Proinflammatorische Zytokine

Um das Ausmaß der entzündlichen Reaktion der Kupfferzellen in der Ko-Kultur zu untersuchen, wurde die Ausschüttung von spezifischen pro-inflammatorischen Zytokinen (TNF-α, IL-6) in das Kulturmedium untersucht.

3.4.1.1 IL-6

Zur Bestimmung der IL-6 Konzentration im Zellkulturüberstand der verschiedenen Kulturformen wurde das Bovine IL-6 ELISA Reagent Kit von ThermoFisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) verwendet. Zuerst wurden die für das Kit verwendeten Reagenzien, wie in Tabelle 7 dargestellt, vorbereitet. Dann wurden die 96-Well Platten zunächst mit je 100µl Deck-Antikörper 1: 100 in Carbonat-Bicarbonat-Puffer beschichtet. Die Deck-Antikörper-Lösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert und wurde am nächsten Morgen wieder abgenommen. Stattdessen wurden 300 μl des Stopp-Puffers in jedes Well pipettiert. Nach einer Stunde Inkubation bei Raumtemperatur wurde der Stopp-Puffer wieder abgesaugt.

Zunächst wurde aus der IL-6 Standardlösung (10.000 pg / ml) eine Verdünnungsreihe mit 2500, 1250, 625, 313, 156, 78 und 39 pg / ml zur Erstellung einer Standardkurve angelegt.

Anschließend wurde pro Well 100 μl des Standards bzw. der Probe pipettiert. Nach 1 h Inkubation bei Raumtemperatur wurde der Standard bzw. die Probe abgesaugt und die Platte dreimal mit dem Waschpuffer gewaschen. Der im Kit enthaltene Nachweisantikörper musste 1: 100 in Reagenzverdünnungsmittel verdünnt werden bevor 100 μl der Lösung in jedes Well pipettiert wurden. Nach 1 Stunde Inkubation bei Raumtemperatur wurde der Nachweisantikörper wieder abgesaugt und die Platte dreimal mit dem Waschpuffer gewaschen.

Pro Well wurden 100 μl Streptavidin-HRP - 1: 400 in Reagenzverdünnungsmittel verdünnt- pipettiert. Nach 30 min Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Lösung wieder abgesaugt und dreimal gewaschen. Zuletzt wurden pro Well 100 μl Substratlösung pipettiert, die 20 min im Dunkeln und bei Raumtemperatur inkubierten. Die Zugabe von 100 μl Stopp-Puffer

46

stoppte die Reaktion. Die Messung der optischen Dichte erfolgte mithilfe des Plattenphotometer TECAN GENios Pro bei 450 nm und 550 nm. Unter der Verwendung des Programms Magellan wurde anhand der erstellten Standardkurve mittels der im Programm hinterlegten „Punkt zu Punkt“-Funktion die Konzentration an bovinen IL-6 bestimmt.

Tabelle 7: Zusammensetzung der Puffer, die für die Durchführung des Bovinen IL-6 ELISA (ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA) benötigt wurden.

Komponente Volumen

Für die Bestimmung der TNF-α Sekretion in das Zellkulturmedium wurde das TNF-α Bovine ELISA Kit von von ThermoFisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) verwendet. Die verwendeten Reagenzien sind in Tabelle 8 aufgeführt.

Als erstes wurde eine TNF-α Standardkurve hergestellt. Dafür wurde der lyophilisierte Standard in 400 μL Testverdünnungsmittel B aufgelöst, wodurch der Standard eine Konzentration von 200 ng/ml TNF-α hatte. 90μL des TNF-α-Standard wurden in ein

MATERIAL UND METHODEN

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Röhrchen mit 510 μl Assay Diluent (A oder B) pipettiert, um eine 30 ng/ml Standardlösung herzustellen. Die 30 ng/ml Standardlösung wurde verwendet, um in Folge eine Verdünnungsreihe herzustellen. Als Nullstandard (0 ng/ml) diente das Testverdünnungsmittel B. Je 100 μl der Standards bzw. der Proben wurden in die Wlls der 96-Well ELISA Platte pipettiert. Nach 2,5 Stunden Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Lösung verworfen und 4-mal mit dem Waschpuffer gewaschen. Anschließend wurde in jedes Well 100 μl des Antikörpers pipettiert. Nach 1 Stunde Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Lösung abermals verworfen und 4-mal mit dem Waschpuffer gewaschen. Daraufhin wurde in jedes Well 100 μl der Streptavidin-HRP-Lösung gegeben. Diese wurde nach 45 min Inkubation bei Raumtemperatur verworfen und die Wells 4-mal mit Waschpuffer gewaschen. Zuletzt wurden 100 μl TMB-Substrat in jedes Well pipettiert. Dieses inkubierte für 30 min bei Raumtemperatur im Dunkeln. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Extinktion mit dem Plattenphotometer TECAN GENios Pro bei 450 nm und 550 nm gemessen. Auch hier wurde unter der Verwendung des Programms Magellan anhand der erstellten Standardkurve mittels der „vier Parameter Marquardt“-Funktion die Konzentration von bovinen TNF-α in den einzelnen Proben berechnet.

Tabelle 8: Verdünnung der Reagenzien, die für die Durchführung des Bovinen TNF-α ELISA (ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA) benötigt wurden.

Reagenz Verdünnung

Testverdünnungsmittel B

Reagenz B 1:5 in destilliertem Wasser

Waschpuffer

Waschpufferkonzentrats 1:20 in destilliertem Wasser Antikörper

biotinylierter Antikörper

Testverdünnungsmittel B 100 µl

Assay Diluent B

Streptavidin-HRP-Reagenz 1:600 in Testverdünnungsmittel B

48 3.4.2 Harnstoff

Zur Bestimmung der Harnstoffkonzentration im Zellkulturüberstand wurde das kommerziell erhältliche Urea Assay Kit (Abcam, Cambridge, UK) verwendet.

Dafür wurde zunächst aus 5 μL der 100mM Harnstoff-Standardlösung und 995 μL destillierten Wasser ein 0.5mM Standard hergestellt. Aus diesem wurde durch die Verdünnung mit dem Assay Buffer eine Verdünnungsreihe mit 0, 1, 2, 3, 4 und 5 nM zur Erstellung einer Standardkurve angelegt. Die Zellkulturüberstands-Proben wurden ebenfalls jeweils 1:20 mit dem Assay Buffer verdünnt. Pro Well einer 96-Well Platte wurden jeweils 50µl der jeweiligen Verdünnungsstufe bzw. der Probe pipettiert. Anschließend wurde den Wells der Standardkurve bzw. der Proben 50 µl eines Reaktionsmix (Tabelle 9) hinzugefügt.

Zur Kontrolle auf unspezifische Bindung in den Reaktionsansätzen wurde in ein Well der 50 µl des Hintergrundreaktionsmixes (Tabelle 9) pipettiert. Daraufhin wurde ohne eine Inkubationszeit eine Messung der optischen Dichte bei 570 nm mit dem Plattenphotometer TECAN GENios Pro durchgeführt. Dies diente der Bestimmung der unspezifischen Bindung in den Reaktionsansätzen. Nach einer darauffolgenden einstündigen Inkubation der 96-Well Platte bei 37°C unter Lichtabschluss folgte eine weitere Messung der optischen Dichte bei 570 nm. Mithilfe der Magellan Software wurden die erhaltenen Daten mithilfe der „Punkt-zu-Punkt“-Funktion analysiert. Dabei wurde die gemessene optische Dichte der zweiten Messung von der optischen Dichte der ersten Messung abgezogen, um die korrigierte optische Dichte zu erhalten. Mithilfe von Microsoft Excel wurde anhand der Standardkurve die Konzentration des in der Probe enthaltenen Harnstoffs unter der Berücksichtigung der Verdünnung bestimmt.

MATERIAL UND METHODEN

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Tabelle 9: Reaktionsmixe zur Bestimmung der Harnstoffkonzentration gemäß dem Urea Assay Kit.

Komponente Reaktionsmix [µl] Hintergrundreaktionsmix [µl]

Urea Assay Buffer 42 44

OxiRed Probe 2 2

Enzyme Mix 2 2

Developer 2 2

Converter Enzyme 2 0

Pro Reaktion wurden 50µl des Reaktionsmixes angesetzt, der Hintergrundreaktionsmix wurde nur für eine Reaktion angesetzt.

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Bestimmung der Genexpression in Hepatozyten

3.5.1 RNA-Extraktion

Die auf Eis aufgetauten Hepatozyten-Proben wurden mit 500µl TRIzol^TM Reagenz, einer einphasigen Lösung aus Phenol und Guanidinisothiocyanat, bedeckt. Das Pellet aus Zellen und Kollagen wurde mittels eines Homogenisators homogenisiert. Durch das TRIzol^TM -Reagenz werden die Zellen aufgebrochen und die Zellbestandteile während der Homogenisierung aufgelöst, während die Integrität der RNA beibehalten wird. Auf die Trizol-Zell-Dispersion wurden 200 µl Chloroform pipettiert. Nach 15 Sekunden Vortexen folgte eine zwei- bis drei-minütige Inkubation. Anschließend wurden die Proben für 15 min bei 12 000 x g und 4 °C zentrifugiert, wodurch sich eine wässrige Phase und eine organische Phase bildet. In der unteren roten Phase sammelten sich Phenol, Chloroform und Proteine, während die obere wässrige Phase RNA enthielt. Getrennt wurden diese beiden Phasen durch die Interphase, in der sich DNA sammelt. Die obere Phase wurde abgenommen, ohne die anderen Phasen zu zerstören, und in ein neues RNA-freies 1,5 ml Eppendorfgefäß überführt.

Um die RNA auszufällen, wurde diese obere Phase mit 500 µl Isopropanol gemischt und gevortext und im Anschluss 10 min bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend 10 min bei 12 000 x g bei 4 °C zentrifugiert, woraufhin der Überstand abgenommen wurde. Nach einer Zugabe von 1 ml 80 % unvergälltem Ethanol, wurde die Probe gevortext, um das RNA-Pellet zu spülen und daraufhin 5 min bei 7 500 x g bei 4 °C zentrifugiert. Nach Abnahme des Überstands erfolgte ein weiterer Waschschritt mit 1 ml 80 % unvergälltem Ethanol. Das Präzipitat wurde bei geöffnetem Eppendorfgefäß bei Raumtemperatur 30 min getrocknet.

Nachdem der Alkohol vollständig verdampft war, wurde das RNA-Präzipitat in 30 µl RNase-freien Wasser (Ampuwa®) resuspendiert. Bis zu der Bestimmung der RNA- Konzentration wurde die RNA bei - 80°C eingefroren.

3.5.2 Bestimmung der RNA-Konzentration

Die Konzentration der extrahierten RNA von Hepatozyten und Kupfferzellen wurde mittels des 2100 Bioanalyzer Systems mit dem Agilent 6000 Nano Kit bestimmt. Die benötigten Reagenzien wurden nach Anleitung des Agilent RNA 6000 Nano Kit Quick Start Guides

MATERIAL UND METHODEN

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hergestellt. Vor Beginn wurden die Reagenzien 30 min auf Raumtemperatur aufgewärmt und die in der -80°C Kühltruhe aufbewahrten RNA-Proben auf Eis aufgetaut. 550 μl der RNA Gelmatrix (im Kit enthalten) wurde in ein spezielles Filtergefäß, den sogenannten „Spin Filter“, pipettiert und bei 1500 g für 10 min bei Raumtemperatur zentrifugiert.

Währenddessen wurde jeweils 1,5 μl RNA in 1,5 ml Eppendorfgefäße überführt und für eine Minute bei 70 °C erwärmt, um die RNA zu denaturieren. Daraufhin wurden die Proben auf Eis aufbewahrt. Mithilfe einer Priming-Station wurde der Chip mit der Gelmatrix befüllt, indem in die dafür vorgesehenen mit „G“ markierten Wells jeweils 9 µl Gel-Dye-Mix pipettiert wurde, welches mit dem Spritzenstempel verteilt wurde. Nachdem man in alle 12 Wells und zusätzlich in das Leiter-Well je 5 μl eines RNA-Markers vorgelegt hatte, konnte je 1 μl RNA in die 12 Wells des Chips gegeben werden. Letztendlich wurde noch 1 μl der Größenleiter in das hierfür vorgesehen Well pipettiert, der Chip eine Minute gevortext und in dem 2100 Bioanalyzer System gemessen.

3.5.3 cDNA-Synthese mit DNase Verdau

Mithilfe von Reverser Transkriptase lässt sich cDNA aus der extrahierten RNA synthetisieren, welche im Anschluss als Ausgangsmaterial in der PCR verwendet werden kann. Um Kontaminationen mit Fremd-DNA auszuschließen, wurde der cDNA-Synthese eine DNase Verdau vorangesetzt. Sämtliche Schritte wurden auf Eis ausgeführt. Um für die cDNA-Synthese 100 ng RNA zur Verfügung zu haben, wurden für den DNAse Verdau je 122 ng RNA eingesetzt und das Volumen anschließend mit RNase freiem Wasser auf 8 µl aufgefüllt. Nach der Zugabe von je 1 µl Puffer und 1 µl DNase I des DNase Kits, inkubierte die RNA 15 min bei Raumtemperatur. Die Enzymwirkung wurde daraufhin mit je 1 µl Stopp-Lösung und 10 min Inkubation bei 70 °C unterbrochen. Bevor die RNA für die cDNA-Synthese eingesetzt werden konnte, wurden die Proben auf Eis abgekühlt. Da die Menge an RNA schon bei dem DNase Verdau auf ein Endvolumen justiert wurde (Tabelle 10), konnten bei der cDNA-Synthese eine definierte Menge an RNA und Wasser verwendet werden. Die Zusammensetzung des eingesetzten Mastermixes ist in Tabelle 11 dargestellt. Mittels einer Negativ-Kontrolle (NRT) pro zu untersuchender Probe wurden die Proben nochmals auf das Vorliegen von DNA-Kontaminationen überprüft. Diesen Proben wurden kein RNase-Inhibitor

52

und keine MuLV-Reverse-Transkriptase zugefügt. Um auch die verwendeten Reagenzien auf RNA- sowie DNA-Kontaminationen zu überprüfen, wurden zwei weitere Negativ-Kontrollen (K1, K2) verwendet, bei denen dem Mastermix für die Positiv- und Negativ-kontrolle RNAse freies Wasser anstelle der RNA-Probe hinzugefügt wurde. Das Programm des Cyclers wurde auf 10 min bei 25 °C, 60 min bei 42 °C und 5 min bei 99 °C mit anschließender Abkühlung auf 4 °C eingestellt. Nach dem Ablauf des Programms wurden die Proben eins zu eins mit RNase freiem Wasser verdünnt und bis zu der Durchführung der Real-Time PCR bei -20 °C gelagert.

Tabelle 10: Reagenzien des für die cDNA-Synthese verwendeten Mastermixes Reagenzien Endkonzentration Mastermix

Probe [µl]

Mastermix NRT [µl]

MgCl2 (50 mM) 5 mM 2 2

PCR Buffer (10x) 1x 2 2

dNTPs (10 mM) 1 mM 2 2

Random Hexamers (50 µM) 2,5 µM 1 1

RNase Inhibitor (20 U/µl) 1 U/µl 1 ---

MuLV-Reverse Transcriptase (50 U/µl) 2,5 U/µl 1 ---

RNA 5 ng/µl 11* 1

Ampuwa^® ad 20 µl 12

*Es wurden 100 ng RNA je 20 µl Reaktionsansatz verwendet. NRT = ohne Reverse Transkriptase; dNTPs = Desoxyribonukleosidtriphosphate; RNase = Ribonuklease; MuLV = Murine Leukemia Virus

MATERIAL UND METHODEN

53 3.5.4 Quantitative Real-Time PCR

Die Analyse der mRNA-Genexpressionen in den bovinen Hepatozyten erfolgte mittels Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction (rt-qPCR). Die für die Genexpressionanalyse verwendeten Primer sind in Tabelle 12 aufgeführt. Die mRNA der Gene Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH), Ribosomal-Protein-S9 (RPS9) und 18S Ribosomal RNA (18 S) wurden auf ihre Eignung als Referenzgene untersucht. Durch rt-qPCR wurde die synthetisierte cDNA vervielfältigt. Dafür wurde für jedes zu untersuchenden Gen ein Mastermix angefertigt (Tabelle 11). Zu je 4 μl EvaGreen qPCR Supermix wurden 0,4 μl eines

„Forward“-Primers und 0,4 μl eines „Reverse“-Primers gegeben. Die verwendeten Primer für die zu untersuchenden Gene sind in Tabelle 12 aufgeführt. Pro Tube eines 8-Tube Stripes wurde 18μl des vorbereiteten Mastermixes vorgelegt und anschließend 2 μl cDNA in einer Konzentration von 2,5 ng/μl hinzupipettiert. Die Proben wurden im Doppelansatz bestimmt.

Zusätzlich zu den in Kapitel 3.5.3 aufgeführten Kontrollen der cDNA-Synthese wurde pro angesetzten Mastermix je eine weitere Kontrolle zur Überprüfung der verwendeten Reagenzien auf Kontaminationen hergestellt. Diese Kontrollen enthielten neben jeweiligen Mastermix 2 μl RNase freies Wasser (Ampuwa®). Die rt-qPCR wurde in dem C100 Touch Thermal Cycler durchgeführt. Das Programm startete mit einer zehnminütigen Inkubation bei 95 °C zur Aktivierung der Enzyme. Darauf folgten 40 Zyklen a 15 sec bei 95 °C zur Denaturierung der cDNA und der Primer, 30 sec Hybridisierungsphase bei 60 °C und 30 sec bei 72 °C, die der Elongation diente. Nach Abschluss der Zyklen wurde der Cycler auf 60 °C herunter gekühlt. Während der Zyklen lagerten sich die Fluoreszenzfarbstoffe in die DNA ein, wodurch das Fluoreszenssignal proportional mit der Menge der vervielfältigten der Target-DNA anstieg. Die Messung des Fluoreszenzsignals erfolgte nach Verlängerung des Amplikons am Ende jedes Zyklus. Der Zyklus, in dem das Fluoreszenzsignal zum ersten Mal signifikant über die Hintergrund-Fluoreszenz anstieg, wurde als Ct-Wert (engl. cycle threshold; Schwellenwert-Zyklus) dokumentiert und daraus die Menge an mRNA berechnet.

Um Auskunft über die Spezifität der gemessenen Fluoreszenzsignale zu erhalten, wurde eine Schmelzkurve erstellt, indem die Temperatur in 0,5 °C-Schritten von 55 °C auf 95 °C gesteigert wurde. Da die spezifischen PCR-Produkte einen höheren Schmelzpunkt haben als unspezifisch entstehende Primerdimere, können sie durch die Schmelzkurve voneinander unterschieden werden. Wurden die Schmelzkurven als adäquat eingestuft, konnte die

54

Berechnung der relativen Menge der mRNA-Expression der Zielgene in Relation zu dem Referenzgen 18 S mit der ΔΔCt Methode unter Berücksichtigung der Primer-Effizienzen mithilfe von Microsoft Excel folgen.

Tabelle 11: Zusammensetzung des Mastermix für die quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion.

Reagenzien Endkonzentration Mastermix Probe [µl]

EvaGreen qPCR Supermix (5x) 1x 4,0

Forward Primer (10 pM) 0,2 µM 0,4

Reverse Primer (10 pM) 0,2 µM 0,4

cDNA (2,5 ng/µl) 0,25 ng/µl 2

Ampuwa^® ad 20 µl 13,2

cDNA = komplementäre DNA

MATERIAL UND METHODEN

55

Tabelle 12: Informationen zu den in der quantitativen Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion verwendeten Primern. nuclear factor 4 alpha; NFκBIα = Nuclear factor-kappa-B-Inhibitor alpha; 18S rRNA = 18S ribosomal RNA, bp = Basenpaare

56 Auswertung

Die Daten der Versuche wurden mit dem Programm Excel gesammelt und sortiert, um diese im Folgenden mit dem Programm GraphPadPrism 7 statistisch auszuwerten und Grafiken zu erstellen.

3.6.1 Berechnung der relativen Menge der mRNA-Expression

Um die relative Menge der mRNA in den Hepatozyten zu berechnen, wurde zuerst der ΔCt ermittelt, indem der Ct der endogenen Referenz, in diesem Fall des Housekeepergens 18S von der Ct des Zielgenz substrahiert wurde. Weiterhin wurde der ΔΔCt als Differenz von ΔCt der Probe und ΔCt des Kalibrators ermittelt. Als Kalibrator wurde in dem Ko-Kulturversuch über 7 Tage die gemittelten mRNA Expressionen der Proben von Tag 1 verwendet. In dem Inkubationsversuch verschiedener Entzündungshemmer dienten die gemittelten mRNA Expressionen der Zellproben, die ohne Entzündungshemmer kultiviert wurden als Kalibrator.

Die Ratio, also das Verhältnis der mRNA Expression der Probe zu der mRNA Expression des Kalibrators wurde durch 2^-ΔΔCt ermittelt. Um Schwankungen der PCR-Effizienzen von Zielgen zu Referenzgen zu berücksichtigen, wurden mithilfe der Software Bio-Rad CFX Manager bei der Primeretablierung die Effizienzen der verwendeten Primern ermittelt. Die mRNA Expressionen der einzelnen Proben wurden mit der jeweiligen Primereffizienz verrechnet. Durch Quotientbildung aus der Effizienz-korrigierten Ratio des Zielgens und des Referenzgens wurden die errechneten Werte normalisiert.

MATERIAL UND METHODEN

57 3.6.2 Statistische Auswertung

Um statistische Zusammenhänge zwischen Kulturform und Kulturdauer oder Kulturform und Entzündungshemmer zu ermitteln, wurden zuerst die Residuen innerhalb der Versuchsgruppen mit dem D'Agostino-Pearson-Test auf Normalverteilung geprüft. Da die Normalverteilung der Residuen bei allen Datensätzen gegeben war, wurde jeweils eine two-way ANOVA mit anschließenden Tukey Test für Mehrfachvergleiche als post-hoc-Test angewendet. Des Weiteren wurden Unterschiede der Zellausbeute und Zellreinheit zwischen Lebern mit langer und kurzer warmen Ischämiezeit mit dem mit dem D'Agostino-Pearson-Test auf Normalverteilung geprüft. Da alle Werte normalverteilt waren, wurden statistische Unterschiede mithilfe des „unpaired t-test“ analysiert. Die ermittelten Werte sind im Folgenden als Mittelwerte ± Standardabweichung und in den Graphen als Median mit 25 und 75%-Quartilen sowie Minimum und Maximum angegeben.

Die Signifikanzniveaus wurden wie folgt definiert:

P > 0,10 nicht signifikant n.s

P < 0,05 schwach signifikant *

P < 0,01 signifikant **

P < 0,001 hoch signifikant ***

P < 0,0001 höchst signifikant ****

58

4 ERGEBNISSE

Isolation von primären Hepatozyten

Es wurden in dieser Arbeit insgesamt 15 Lebern verwendet, dabei handelte es sich zum einen um Lebern, die nach Schlachtung durch Blutentzug entnommen wurden (n = 6) und daher einer längeren warmen Ischämiezeit (LWI) unterlagen, und um n = 9 Lebern, die nach Euthanasie von Tieren in der Klinik für Rinder gewonnen wurden (kurze warme Ischämiezeit, KWI). Die entsprechende Zellausbeute und Viabilität vor und nach Aufreinigung durch eine Dichtegradientenzentrifugation ist in Tabelle 13 dargestellt. Die gewonnenen Zellzahlen aus Lebern, die einer KWI unterlagen, waren hoch signifikant höher als aus Lebern unter dem Einfluss einer LWI. Die Viabilität der Zellen mit KWI war signifikant höher als die der Zellen mit LWI. Durch Dichtegradientenzentrifugation konnte die Viabilität der Zellen sowohl bei Zellen mit KWI als auch mit LWI schwach signifikant erhöht werden. Die geschätzte Adhäsionsanzahl nach 3 Stunden Inkubation bei 37°C, 95 % Sauerstoff (O2) und 5 % Kohlenstoffdioxid (CO2) betrug in den Kulturen mit LWI 43,3 ± 12,5 %. Die Adhäsionsanzahl der Hepatozyten war mit 90,5 ± 7,6 % höchst signifikant höher als mit LWI.

Exemplarisch sind in Abbildung 7 mikroskopische Aufnahmen von Hepatozyten mit LWI und KWI direkt nach Aussaat der Zellen und nach 3 h Adhäsion dargestellt.

Abbildung 7: Zellen in Kultur direkt nach Aussaat (links), und nach 3 h Adhäsionszeit bei Zellen mit KWI (mitte) und LWI (rechts), mikroskopische Aufnahmen bei 56-facher Vergrößerung. Ausgehend von der Zelldichte vor dem Waschen der nicht adhärenten Zellen wurde die Adhäsionsanzahl der Zellen mit KWI auf 90% und der Zellen mit LWI auf 30%

geschätzt.

ERGEBNISSE

59

Tabelle 13: Zellzahlen, Viabilität und Adhäsion der isolierten bovinen Hepatozyten Rahmen der

*Schlachtung im Rahmen des ChronMast Projekts

**Patienten der Klinik für Rinder, Tierärztliche Hochschule Hannover

(1)Zellen dieser Leber wurden für den Ko-Kulturversuch in Abhängigkeit der Kulturdauer verwendet

(2)Zellen dieser Leber wurden für den Ko-Kulturversuch in Abhängigkeit verschiedener Entzündungshemmer verwendet

60 Isolation von Kupfferzellen

Die Kupfferzellen wurden aus denselben Lebern isoliert wie die Hepatozyten. Die Zellausbeute und Viabilität der Kupferzellen ist in Tabelle 14 dargestellt. Die Kupfferzellausbeute war nicht mit der Länge der warmen Ischämiezeit assoziiert (P > 0,05).

Aus Lebern mit LWI konnten 466 996 ± 231 128 Kupfferzellen pro Gramm Leber isoliert werden. Eine ähnliche Zellausbeute wurde aus Lebern mit KWI erreicht (447 301 ± 272 420 Kupfferzellen/ g Leber). Hoch signifikant dagegen war die Assoziation der Kupfferzell-Viabilität mit der Länge der warmen Ischämiezeit. Die Kupfferzell-Viabilität von Kupferzellen aus Lebern mit LWI betrug 73,8 ± 8.5%, von Kupferzellen aus Lebern mit KWI 96,6 ± 3,0 %. Unter dem Mikroskop stellten sich die isolierten Kupfferzellen als einheitliche kugelige Zellen mit einer Größe von circa 10 µm dar (Abbildung 8a). Größere oder anders geformte Zellen waren direkt nach der Aussaat nicht zu beobachten. Dies lässt auf eine hohe Reinheit der isolierten Kupfferzellen schließen. Mithilfe des inversen Phasenkontrastmikroskops Axiovert 200M konnte die Morphologie der Kupfferzellen abhängig von der Länge der Kulturdauer beurteilt werden. Direkt nach der Aussaat der Zellen wiesen die Kupfferzellen eine runde Form mit einem Größendurchmesser von etwa 10 µm auf (Abbildung 8a). Ab Tag 1 bildeten die Zellen typische sternförmige Zellausläufer aus (Abbildung 8b,c,d). Die Phagozytoseaktivität der sessilen Makrophagen wurde mittels Latex beads überprüft (Abbildung 8b,c,d). Einen Tag nach Aussaat konnten 41,3 % Kupfferzellen mit Phagozytoseaktivität nachgewiesen werden.

An Tag 2 konnten 25,1% phagozytierende Kupfferzellen gezählt werden, an Tag 3 waren es nur noch 13,6%.

ERGEBNISSE

61

Abbildung 8: Kupfferzellen nach 6 h in Kultur (a), nach Tag 1(b), 2(c) und 3(d) mit phagozytierten Latex beads, Ausbildung sternförmiger Zellausläufer ab Tag 1 (weißer Pfeil); Verwendung des inversen Phasenkontrastmikroskops Axiovert 200M mit Fluoreszenzausstattung.

a b

c d

62

Tabelle 14: Zellzahlen, Viabilität und Reinheit der isolierten Kupfferzellen Rahmen der Tötung Kupfferzellen (Zellen/g) Viabilität

lange warme Ischämiezeit (ca. 30 min)

Schlachthof 286 036 60,1%

732 142 75,4%

250 000 68,2%

612 209 80,5%

680 701 83,5%

Dummerstorf* 240 885 74,9%

Mittelwert 466 996 ± 231 525 73,8 ± 8,5 %

kurze warme Ischämiezeit (ca. 5 min)

Hüftluxation** 884 848 94,2%

Hüftluxation**⁽¹⁾ 431 250 89,7%

Mastitis** 284 091 96,2%

Klauendefekt**⁽²⁾ 331 579 98,4%

Hüftluxation**⁽²⁾ 418 421 97,4%

Polyarthritis**⁽²⁾ 164 384 99,0%

Klauendefekt** 222 857 98,6%

Muskelschaden** 367 346 99,0%

Katarakt** 920 930 97,0%

Mittelwert 447 301 ± 272 420 96,6 ± 3,0 %

*Schlachtung im Rahmen des ChronMast Projekts

**Patienten der Klinik für Rinder, Tierärztliche Hochschule Hannover

(1)Zellen dieser Leber wurden für den Ko-Kulturversuch in Abhängigkeit der Kulturdauer verwendet.

(2)Zellen dieser Leber wurden für den Ko-Kulturversuch in Abhängigkeit verschiedener Entzündungshemmer verwendet.

ERGEBNISSE

63 Reinheit der Hepatozytenmonokultur

Zur Darstellung der Hepatozyten wurden an Tag 1 und an Tag 5 die

Zur Darstellung der Hepatozyten wurden an Tag 1 und an Tag 5 die

Im Dokument Ko-Kultur primärer boviner Hepatozyten und Makrophagen (Seite 59-0)