Berechnung der relativen Menge der mRNA-Expression

3 MATERIAL UND METHODEN

3.6.1 Berechnung der relativen Menge der mRNA-Expression

Um die relative Menge der mRNA in den Hepatozyten zu berechnen, wurde zuerst der ΔCt ermittelt, indem der Ct der endogenen Referenz, in diesem Fall des Housekeepergens 18S von der Ct des Zielgenz substrahiert wurde. Weiterhin wurde der ΔΔCt als Differenz von ΔCt der Probe und ΔCt des Kalibrators ermittelt. Als Kalibrator wurde in dem Ko-Kulturversuch über 7 Tage die gemittelten mRNA Expressionen der Proben von Tag 1 verwendet. In dem Inkubationsversuch verschiedener Entzündungshemmer dienten die gemittelten mRNA Expressionen der Zellproben, die ohne Entzündungshemmer kultiviert wurden als Kalibrator.

Die Ratio, also das Verhältnis der mRNA Expression der Probe zu der mRNA Expression des Kalibrators wurde durch 2^-ΔΔCt ermittelt. Um Schwankungen der PCR-Effizienzen von Zielgen zu Referenzgen zu berücksichtigen, wurden mithilfe der Software Bio-Rad CFX Manager bei der Primeretablierung die Effizienzen der verwendeten Primern ermittelt. Die mRNA Expressionen der einzelnen Proben wurden mit der jeweiligen Primereffizienz verrechnet. Durch Quotientbildung aus der Effizienz-korrigierten Ratio des Zielgens und des Referenzgens wurden die errechneten Werte normalisiert.

MATERIAL UND METHODEN

57 3.6.2 Statistische Auswertung

Um statistische Zusammenhänge zwischen Kulturform und Kulturdauer oder Kulturform und Entzündungshemmer zu ermitteln, wurden zuerst die Residuen innerhalb der Versuchsgruppen mit dem D'Agostino-Pearson-Test auf Normalverteilung geprüft. Da die Normalverteilung der Residuen bei allen Datensätzen gegeben war, wurde jeweils eine two-way ANOVA mit anschließenden Tukey Test für Mehrfachvergleiche als post-hoc-Test angewendet. Des Weiteren wurden Unterschiede der Zellausbeute und Zellreinheit zwischen Lebern mit langer und kurzer warmen Ischämiezeit mit dem mit dem D'Agostino-Pearson-Test auf Normalverteilung geprüft. Da alle Werte normalverteilt waren, wurden statistische Unterschiede mithilfe des „unpaired t-test“ analysiert. Die ermittelten Werte sind im Folgenden als Mittelwerte ± Standardabweichung und in den Graphen als Median mit 25 und 75%-Quartilen sowie Minimum und Maximum angegeben.

Die Signifikanzniveaus wurden wie folgt definiert:

P > 0,10 nicht signifikant n.s

P < 0,05 schwach signifikant *

P < 0,01 signifikant **

P < 0,001 hoch signifikant ***

P < 0,0001 höchst signifikant ****

4 ERGEBNISSE

Isolation von primären Hepatozyten

Es wurden in dieser Arbeit insgesamt 15 Lebern verwendet, dabei handelte es sich zum einen um Lebern, die nach Schlachtung durch Blutentzug entnommen wurden (n = 6) und daher einer längeren warmen Ischämiezeit (LWI) unterlagen, und um n = 9 Lebern, die nach Euthanasie von Tieren in der Klinik für Rinder gewonnen wurden (kurze warme Ischämiezeit, KWI). Die entsprechende Zellausbeute und Viabilität vor und nach Aufreinigung durch eine Dichtegradientenzentrifugation ist in Tabelle 13 dargestellt. Die gewonnenen Zellzahlen aus Lebern, die einer KWI unterlagen, waren hoch signifikant höher als aus Lebern unter dem Einfluss einer LWI. Die Viabilität der Zellen mit KWI war signifikant höher als die der Zellen mit LWI. Durch Dichtegradientenzentrifugation konnte die Viabilität der Zellen sowohl bei Zellen mit KWI als auch mit LWI schwach signifikant erhöht werden. Die geschätzte Adhäsionsanzahl nach 3 Stunden Inkubation bei 37°C, 95 % Sauerstoff (O2) und 5 % Kohlenstoffdioxid (CO2) betrug in den Kulturen mit LWI 43,3 ± 12,5 %. Die Adhäsionsanzahl der Hepatozyten war mit 90,5 ± 7,6 % höchst signifikant höher als mit LWI.

Exemplarisch sind in Abbildung 7 mikroskopische Aufnahmen von Hepatozyten mit LWI und KWI direkt nach Aussaat der Zellen und nach 3 h Adhäsion dargestellt.

Abbildung 7: Zellen in Kultur direkt nach Aussaat (links), und nach 3 h Adhäsionszeit bei Zellen mit KWI (mitte) und LWI (rechts), mikroskopische Aufnahmen bei 56-facher Vergrößerung. Ausgehend von der Zelldichte vor dem Waschen der nicht adhärenten Zellen wurde die Adhäsionsanzahl der Zellen mit KWI auf 90% und der Zellen mit LWI auf 30%

geschätzt.

ERGEBNISSE

Tabelle 13: Zellzahlen, Viabilität und Adhäsion der isolierten bovinen Hepatozyten Rahmen der

*Schlachtung im Rahmen des ChronMast Projekts

**Patienten der Klinik für Rinder, Tierärztliche Hochschule Hannover

(1)Zellen dieser Leber wurden für den Ko-Kulturversuch in Abhängigkeit der Kulturdauer verwendet

(2)Zellen dieser Leber wurden für den Ko-Kulturversuch in Abhängigkeit verschiedener Entzündungshemmer verwendet

60 Isolation von Kupfferzellen

Die Kupfferzellen wurden aus denselben Lebern isoliert wie die Hepatozyten. Die Zellausbeute und Viabilität der Kupferzellen ist in Tabelle 14 dargestellt. Die Kupfferzellausbeute war nicht mit der Länge der warmen Ischämiezeit assoziiert (P > 0,05).

Aus Lebern mit LWI konnten 466 996 ± 231 128 Kupfferzellen pro Gramm Leber isoliert werden. Eine ähnliche Zellausbeute wurde aus Lebern mit KWI erreicht (447 301 ± 272 420 Kupfferzellen/ g Leber). Hoch signifikant dagegen war die Assoziation der Kupfferzell-Viabilität mit der Länge der warmen Ischämiezeit. Die Kupfferzell-Viabilität von Kupferzellen aus Lebern mit LWI betrug 73,8 ± 8.5%, von Kupferzellen aus Lebern mit KWI 96,6 ± 3,0 %. Unter dem Mikroskop stellten sich die isolierten Kupfferzellen als einheitliche kugelige Zellen mit einer Größe von circa 10 µm dar (Abbildung 8a). Größere oder anders geformte Zellen waren direkt nach der Aussaat nicht zu beobachten. Dies lässt auf eine hohe Reinheit der isolierten Kupfferzellen schließen. Mithilfe des inversen Phasenkontrastmikroskops Axiovert 200M konnte die Morphologie der Kupfferzellen abhängig von der Länge der Kulturdauer beurteilt werden. Direkt nach der Aussaat der Zellen wiesen die Kupfferzellen eine runde Form mit einem Größendurchmesser von etwa 10 µm auf (Abbildung 8a). Ab Tag 1 bildeten die Zellen typische sternförmige Zellausläufer aus (Abbildung 8b,c,d). Die Phagozytoseaktivität der sessilen Makrophagen wurde mittels Latex beads überprüft (Abbildung 8b,c,d). Einen Tag nach Aussaat konnten 41,3 % Kupfferzellen mit Phagozytoseaktivität nachgewiesen werden.

An Tag 2 konnten 25,1% phagozytierende Kupfferzellen gezählt werden, an Tag 3 waren es nur noch 13,6%.

ERGEBNISSE

Abbildung 8: Kupfferzellen nach 6 h in Kultur (a), nach Tag 1(b), 2(c) und 3(d) mit phagozytierten Latex beads, Ausbildung sternförmiger Zellausläufer ab Tag 1 (weißer Pfeil); Verwendung des inversen Phasenkontrastmikroskops Axiovert 200M mit Fluoreszenzausstattung.

a b

c d

Tabelle 14: Zellzahlen, Viabilität und Reinheit der isolierten Kupfferzellen Rahmen der Tötung Kupfferzellen (Zellen/g) Viabilität

lange warme Ischämiezeit (ca. 30 min)

Schlachthof 286 036 60,1%

732 142 75,4%

250 000 68,2%

612 209 80,5%

680 701 83,5%

Dummerstorf* 240 885 74,9%

Mittelwert 466 996 ± 231 525 73,8 ± 8,5 %

kurze warme Ischämiezeit (ca. 5 min)

Hüftluxation** 884 848 94,2%

Hüftluxation**⁽¹⁾ 431 250 89,7%

Mastitis** 284 091 96,2%

Klauendefekt**⁽²⁾ 331 579 98,4%

Hüftluxation**⁽²⁾ 418 421 97,4%

Polyarthritis**⁽²⁾ 164 384 99,0%

Klauendefekt** 222 857 98,6%

Muskelschaden** 367 346 99,0%

Katarakt** 920 930 97,0%

Mittelwert 447 301 ± 272 420 96,6 ± 3,0 %

*Schlachtung im Rahmen des ChronMast Projekts

**Patienten der Klinik für Rinder, Tierärztliche Hochschule Hannover

(1)Zellen dieser Leber wurden für den Ko-Kulturversuch in Abhängigkeit der Kulturdauer verwendet.

(2)Zellen dieser Leber wurden für den Ko-Kulturversuch in Abhängigkeit verschiedener Entzündungshemmer verwendet.

ERGEBNISSE

63 Reinheit der Hepatozytenmonokultur

Zur Darstellung der Hepatozyten wurden an Tag 1 und an Tag 5 die Hepatozytenmonokulturen mithilfe der Antikörper CK18 und panCK angefärbt (Abbildung 9). Auch im zur Kontrolle angefertigten Gefrierschnitt konnte mithilfe genannter Antikörper das Zytoskelett der Hepatozyten dargestellt werden (Abbildung 9c).

a

b

c

Abbildung 9: Darstellung der Hepatozyten mithilfe des „Monoclonal Anti-CK18 antibody produced in mouse“ (rot), (Sigma- Aldrich, St. Louis, USA) und des „Monoclonal Anti-panwide spectrumCytokeratin antibody produced in rabbit“ (grün), (Sigma- Aldrich, St. Louis, USA). Intakte Zellkerne wurden mithilfe einer Hoechst-Färbung blau angefärbt. Aufgenommen mittels des inversen Phasenkontrastmikroskop Axiovert 200M mit Fluoreszenzausstattung. Hepatozytenmonokultur an Tag 1 (a) und Tag 5 (b), Kontrollfärbung eines Lebergefrierschnittes (c)

ERGEBNISSE

Für die Beurteilung, ob bei der Zell-Aufreinigung durch 25%-iges Percoll die Hepatozyten komplett von Kupfferzellen separiert werden konnten, wurden fluorenzenzmarkierte Latex beads verwendet. Abbildung 10 zeigt eine HMC an Tag 1 nach einer 24 h Inkubation mit Latex beads. Anhand der fluoreszierenden Zellen konnte eine Anwesenheit von 17,5%

Kupfferzellen in HMC (Verhältnis Hepatozyten : Kupfferzellen von 1 : 5,5) nachgewiesen werden (Abbildung 10).

Ko-Kultivierung von Hepatozyten mit Kupfferzellen über 7 Tage Abbildung 10: Darstellung der Kupfferzellen in der Hepatozytenzellkultur mithilfe von Fluorenzenz-markierter Latex beads (L2778, Sigma- Aldrich, St. Louis, USA). Aufgenommen mittels des inversen Phasenkontrastmikroskops Axiovert 200M mit Fluoreszenzausstattung.

4.3.1 Einfluss der Kulturform auf die Hepatozytenmorphologie

Anhand der morphologischen Beurteilung mittels des inversen Phasenkontrastmikroskops Axiovert 200M konnten keine Unterschiede zwischen den verschiedenen Kulturmodellen festgestellt werden (Abbildung 11e). Im Verlauf der Kultur veränderte sich die Morphologie der Hepatozyten dagegen deutlich. Unmittelbar nach der Aussaat der Zellen stellten sich die Hepatozyten unter dem Mikroskop dreidimensional kugelig dar und lagen meist einzeln oder in kleinen Grüppchen von drei bis vier Zellen vor. Zell-zu-Zell Kontakte konnten nicht beobachtet werden. Auch noch nach einem Tag in Kultur wiesen die Zellen eine vorwiegend runde Morphologie auf. Jedoch konnten an Tag 1 bereits erste abgeflachte Zellen beobachtet werden. Auch erste Zell-zu-Zell Kontakte wurden an Tag 1 ausgebildet. Am zweiten Tag in Kultur waren deutlich weniger Hepatozyten mit kugeliger Form zu sehen, dafür war der Anteil der Zellen, die Zell-zu-Zell Kontakte bildeten, deutlich gestiegen. Bereits am dritten Tag wurden kaum noch Zellen gesehen die keine Zell-zu-Zell Kontakte ausgebildet hatten.

An Tag 4 waren vereinzelt Fibroblasten-ähnliche Zellausläufer zu beobachten. Die Form der Zellen konnte zu diesem Zeitpunkt als vorwiegend polygonal beschrieben werden. An Tag 7 waren deutlich Zellausläufer der dann sehr abgeflachten Hepatozyten zu erkennen.

Exemplarisch wurden mit dem inversen Phasenkontrastmikroskop Axiovert 200 Aufnahmen von MHC von Tag 0 bis Tag 7 und an Tag 4 vergleichend der Kulturformen MHC, HKCd und HKCid gemacht, die in Abbildung 11 dargestellt sind. Die Viabilität der Zellen wurde an Tag 4 anhand einer Live-Dead Färbung beurteilt (Abbildung 12). Die Kontrolle aus mit Methanol behandelten Zellen ergab ein einheitliches Bild aus rot markierten Zellen (keine Abbildung vorhanden). In der Viabilität der Zellen ergaben sich minimale Unterschiede zwischen den unterschiedlichen Kulturformen. Bei den Zellen der MHC konnte eine Viabilität von 81,9% festgestellt werden. In HKCd konnte im Vergleich dazu mit 79,4% eine geringgradig niedrigere und in HKCid mit 83,2% eine geringgradig höhere Vitalität festgestellt werden (P < 0,05) (Anhang; Tabelle 19).

ERGEBNISSE

a.)

b.)

c.)

d.)

e.)

e.1) e.2)

ERGEBNISSE

f.)

Abbildung 11: Hepatozyten in Sandwichkonfiguration, nach 4h (a), Tag 1 (b), 2 (c), 3 (d), 4 (e) und 7 (f) in Kultur.

e1.) zeigt eine HKCid und e.2) HKCd im Vergleich zu HKC (e). Die dreidimensionalen Zellen flachten schon nach einem Tag in Kultur merklich ab und erlangten im Zuge der Zell-zu-Zell-Kontaktbildung (dicker weisser Pfeil) eine polygonale Form. Ab Tag 4 konnte die Ausbildung Fibroblasten-ähnlicher Zellausläufer beobachtet werden (dünner weisser Pfeil). Verwendung des Axiovert 200M, inversen Phasenkontrastmikroskops, Vergrößerung 10(links) und 20 (rechts).

a.)

b.)

c.)

Abbildung 12: LIVE-DEAD®-Färbung von HMC (a), HKCd (b) und HKCid (c) nach 4 d in Kultur; lebende Zellen, die den Farbstoff Calcein AM enthielten, fluoreszierten grün; Zellen mit beschädigten Membranen enthielten EthD-1 und fluoreszierten rot. Verwendung des inversen Phasenkontrastmikroskops Axiovert 200M mit Fluoreszenzausstattung, links unter Verwendung des roten und grünen Fluoreszenzkanals, rechts nur unter der Verwendung des roten Fluoreszenzkanals.

ERGEBNISSE

4.3.2 Einfluss der Kulturform auf die Harnstoffkonzentration im Kulturmedium

In Abbildung 13 ist die Harnstoffmenge im Kulturmedium in HMC, HKCd und HKCid in Abhängigkeit der Kulturdauer (Tag 1,2,3,4 und 7) dargestellt. Die Rohdaten und statistischen Unterschiede der Harnstoffmengen in Abhängigkeit der Kulturdauer und Kulturform sind im Anhang in Tabelle 21 aufgeführt. Die Harnstoffkonzentration im Kulturmedium stieg von Tag 1 bis Tag 7 unabhängig von der Kulturform höchst signifikant an. Unterschiede zwischen den Kulturformen in der Medium Harnstoffkonzentration konnten nicht festgestellt werden (P>

0,05).

Abbildung 13: Effekt der Kulturdauer und des Kulturmodells auf die Harnstoffkonzentration in dem Kulturmedium. Es wurden drei verschiedene Kulturmodelle angefertigt, die vergleichend unter denselben Bedingungen über 7 Tage kultiviert wurden. Ko-Kultur von Hepatozyten mit Kupfferzellen in direktem Kontakt zueinander (HKCd); Ko-Ko-Kultur von Hepatozyten mit Kupfferzellen über eine trennende Kollagenschicht in indirektem Kontakt (HKCid); Mono-Kultur von Hepatozyten (HMC). Ein Boxplot mit Whiskers gibt den Median von sechs Proben mit den 25 und 75% Quartilen sowie Minimum und Maximum an.

Tag 1

Tag 2

Tag 3

Tag 4

Tag 7 0

5 0 0 1 0 0 0 1 5 0 0 2 0 0 0

Harnstoff (nmol/ml)

H K C d H K C id H M C

72 4.3.3 Ergebnisse der Genexpressionsanalyse

Im HKCd-Modell konnten die Hepatozyten für die Genexpressionsanalyse nicht von Kupfferzellen getrennt werden. Daher wurden bei diesem Versuch ausschließlich Gene gemessen, die spezifisch für bovine Hepatozyten sind. Als interner Standard für die Zielproteinanalyse sollten ursprünglich die in Hepatozytenkulturen am häufigsten verwendeten Housekeepergene GAPDH und β-Actin dienen. Allerdings stellte sich die mRNAExpression von GAPDH in vorangegangenen Studien der Arbeitsgruppe von Frau Schmicke als reguliert dar (unveröffentlichte Ergebnisse). Aus diesem Grund wurden die Housekeepergene β-Actin und RPS9 getestet, welche ebenfalls sowohl von der Kulturdauer als auch durch verschiedene Medienzusätze reguliert wurden (Anhang Tabelle 20 ). Die 18S-mRNA-Expression dagegen blieb sowohl im Verlauf der Kultur als auch unter verschiedenen Medienzusätzen weitestgehend unbeeinflusst und wurde daher in allen Versuchen als Referenzgen verwendet. Die Verwendung von primären bovinen Hepatozyten, die direkt nach der Dichtegradientenzentrifugation gesammelt wurden, stellte sich als Kalibrator in den Vorgängerversuchen als ungünstig dar, weil die Diskrepanz der Genexpressionen zu den der kultivierten Zellen sehr hoch war. Daher wurden in diesem Versuch die Mittelwerte der Genexpressionen von Tag 1 als Kalibrator verwendet. Die Genexpressionsergebnisse werden im Folgenden als relative Ratio zu diesem Kalibrator angegeben. Dabei entspricht eine mRNA-Expression mit einer Ratio von 1 der relativen mRNA Expression des entsprechenden Gens gemessen für den Kalibrator. In Abbildung 14 ist die relative mRNA-Expression der Zielgene in Abhängigkeit von den verschiedenen Kulturmodellen im Verlauf von 7 Tagen dargestellt. Die Genexpressionen wurden im Folgenden immer zuerst auf Interaktion der Faktoren Kulturdauer und Kulturform untersucht. Danach wurde auf detailliert auf statistische Unterschiede eingegangen.

4.3.3.1 Albumin mRNA-Expression in Abhängigkeit der Kulturform

In Abbildung 14a ist die Albumin mRNA-Expression der Hepatozyten in HMC, KKCd und KKCid in Abhängigkeit der Kulturdauer dargestellt. Sowohl die Kulturdauer als auch die

ERGEBNISSE

Kulturform hatten einen signifikanten Einfluss auf die Albumin mRNA-Expression. Es bestand keine signifikante Interaktion zwischen Kulturdauer zu Kulturform (P > 0,05).

Der signifikante Einfluss der Kulturdauer war lediglich in dem HKCid-Modell sichtbar. Hier stieg die Albumin mRNA-Expression an Tag 2 und Tag 3 im Vergleich zu Tag 1 an (P<0,05).

An Tag 4 sank die Expression dann wieder ab, um bis Tag 7 höchst signifikant anzusteigen.

In der Kulturform HKCd war im Verlauf der Kultur keine signifikante Änderung der Albumin mRNA-Expression messbar. Doch auch in diesem Modell konnte ein mit HKCid vergleichbarer Verlauf der numerischen Albumin mRNA-Expression in Abhängigkeit der Kulturdauer festgestellt werden. Ebenso verhielt es sich in HMC. Hier konnte erst an Tag 7 ein hoch signifikanter Anstieg der Albumin mRNA-Expression festgestellt werden. Der Einfluss des Kulturmodelles auf die Albumin mRNA-Expression zeigte sich vorrangig in dem HKCid-Modell verglichen mit HMC und HKCd. Die numerische Albumin mRNA-Expression in HKCid lag während der gesamten Kulturdauer deutlich über den Albumin mRNA-Expressionen in HKCd und HMC (P<0,1). Lediglich an Tag 2 und Tag 3 war die Albumin mRNA-Expression in HKCid signifikant höher als in HMC und an Tag 2 und Tag 7 auch signifikant höher als in HKCd (Abbildung 14a).

4.3.3.2 HNF4α mRNA-Expression in Abhängigkeit der Kulturform

Die HNF4α mRNA-Expression der Hepatozyten in HMC, KKCd und KKCid in Abhängigkeit der Kulturdauer ist in Abbildung 14b dargestellt. Bei der HNF4α mRNA-Expression hatte die Kulturdauer einen signifikanten Einfluss, während die Kulturformen nur einen schwach signifikanten Einfluss hatten. Auch hier bestand keine signifikante Interaktion zwischen der Kulturdauer und der Kulturform (P>0,05). Es war ein Anstieg der HNF4α mRNA -Expression an Tag 2 und Tag 3, ein deutlicher Abfall an Tag 4 und ein anschließender Wiederanstieg der Expression an Tag 7 zu messen. Dabei war der Anstieg der mRNA-Expression von Tag 1 zu Tag 7 in HKCid schwach signifikant und von Tag 4 auf Tag 7 in HMC signifikant. Die HNFα mRNA-Expressionen unterhalb der verschiedenen Kulturformen unterschieden sich nicht signifikant, obwohl auch hier die numerische HNF4α mRNA-Expression in HKCid höher war als in den anderen Kulturformen (Abbildung 14b).

4.3.3.3 GHR1A-mRNA-Expression in Abhängigkeit der Kulturform

Sowohl die Kulturdauer als auch das Kulturmodell hatten einen signifikanten Einfluss auf die GHR1A mRNA-Expression. Außerdem bestand eine signifikante Interaktion zwischen der Kulturdauer und den Kulturmodellen (Abbildung 14c).

Auch bei Betrachtung der GHR1A Genexpression zeichnete sich ein mit der Albumin- und HNF4α mRNA-Expression vergleichbarer Einfluss der Kulturdauer ab. Signifikanz erlangte dies allerdings lediglich in der Hepatozyten Mono-Kultur. Hier konnte ein hoch signifikanter Anstieg der GHR1A mRNA-Expression von Tag 1 auf Tag 2 verzeichnet werden. An Tag 4 sank die Expression wieder schwach signifikant ab und stieg an Tag 7 erneut höchst signifikant an. Die GHR1A mRNA Expression der Kulturmodelle HKCd und HKCid wurden von der Kulturdauer nicht signifikant beeinflusst. Dementsprechend war die GHR1A mRNA-Expression in HMC konstant signifikant höher als in HKCd und HKCid (Abbildung 14c).

Albumin mRNA Expression

ERGEBNISSE wurden drei verschiedene Kulturmodelle angefertigt, die vergleichend unter denselben Bedingungen über 7 Tage kultiviert wurden. Ko-Kultur von Hepatozyten mit Kupfferzellen in direktem Kontakt zueinander (HKCd); Ko-Ko-Kultur von Hepatozyten mit Kupfferzellen über eine trennende Kollagenschicht in indirektem Kontakt (HKCid); Mono-Kultur von Hepatozyten (HMC). Ein Boxplot mit Whiskers gibt den Median von sechs Proben mit den 25 und 75% Quartilen sowie Minimum und Maximum an. * p < 0,05; ** p< 0,01; *** p< 0,001;

**** p< 0,0001

4.3.4 Zytokinkonzentrationen im Kulturmedium in Abhängigkeit der Kulturform

Um eine Produktion von Zytokinen durch Inflammation zu untersuchen, wurden die Konzentrationen von TNF-α (Tabelle 15) und IL-6 (Tabelle 16) im Kulturmedium an Tag 1,2,3,4, und 7 gemessen.

Tabelle 15: TNF-α Konzentration in ng/ml im Kulturmedium von HKCd, HKCid und HMC in Abhängigkeit der Kulturdauer

Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 4 Tag 7

HKCd 0,04 0,02 0,02 0,03 0,01

< 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01

HKCid 0,04 0,03 0,02 0,01 0,01

< 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01

HMC 0,04 0,02 0,03 0,03 < 0,01

0,02 < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01

< 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01

Messung mithilfe des TNF-α Bovine ELISA Kit von ThermoFisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) mit einem Messbereich von 0.1 bis 30 ng/mL

ERGEBNISSE

Tabelle 16: Il-6 Konzentration in pg/ml im Kulturmedium von HKCd, HKCid und HMC in Abhängigkeit der Kulturdauer

Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 4 Tag 7

HKCd < 78 < 78 < 78 < 78 < 78

< 78 < 78 < 78 < 78 < 78

HKCid < 78 < 78 < 78 < 78 < 78

< 78 < 78 < 78 < 78 < 78

HMC < 78 < 78 < 78 < 78 < 78

< 78 < 78 < 78 < 78 < 78

Messung mithilfe des Bovine IL-6 ELISA Reagent von ThermoFisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) mit einem Messbereich von 78 bis 5000 pg/mL.

Vergleichende Betrachtung verschiedener Entzündungshemmer

Die Auswirkung verschiedener Medien mit unterschiedlichen Entzündungshemmern bzw.

unterschiedlichen Konzentrationen auf morphologische und funktionelle Merkmale boviner Hepatozyten wurde parallel an HKCid und HMC getestet.

4.4.1 Harnstoffkonzentration im Kulturmedium in Abhängigkeit des Entzündungshemmers

Die Harnstoffkonzentration im Kulturmedium wurde durch den verwendeten Entzündungshemmer beeinflusst (P < 0,0001), nicht jedoch durch die Kulturform (P = 0,0840) (Abbildung 15). Dabei war die Harnstoffkonzentration in HKCid unter Einfluss von Dexamethason schwach signifikant höher als unter dem Einfluss von Aspirin und der pharmakologischen Konzentration DHEA. In HMC war die Harnstoffkonzentration unter Einfluss von Dexamethason signifikant höher als unter dem Einfluss von Aspirin und schwach signifikant höher als unter dem Einfluss von Aspirin mit DHEA und DHEA sowohl in pPharmakologischer als auch physiologischer Konzentration (Abbildung 15).

Harnstoff (nmol/ml)

Effekt P-Wert

Kulturdauer < 0,0001

Kulturform 0,3168

Kulturdauer*Kulturform 0,9423

Abbildung 15: Effekt verschiedener Entzündungshemmer auf die Harnstoffkonzentration im Kulturmedium. Die Entzündungshemmer wurden an zwei Kulturmodellen getestet: Ko-Kultur von Hepatozyten mit Kupfferzellen über eine trennende Kollagenschicht in indirektem Kontakt (HKCid); Mono-Kultur von Hepatozyten (HMC). An Tag 4 wurde das Kulturmedium abgenommen und mithilfe des Urea Assay Kit (Abcam, Cambridge, UK) die Harnstoffkonzentration bestimmt. Ein Boxplot mit Whiskers gibt den Median von vier Proben mit den 25 und 75% Quartilen sowie Minimum und Maximum an. * p < 0,05; ** p< 0,01; *** p< 0,001; **** p< 0,0001

ERGEBNISSE

4.4.2 Ergebnisse der mRNA-Expressionsanalyse

Die Hepatozyten wurden durch das Abtragen der zweiten Kollagenschicht von den Kupfferzellen getrennt. Somit war es in dieser Kulturform möglich, auch die Expression Nicht-Hepatozyten-spezifischer Gene zu ermitteln. Als interner Standard für die Zielproteinanalyse diente die 18S mRNA-Expression. Die gemittelten mRNA-Expressionen der Hepatozyten, die ohne Entzündungshemmer inkubiert wurden, dienten als Kalibrator. Die Ergebnisse werden im Folgenden als relative Ratio zu dem Kalibrator angegeben. Dabei entspricht eine mRNA-Expression mit einer Ratio von 1 der relativen mRNA-Expression des entsprechenden Gens gemessen für den Kalibrator. In Abbildung 16 sind die relativen mRNA-Expressionen verschiedener Gene in Abhängigkeit von den verschiedenen Kulturmedien und -formen an Tag 4 dargestellt. Wie zuvor wurden die mRNA-Expressionen immer zuerst auf Interaktion der Faktoren Kulturdauer und Kulturform untersucht. Danach wurde detailliert auf statistische Unterschiede eingegangen.

4.4.2.1 NFκB-Inhibitor mRNA-Expression in Abhängigkeit des Entzündungshemmers

In Abbildung 16a ist die NFκB-Inhibitor mRNA-Expression der Hepatozyten in HMC und HKCid in Abhängigkeit des verwendeten Entzündungshemmers dargestellt. Weder die Entzündungshemmer im Kulturmedium noch die Kulturform hatten einen signifikanten

Im Dokument Ko-Kultur primärer boviner Hepatozyten und Makrophagen (Seite 70-0)