Stoffwechselfunktion der Hepatozyten in Abhängigkeit der Kulturform

Die Überprüfung der Viabilität der primären bovinen Hepatozyten während der Kultivierung erfolgte neben der täglichen mikroskopischen Analyse anhand der Genexpression von Albumin-mRNA an den Versuchstagen 1,2,3,4 und 7. Die Synthese von Albumin findet in vivo größtenteils in den Hepatozyten statt und wird deswegen zur Bewertung der leberspezifischen Funktionen von Hepatozyten in Kultur herangezogen (Bale et al. 2016;

Dunn, Tompkins, und Yarmush 1991; Koike et al. 1996; Nguyen et al. 2015).

Eine verbesserte Stoffwechselfunktion der Hepatozyten zeigte sich in der eigenen Arbeit im gesamten Verlauf in der HKCid durch eine höhere Albumin mRNA-Expression in der HKCid im Vergleich zu der HKCd und HMC. Diese Ergebnisse deckten sich mit den Ergebnissen der Studie von Milosevic et al. (1999), die in nicht mit LPS stimulierten HKCid Ko-Kulturen ebenfalls höhere Albuminkonzentrationen messen konnten als in Hepatozyten-Monokulturen.

Auch West et al. (1989) konnten in einer Ko-Kultur von Hepatozyten und in Transwell inserts zugefügten und damit in indirekten Kontakt stehenden Kupfferzellen eine deutlich erhöhte Proteinsynthese der Hepatozyten im Gegensatz zu in Hepatozyten-Monokulturen feststellen.

Hoebe et al. (2001) wiesen HKCd eine hepatotoxische Wirkung durch signifikant höhere Konzentrationen an TNF-α, IL-6, und Stickstoffmonoxid (NO) im Vergleich zu HKCid und HMC nach. Im Gegensatz zur letztgenannten Studie wurden die eigenen Kulturen nicht mit LPS stimuliert. Auch konnte in dem eigenen Versuch kein hepatotoxischer Effekt der Kupfferzellen nachgewiesen werden, wenngleich die Ko-Kultur mit Kupfferzellen im direkten Kontakt auch keinen vorteilhaften Effekt auf die Stoffwechselfunktion und das Dedifferentierungsverhalten der Hepatozyten erkennen ließ. Milosevic et al. (1999) begründeten die verbesserten Ergebnisse gegenüber HKCd mit der physiologischen Lage der Kupfferzellen außerhalb des DISSÉ-Raums, wo sie durch die Sinusendothelzellen ebenfalls räumlich von den Hepatozyten getrennt sind. Anhand der der erhöhten Albumin

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Expression in HKCid kann spekuliert werden, dass Kupfferzellen in indirektem Kontakt, im Gegensatz zu Kupfferzellen in direktem zu Hepatozyten, Faktoren sezernieren, die die primären bovinen Hepatozyten zu verstärkter Stoffwechselfunktion anregen. Ein Grund dafür könnte das Verhältnis von M1-Kupfferzellen zu M2-Kupfferzellen sein, welches laut Mills (2001) nicht nur eine zentrale Rolle in der Entstehung von inflammatorischen Prozessen in der Leber einnimmt, sondern auch die Stoffwechselfunktionen in der Leber maßgeblich beeinflusst. Die Kupfferzellen, die im direkten Kontakt zu Hepatozyten liegen, könnten durch geschädigte Hepatozyten vermehrt mit Signalstoffen konfrontiert werden, welche sie zu einer klassischen Aktivierung zur M1-Kupfferzelle angeregen könnten. Eine Unterscheidung der einzelnen Makrophagen Subpopulationen fand in der eigenen Arbeit allerdings nicht statt.

Im Verlauf der Kultur stieg die Expression von Albumin-mRNA parallel in allen Kulturmodellen von Tag 1 bis Tag 3 an, sank aber an Tag 4 wieder auf den Ausgangszustand ab. An Tag 7 war wiederum eine hohe Albuminkonzentration zu verzeichnen. Derselbe Verlauf der Hepatozytenfunktionalität spiegelte sich auch in den anderen gemessenen Parametern (HNF4α und GHR1A) wieder. Die meisten Studien über den Erhalt der Stoffwechselfunktion von Langzeit-kultivierten Hepatozyten zeigten keinen Abfall der Stoffwechselparameter über die Zeit (Abu-Absi et al. 2004; Bader et al. 1996; Bale et al.

2016; Dunn et al. 1991). Meist wurden in diesen Studien Zellproben in größeren Abständen genommen, sodass evtl. kurzfristige Erniedrigung der Albumin mRNA-Expression, wie in der eigenen Studie beobachtet, überhaupt nicht erfasst wurden. Bhatia et al. (1999) konnten am dritten Tag eine kurzfristige Erniedrigung mit anschließenden Wiederanstieg der Albumin Sekretion verzeichnen. Dieser Verlauf ähnelte dem der eigenen Versuche. Auch in den Sandwichkulturen von Ehrhardt und Schmicke (2016) zeigte der Verlauf von Harnstoff gemessen im Medium und LDH einen minimalen Anstieg an Tag 1 und 2 und sank ab Tag 3 stetig ab. Auch in diesem Versuch waren ab Tag 7 wieder höhere Werte messbar.

Das im Rahmen des Proteinstoffwechsels anfallende Ammoniak wird in den Hepatozyten durch Harnstoffbiosynthese im periportalen Bereich der Leber zu dem Ausscheidungsprodukt Harnstoff umgewandelt. Aus diesem Grund wird der quantitative Nachweis der Harnstoffsekretion ins Kulturmedium in vielen Studien als ein wichtiger Funktionsparameter zur Beurteilung der Hepatozytenfunktionalität in Kultur angegeben (Bale et al. 2016; Dunn et al. 1991; Koike et al. 1996; Nguyen et al. 2015). Isolierte Kupfferzellen synthetisieren jedoch

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ebenfalls Harnstoff und zwar in Mengen, die durchaus vergleichbar mit denen von Hepatozyten synthetisierten Harnstoffkonzentrationen sind (Wagle et al. 1976). Dabei sind es speziel die M2-Makrophagen, die Arginin zu Ornithin und Harnstoff metabolisieren, während Arginin von M1-Makrophagen zu Stickstoff und Citrullin umgewandelt wird (Mills 2001).

Aus diesem Grund ist Harnstoff kein geeigneter Parameter für die Stoffwechselfunktion speziell der Hepatozyten. Trotzdem können anhand der Harnstoffkonzentration im Zellkulturüberstand Rückschlüsse auf die Funktionalität des Stoffwechselgeschehens, spezieller der Detoxifikation in der gesamten Kultureinheit geschlossen werden. In diesem Versuch sind keine Unterschiede der Harnstoffkonzentrationen in den verschiedenen Kulturformen zu erkennen. In Abhängigkeit der Kulturdauer zeigt sich die Harnstoffkonzentration in allen drei Kulturformen steigend. Die Behandlung der Zellkulturen mit Dexamethason lässt davon ausgehen, dass der Großteil der in den Kulturen vorhandenen Kupfferzellen alternativ aktiviert wurde (M2-Kupfferzellen) und damit Harnstoff synthetsiert.

Um abzugrenzen welcher Anteil der Harnstoffkonzentration im Zellkulturüberstand von den Kupfferzellen beziehungsweise von den Hepatozyten synthetisiert wurde, ist es in Zukunft notwendig, den Anteil der Kupfferzellen in HMC deutlich zu reduzieren. Dann kann die Bestimmung der Harnstoffkonzentration in dem Zellkulturüberstand zukünftig bei vergleichender Betrachtung der HMC und HKCid als indirekter Marker für den Aktivierungszustand der Kupfferzellen verwendet werden. So würde eine, im Vergleich zu HMC erniedrigte Harnstoffkonzentration in HKCid für klassisch aktivierte Kupfferzellen sprechen.

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