabe jeder Komponente wurde die Lösung jeweils gemischt. Um unspezifischen Hintergrundsignalen durch ubiquitäre Esterasen im Medium vorzubeugen, wurde das Kulturmedium abgenommen und die Zellen zwei Mal mit 500 µl 1x PBS (37°C) gewaschen, bevor der eigentliche Färbevorgang stattfand.

Nachdem das PBS wieder abgenommen war, wurden pro Well 150 µl der Färbelösung pipettiert und durch vorsichtiges Schwenken gut verteilt. Die Zellen wurden nun für eine 20 min bei RT im Dunkeln inkubiert. Letztendlich konnten mithilfe des inversen Phasenkontrastmikroskops Axiovert 200M und der Software AxioVision im Anatomischen Institut der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover die Ergebnisse der LIVE/DEAD-Färbung ausgewertet und Bilder aufgenommen werden. Zur Kontrolle wurden die Zellen eines Wells durch eine zehnminütige Inkubation mit Ethanol abgetötet und mitgefärbt. Unter dem Phasenkontrastmikroskop Zeiss Axiovert 200M sollten in diesem Well nur rot gefärbte Zellen zu sehen sein.

3.3.2 Immunhistologische Darstellung der Hepatozyten in Kultur

3.3.2.1 Positivkontrolle an Gefrierschnitten

Um geeignete Antikörper für die immunhistologische Darstellung der Hepatozyten in Kultur zu finden und gleichzeitig eine Positivkontrolle zur Verfügung zu haben, wurden Färbeprotokolle an Gefrierschnitten boviner Lebern getestet. Die Gefrierschnitte wurden aus Leberbioptaten, die aus einem vorangegangenen Projekt (Tierversuchnummer: ZG 68/15) stammten, hergestellt. Dabei wurden folgende Antikörper getestet, um die Zytoskelettstrukturen der Hepatozyten anzufärben: Cytokeratin (CK)-18 (Monoclonal CK18 antibody produced in mouse) und panCytokeratin (panCK, Monoclonal Anti-panCytokeratin antibody produced in rabbit). Zudem wurden Fixiermethoden ausprobiert, bei denen mit den verwendeten Antikörpern möglichst gute Resultate erzielt werden konnten.

Neben einer Fixierung mit 100% Methanol (-20°C) und darauffolgender Behandlung der Zellen mit 4% Paraformaldehyd-(PFA)Lösung wurde eine Fixierung mit Aceton und eine weitere Fixierung mit nur Methanol ausprobiert. Da die Methanol-/PFA-Fixierung die besten Resultate lieferte, wurde diese für das weitere Vorgehen verwendet.

3.3.2.2 Färbung der Hepatozyten in Kultur

Die für die Färbung vorgesehenen Hepatozyten wurden auf mit Kollagen bedeckten Deckplättchen kultiviert. Jeweils an Tag 1 und Tag 5 wurden die Zellen gefärbt. Dafür wurde das Kulturmedium abgenommen und die Zellen mit 1ml Tris-buffered saline (TBS) pro Well gewaschen. Für die Fixierung wurden die Zellen pro Well etwa 500 µl -20°C kalten 100

%igen Methanol ausgesetzt. Nach 10 min Einwirkzeit wurde das Methanol abgenommen und die Zellen etwa 10 min unter dem Abzug getrocknet. Nachdem das Methanol nahezu vollständig verdampft war, wurden die Zellen für 5 min in TBS rehydriert. Zusätzlich wurden die Zellen mit einer 4% PFA-Lösung fixiert. Diese wurde zuvor aus 10 ml 10% PFA, 2,5 ml zehnfach TBS und 12,5 ml H2O angesetzt. Nach einer Einwirkzeit von 20 min wurden die Zellen dreimal 5 min mit TBS gewaschen. Daraufhin folgte die Blockierung mit einer 5 % Magermilchblockierlösung, die zuvor aus 2,5 mg Magermilchpulver auf 50 ml TBS und 0,625 µl 20%-Tween (TBS-T) angesetzt wurde. Nach etwa 45 min auf einem Schüttler wurde

MATERIAL UND METHODEN auf die Zellen pipettiert und im Dunkeln auf dem Schüttler inkubiert. Nach 45 min wurde die Färbelösung abgesaugt und zweimal 5 min mit TBS-T gespült, um Farbstoffreste zu entfernen. Daraufhin wurden die Zellen 4 min mit Hoechst DYE Kernfärbung in einer Konzentration 1:1000 in TBS gefärbt. Der Farbstoff wurde daraufhin wieder durch eine zweimalige Spülung mit TBS-T (5 min) entfernt. Ein weiterer Waschschritt mit TBS entfernte das Tween. Letztendlich wurden die Deckplättchen vorsichtig mit einer feinen Pinzette aus den Wells genommen und in destilliertes Wasser gedippt und nachdem sie getrocknet waren mit einem Tropfen anti-fade auf Objektträgern fixiert. Bei Raumtemperatur trockneten die Objektträger im Dunkeln und konnten am darauffolgenden Tag durch Fluoreszenzmikroskopie im Institut für Anatomie unter dem Phasenkontrastmikroskop Zeiss Axiovert 25 beurteilt werden.

3.3.3 Nachweis von Kupfferzellen mit Latex beads

Um die sessilen Makrophagen unter dem Mikroskop identifizieren zu können und zudem nachzuweisen, dass diese vital sind, wurden spezifische Latex beads verwendet. Diese Latex beads sind fluoreszierende Mikrosphären aus Carboxylat-modifiziertem Polystryol. Da sie von vitalen Makrophagen phagozytiert werden, dienen sie als Marker vitaler Kupfferzellen.

Es wurden rot fluoreszierende Latex beads aus Carboxylat-modifiziertem Polystryol mit einer durchschnittlichen Partikelgröße von 2.0 μm verwendet. Latex beads binden unspezifisch an jedes hydrophobe Molekül, einschließlich an Proteine, Nukleinsäuren und Biomoleküle. Um unspezifische Bindungen, wie zum Beispiel an das als Kulturboden verwendete Kollagen, zu vermeiden, wurden die Latex beads vor der Verwendung zur Opsonierung 1h mit FBS behandelt. Dafür wurden sie mit in PBS in einem Verhältnis von 1:1 verdünnten FBS auf eine

Dichte von 500 000 Beads/µl verdünnt und eine Stunde bei 37°C inkubiert. Nach der dreistündigen Adhäsionszeit der Hepatozyten wurden die opsonierten fluoreszenz-markierten Latex-Beads in das Kulturmedium gegeben. Vom Hersteller wird ein Verhältnis von Kupfferzellen zu Latex beads von 1:40 empfohlen. Da unbekannt war ob, oder wie viele Kupfferzellen in der Hepatozytenkultur enthalten waren, wurde von einem hypothetischen Wert von maximal 0,25 x 10^6 Kupfferzellen/Well ausgegangen. Als Positivkontrolle und zur Bestimmung der Phagozytoseaktivität wurden Latex beads nach der Aussaat der Kupfferzellen bei einer Dichte von etwa 1x 10^6 Kupfferzellen/Well in einem Verhältnis von 1:40 in das Kulturmedium von Kupfferzell- Mono-Kulturen gegeben. Nach 24 Stunden Inkubation wurden die bis dahin nicht phagozytierten Latex beads durch eine zweimalige Waschung mit PBS entfernt. Das Vorhandensein von Kupfferzellen in der Hepatozytenkultur und deren Phagozytoseaktivität wurde im Anschluss mittels Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Dafür wurden in jeweils 4 Gesichtsfeldern der Hepatozytenkultur fluoreszenz-markierte Zellen im Verhältnis zu den Hepatozyten ausgezählt. Um die Phagozytoseaktivität der Kupfferzellen zu bestimmen, wurden in der Kupfferzell-Mono-Kultur ebenfalls jeweils 4 Gesichtsfeldern nicht markierte und markierte Zellen ausgezählt. Mit Hilfe eines Zeiss Axiovert 25 Phasenkontrastmikroskopes im Institut für Anatomie wurden entsprechende Bilder aufgenommen.

MATERIAL UND METHODEN

45 Laboranalysen

3.4.1 Proinflammatorische Zytokine

Um das Ausmaß der entzündlichen Reaktion der Kupfferzellen in der Ko-Kultur zu untersuchen, wurde die Ausschüttung von spezifischen pro-inflammatorischen Zytokinen (TNF-α, IL-6) in das Kulturmedium untersucht.

3.4.1.1 IL-6

Zur Bestimmung der IL-6 Konzentration im Zellkulturüberstand der verschiedenen Kulturformen wurde das Bovine IL-6 ELISA Reagent Kit von ThermoFisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) verwendet. Zuerst wurden die für das Kit verwendeten Reagenzien, wie in Tabelle 7 dargestellt, vorbereitet. Dann wurden die 96-Well Platten zunächst mit je 100µl Deck-Antikörper 1: 100 in Carbonat-Bicarbonat-Puffer beschichtet. Die Deck-Antikörper-Lösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert und wurde am nächsten Morgen wieder abgenommen. Stattdessen wurden 300 μl des Stopp-Puffers in jedes Well pipettiert. Nach einer Stunde Inkubation bei Raumtemperatur wurde der Stopp-Puffer wieder abgesaugt.

Zunächst wurde aus der IL-6 Standardlösung (10.000 pg / ml) eine Verdünnungsreihe mit 2500, 1250, 625, 313, 156, 78 und 39 pg / ml zur Erstellung einer Standardkurve angelegt.

Anschließend wurde pro Well 100 μl des Standards bzw. der Probe pipettiert. Nach 1 h Inkubation bei Raumtemperatur wurde der Standard bzw. die Probe abgesaugt und die Platte dreimal mit dem Waschpuffer gewaschen. Der im Kit enthaltene Nachweisantikörper musste 1: 100 in Reagenzverdünnungsmittel verdünnt werden bevor 100 μl der Lösung in jedes Well pipettiert wurden. Nach 1 Stunde Inkubation bei Raumtemperatur wurde der Nachweisantikörper wieder abgesaugt und die Platte dreimal mit dem Waschpuffer gewaschen.

Pro Well wurden 100 μl Streptavidin-HRP - 1: 400 in Reagenzverdünnungsmittel verdünnt- pipettiert. Nach 30 min Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Lösung wieder abgesaugt und dreimal gewaschen. Zuletzt wurden pro Well 100 μl Substratlösung pipettiert, die 20 min im Dunkeln und bei Raumtemperatur inkubierten. Die Zugabe von 100 μl Stopp-Puffer

stoppte die Reaktion. Die Messung der optischen Dichte erfolgte mithilfe des Plattenphotometer TECAN GENios Pro bei 450 nm und 550 nm. Unter der Verwendung des Programms Magellan wurde anhand der erstellten Standardkurve mittels der im Programm hinterlegten „Punkt zu Punkt“-Funktion die Konzentration an bovinen IL-6 bestimmt.

Tabelle 7: Zusammensetzung der Puffer, die für die Durchführung des Bovinen IL-6 ELISA (ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA) benötigt wurden.

Komponente Volumen

Für die Bestimmung der TNF-α Sekretion in das Zellkulturmedium wurde das TNF-α Bovine ELISA Kit von von ThermoFisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) verwendet. Die verwendeten Reagenzien sind in Tabelle 8 aufgeführt.

Als erstes wurde eine TNF-α Standardkurve hergestellt. Dafür wurde der lyophilisierte Standard in 400 μL Testverdünnungsmittel B aufgelöst, wodurch der Standard eine Konzentration von 200 ng/ml TNF-α hatte. 90μL des TNF-α-Standard wurden in ein

MATERIAL UND METHODEN

Röhrchen mit 510 μl Assay Diluent (A oder B) pipettiert, um eine 30 ng/ml Standardlösung herzustellen. Die 30 ng/ml Standardlösung wurde verwendet, um in Folge eine Verdünnungsreihe herzustellen. Als Nullstandard (0 ng/ml) diente das Testverdünnungsmittel B. Je 100 μl der Standards bzw. der Proben wurden in die Wlls der 96-Well ELISA Platte pipettiert. Nach 2,5 Stunden Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Lösung verworfen und 4-mal mit dem Waschpuffer gewaschen. Anschließend wurde in jedes Well 100 μl des Antikörpers pipettiert. Nach 1 Stunde Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Lösung abermals verworfen und 4-mal mit dem Waschpuffer gewaschen. Daraufhin wurde in jedes Well 100 μl der Streptavidin-HRP-Lösung gegeben. Diese wurde nach 45 min Inkubation bei Raumtemperatur verworfen und die Wells 4-mal mit Waschpuffer gewaschen. Zuletzt wurden 100 μl TMB-Substrat in jedes Well pipettiert. Dieses inkubierte für 30 min bei

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