Einfluss der Kulturform auf die Harnstoffkonzentration im Kulturmedium

4 ERGEBNISSE

4.3.2 Einfluss der Kulturform auf die Harnstoffkonzentration im Kulturmedium

In Abbildung 13 ist die Harnstoffmenge im Kulturmedium in HMC, HKCd und HKCid in Abhängigkeit der Kulturdauer (Tag 1,2,3,4 und 7) dargestellt. Die Rohdaten und statistischen Unterschiede der Harnstoffmengen in Abhängigkeit der Kulturdauer und Kulturform sind im Anhang in Tabelle 21 aufgeführt. Die Harnstoffkonzentration im Kulturmedium stieg von Tag 1 bis Tag 7 unabhängig von der Kulturform höchst signifikant an. Unterschiede zwischen den Kulturformen in der Medium Harnstoffkonzentration konnten nicht festgestellt werden (P>

0,05).

Abbildung 13: Effekt der Kulturdauer und des Kulturmodells auf die Harnstoffkonzentration in dem Kulturmedium. Es wurden drei verschiedene Kulturmodelle angefertigt, die vergleichend unter denselben Bedingungen über 7 Tage kultiviert wurden. Ko-Kultur von Hepatozyten mit Kupfferzellen in direktem Kontakt zueinander (HKCd); Ko-Ko-Kultur von Hepatozyten mit Kupfferzellen über eine trennende Kollagenschicht in indirektem Kontakt (HKCid); Mono-Kultur von Hepatozyten (HMC). Ein Boxplot mit Whiskers gibt den Median von sechs Proben mit den 25 und 75% Quartilen sowie Minimum und Maximum an.

Tag 1

Tag 2

Tag 3

Tag 4

Tag 7 0

5 0 0 1 0 0 0 1 5 0 0 2 0 0 0

Harnstoff (nmol/ml)

H K C d H K C id H M C

72 4.3.3 Ergebnisse der Genexpressionsanalyse

Im HKCd-Modell konnten die Hepatozyten für die Genexpressionsanalyse nicht von Kupfferzellen getrennt werden. Daher wurden bei diesem Versuch ausschließlich Gene gemessen, die spezifisch für bovine Hepatozyten sind. Als interner Standard für die Zielproteinanalyse sollten ursprünglich die in Hepatozytenkulturen am häufigsten verwendeten Housekeepergene GAPDH und β-Actin dienen. Allerdings stellte sich die mRNAExpression von GAPDH in vorangegangenen Studien der Arbeitsgruppe von Frau Schmicke als reguliert dar (unveröffentlichte Ergebnisse). Aus diesem Grund wurden die Housekeepergene β-Actin und RPS9 getestet, welche ebenfalls sowohl von der Kulturdauer als auch durch verschiedene Medienzusätze reguliert wurden (Anhang Tabelle 20 ). Die 18S-mRNA-Expression dagegen blieb sowohl im Verlauf der Kultur als auch unter verschiedenen Medienzusätzen weitestgehend unbeeinflusst und wurde daher in allen Versuchen als Referenzgen verwendet. Die Verwendung von primären bovinen Hepatozyten, die direkt nach der Dichtegradientenzentrifugation gesammelt wurden, stellte sich als Kalibrator in den Vorgängerversuchen als ungünstig dar, weil die Diskrepanz der Genexpressionen zu den der kultivierten Zellen sehr hoch war. Daher wurden in diesem Versuch die Mittelwerte der Genexpressionen von Tag 1 als Kalibrator verwendet. Die Genexpressionsergebnisse werden im Folgenden als relative Ratio zu diesem Kalibrator angegeben. Dabei entspricht eine mRNA-Expression mit einer Ratio von 1 der relativen mRNA Expression des entsprechenden Gens gemessen für den Kalibrator. In Abbildung 14 ist die relative mRNA-Expression der Zielgene in Abhängigkeit von den verschiedenen Kulturmodellen im Verlauf von 7 Tagen dargestellt. Die Genexpressionen wurden im Folgenden immer zuerst auf Interaktion der Faktoren Kulturdauer und Kulturform untersucht. Danach wurde auf detailliert auf statistische Unterschiede eingegangen.

4.3.3.1 Albumin mRNA-Expression in Abhängigkeit der Kulturform

In Abbildung 14a ist die Albumin mRNA-Expression der Hepatozyten in HMC, KKCd und KKCid in Abhängigkeit der Kulturdauer dargestellt. Sowohl die Kulturdauer als auch die

ERGEBNISSE

Kulturform hatten einen signifikanten Einfluss auf die Albumin mRNA-Expression. Es bestand keine signifikante Interaktion zwischen Kulturdauer zu Kulturform (P > 0,05).

Der signifikante Einfluss der Kulturdauer war lediglich in dem HKCid-Modell sichtbar. Hier stieg die Albumin mRNA-Expression an Tag 2 und Tag 3 im Vergleich zu Tag 1 an (P<0,05).

An Tag 4 sank die Expression dann wieder ab, um bis Tag 7 höchst signifikant anzusteigen.

In der Kulturform HKCd war im Verlauf der Kultur keine signifikante Änderung der Albumin mRNA-Expression messbar. Doch auch in diesem Modell konnte ein mit HKCid vergleichbarer Verlauf der numerischen Albumin mRNA-Expression in Abhängigkeit der Kulturdauer festgestellt werden. Ebenso verhielt es sich in HMC. Hier konnte erst an Tag 7 ein hoch signifikanter Anstieg der Albumin mRNA-Expression festgestellt werden. Der Einfluss des Kulturmodelles auf die Albumin mRNA-Expression zeigte sich vorrangig in dem HKCid-Modell verglichen mit HMC und HKCd. Die numerische Albumin mRNA-Expression in HKCid lag während der gesamten Kulturdauer deutlich über den Albumin mRNA-Expressionen in HKCd und HMC (P<0,1). Lediglich an Tag 2 und Tag 3 war die Albumin mRNA-Expression in HKCid signifikant höher als in HMC und an Tag 2 und Tag 7 auch signifikant höher als in HKCd (Abbildung 14a).

4.3.3.2 HNF4α mRNA-Expression in Abhängigkeit der Kulturform

Die HNF4α mRNA-Expression der Hepatozyten in HMC, KKCd und KKCid in Abhängigkeit der Kulturdauer ist in Abbildung 14b dargestellt. Bei der HNF4α mRNA-Expression hatte die Kulturdauer einen signifikanten Einfluss, während die Kulturformen nur einen schwach signifikanten Einfluss hatten. Auch hier bestand keine signifikante Interaktion zwischen der Kulturdauer und der Kulturform (P>0,05). Es war ein Anstieg der HNF4α mRNA -Expression an Tag 2 und Tag 3, ein deutlicher Abfall an Tag 4 und ein anschließender Wiederanstieg der Expression an Tag 7 zu messen. Dabei war der Anstieg der mRNA-Expression von Tag 1 zu Tag 7 in HKCid schwach signifikant und von Tag 4 auf Tag 7 in HMC signifikant. Die HNFα mRNA-Expressionen unterhalb der verschiedenen Kulturformen unterschieden sich nicht signifikant, obwohl auch hier die numerische HNF4α mRNA-Expression in HKCid höher war als in den anderen Kulturformen (Abbildung 14b).

4.3.3.3 GHR1A-mRNA-Expression in Abhängigkeit der Kulturform

Sowohl die Kulturdauer als auch das Kulturmodell hatten einen signifikanten Einfluss auf die GHR1A mRNA-Expression. Außerdem bestand eine signifikante Interaktion zwischen der Kulturdauer und den Kulturmodellen (Abbildung 14c).

Auch bei Betrachtung der GHR1A Genexpression zeichnete sich ein mit der Albumin- und HNF4α mRNA-Expression vergleichbarer Einfluss der Kulturdauer ab. Signifikanz erlangte dies allerdings lediglich in der Hepatozyten Mono-Kultur. Hier konnte ein hoch signifikanter Anstieg der GHR1A mRNA-Expression von Tag 1 auf Tag 2 verzeichnet werden. An Tag 4 sank die Expression wieder schwach signifikant ab und stieg an Tag 7 erneut höchst signifikant an. Die GHR1A mRNA Expression der Kulturmodelle HKCd und HKCid wurden von der Kulturdauer nicht signifikant beeinflusst. Dementsprechend war die GHR1A mRNA-Expression in HMC konstant signifikant höher als in HKCd und HKCid (Abbildung 14c).

Albumin mRNA Expression

ERGEBNISSE wurden drei verschiedene Kulturmodelle angefertigt, die vergleichend unter denselben Bedingungen über 7 Tage kultiviert wurden. Ko-Kultur von Hepatozyten mit Kupfferzellen in direktem Kontakt zueinander (HKCd); Ko-Ko-Kultur von Hepatozyten mit Kupfferzellen über eine trennende Kollagenschicht in indirektem Kontakt (HKCid); Mono-Kultur von Hepatozyten (HMC). Ein Boxplot mit Whiskers gibt den Median von sechs Proben mit den 25 und 75% Quartilen sowie Minimum und Maximum an. * p < 0,05; ** p< 0,01; *** p< 0,001;

**** p< 0,0001

4.3.4 Zytokinkonzentrationen im Kulturmedium in Abhängigkeit der Kulturform

Um eine Produktion von Zytokinen durch Inflammation zu untersuchen, wurden die Konzentrationen von TNF-α (Tabelle 15) und IL-6 (Tabelle 16) im Kulturmedium an Tag 1,2,3,4, und 7 gemessen.

Tabelle 15: TNF-α Konzentration in ng/ml im Kulturmedium von HKCd, HKCid und HMC in Abhängigkeit der Kulturdauer

Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 4 Tag 7

HKCd 0,04 0,02 0,02 0,03 0,01

< 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01

HKCid 0,04 0,03 0,02 0,01 0,01

< 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01

HMC 0,04 0,02 0,03 0,03 < 0,01

0,02 < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01

< 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01

Messung mithilfe des TNF-α Bovine ELISA Kit von ThermoFisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) mit einem Messbereich von 0.1 bis 30 ng/mL

ERGEBNISSE

Tabelle 16: Il-6 Konzentration in pg/ml im Kulturmedium von HKCd, HKCid und HMC in Abhängigkeit der Kulturdauer

Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 4 Tag 7

HKCd < 78 < 78 < 78 < 78 < 78

< 78 < 78 < 78 < 78 < 78

HKCid < 78 < 78 < 78 < 78 < 78

< 78 < 78 < 78 < 78 < 78

HMC < 78 < 78 < 78 < 78 < 78

< 78 < 78 < 78 < 78 < 78

Messung mithilfe des Bovine IL-6 ELISA Reagent von ThermoFisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) mit einem Messbereich von 78 bis 5000 pg/mL.

Vergleichende Betrachtung verschiedener Entzündungshemmer

Die Auswirkung verschiedener Medien mit unterschiedlichen Entzündungshemmern bzw.

unterschiedlichen Konzentrationen auf morphologische und funktionelle Merkmale boviner Hepatozyten wurde parallel an HKCid und HMC getestet.

4.4.1 Harnstoffkonzentration im Kulturmedium in Abhängigkeit des Entzündungshemmers

Die Harnstoffkonzentration im Kulturmedium wurde durch den verwendeten Entzündungshemmer beeinflusst (P < 0,0001), nicht jedoch durch die Kulturform (P = 0,0840) (Abbildung 15). Dabei war die Harnstoffkonzentration in HKCid unter Einfluss von Dexamethason schwach signifikant höher als unter dem Einfluss von Aspirin und der pharmakologischen Konzentration DHEA. In HMC war die Harnstoffkonzentration unter Einfluss von Dexamethason signifikant höher als unter dem Einfluss von Aspirin und schwach signifikant höher als unter dem Einfluss von Aspirin mit DHEA und DHEA sowohl in pPharmakologischer als auch physiologischer Konzentration (Abbildung 15).

Harnstoff (nmol/ml)

Effekt P-Wert

Kulturdauer < 0,0001

Kulturform 0,3168

Kulturdauer*Kulturform 0,9423

Abbildung 15: Effekt verschiedener Entzündungshemmer auf die Harnstoffkonzentration im Kulturmedium. Die Entzündungshemmer wurden an zwei Kulturmodellen getestet: Ko-Kultur von Hepatozyten mit Kupfferzellen über eine trennende Kollagenschicht in indirektem Kontakt (HKCid); Mono-Kultur von Hepatozyten (HMC). An Tag 4 wurde das Kulturmedium abgenommen und mithilfe des Urea Assay Kit (Abcam, Cambridge, UK) die Harnstoffkonzentration bestimmt. Ein Boxplot mit Whiskers gibt den Median von vier Proben mit den 25 und 75% Quartilen sowie Minimum und Maximum an. * p < 0,05; ** p< 0,01; *** p< 0,001; **** p< 0,0001

ERGEBNISSE

4.4.2 Ergebnisse der mRNA-Expressionsanalyse

Die Hepatozyten wurden durch das Abtragen der zweiten Kollagenschicht von den Kupfferzellen getrennt. Somit war es in dieser Kulturform möglich, auch die Expression Nicht-Hepatozyten-spezifischer Gene zu ermitteln. Als interner Standard für die Zielproteinanalyse diente die 18S mRNA-Expression. Die gemittelten mRNA-Expressionen der Hepatozyten, die ohne Entzündungshemmer inkubiert wurden, dienten als Kalibrator. Die Ergebnisse werden im Folgenden als relative Ratio zu dem Kalibrator angegeben. Dabei entspricht eine mRNA-Expression mit einer Ratio von 1 der relativen mRNA-Expression des entsprechenden Gens gemessen für den Kalibrator. In Abbildung 16 sind die relativen mRNA-Expressionen verschiedener Gene in Abhängigkeit von den verschiedenen Kulturmedien und -formen an Tag 4 dargestellt. Wie zuvor wurden die mRNA-Expressionen immer zuerst auf Interaktion der Faktoren Kulturdauer und Kulturform untersucht. Danach wurde detailliert auf statistische Unterschiede eingegangen.

4.4.2.1 NFκB-Inhibitor mRNA-Expression in Abhängigkeit des Entzündungshemmers

In Abbildung 16a ist die NFκB-Inhibitor mRNA-Expression der Hepatozyten in HMC und HKCid in Abhängigkeit des verwendeten Entzündungshemmers dargestellt. Weder die Entzündungshemmer im Kulturmedium noch die Kulturform hatten einen signifikanten Einfluß auf die NFκB-Inhibitor mRNA-Expression in den Hepatozyten. Auch Interaktionen von Entzündungshemmer und Kulturform konnten nicht festgestellt werden.

4.4.2.2 Vimentin-mRNA-Expression in Abhängigkeit des Entzündungshemmers

Bei der Vimentin mRNA-Expression spielte der eingesetzte Entzündungshemmer eine signifikante Rolle, während die Form des Kulturmodelles keinen signifikanten Einfluss hatte.

Es bestand keine signifikante Interaktion zwischen Entzündungshemmer und Kulturform (Abbildung 16b). Die numerische Vimentin mRNA-Expression war bei beiden Kulturformen unter dem Einfluss von Dexamethason und Hydrocortison niedriger als unter dem Einfluss anderer bzw. keinem Entzündungshemmer. Ein signifikanter Einfluss des Entzündungshemmer war lediglich in der Mono-Kultur darstellbar. Hier konnten sowohl Dexamethason als auch Hydrocortison die Vimentin mRNA-Expression gegenüber der

pharmakologischen Konzentration von DHEA signifikant vermindern. Auch gegenüber der pharmakologischen Konzentration DHEA zusammen mit Aspirin wurde die Vimentin mRNA-Expression von Hydrocortison signifikant und von Dexametahson schwach signifikant vermindert. Der Zusatz von DHEA sowohl in pharmakologischer und physiologischer Konzentration als auch in Kombination mit Aspirin führte zu einer numerischen Erhöhung der Vimentin mRNA-Expression gegenüber den restlichen Zusätzen (P > 0,05) (Abbildung 16b).

4.4.2.3 GHRtot-mRNA-Expression in Abhängigkeit des Entzündungshemmers

Bei der GHRtot mRNA-Expression spielte der eingesetzte Entzündungshemmer eine signifikante Rolle, während die Kulturforml keinen signifikanten Einfluss hatte. Es bestand eine schwach signifikante Interaktion zwischen Entzündungshemmer und Kulturform (Abbildung 16c). In der Ko-Kultur war zu erkennen, dass die numerische GHRtot mRNA-Expression unter dem Einfluss von Dexamethason und Hydrocortison deutlich niedriger ausfiel als unter dem Einfluss keiner oder anderer Entzündungshemmer. In der Mono-Kultur war dieser Effekt der Glukokortikoide nicht zu beobachten. Hier wurde unter dem Einfluss der pharmakologischen Konzentration DHEA zusammen mit Aspirin GHRtot mRNA-Expression schwach signifikant höher exprimiert als in der Ko-Kultur. Dort waren die GHRtot mRNA-Expressionen unter dem Einfluss pharmakologischer Konzentrationen von DHEA zusammen mit Aspirin signifikant höher als unter dem Einfluss von Hydrocortison, Aspirin und der physiologischen Konzentration an DHEA (Abbildung 16c).

4.4.2.4 GHR1A-mRNA-Expression in Abhängigkeit des Entzündungshemmers

Auf die GHR1A mRNA-Expression in den Hepatozyten hatten weder die Entzündungshemmer im Kulturmedium noch das Kulturmodell einen signifikanten Einfluss.

Auch Interaktionen zwischen Entzündungshemmern und Kulturmodell konnten nicht festgestellt werden (Abbildung 16d). In Ko-Kultur war die GHR1A mRNA-Expression unter dem Einfluss sämtlicher Entzündungshemmer gegenüber der Kontrolle ohne Entzündungshemmer niedriger exprimiert(P > 0,05). In der Mono-Kultur dagegen erhöht sich die numerische GHR1A mRNA-Expression unter dem Einfluss von Entzündungshemmern.

ERGEBNISSE

Lediglich unter dem Einfluss von Hydrocortison und der physiologischen Konzentration von DHEA stellt sich die GHR1A-mRNA-Expression numerisch geringer dar (P >

0,05)(Abbildung 16d).

ERGEBNISSE

Abbildung 16: Effekt verschiedener Entzündungshemmer auf die relative mRNA-Expression verschiedener Gene am 4. Tag in Kultur. Die Entzündungshemmer wurden an zwei Kulturmodellen getestet: Ko-Kultur von Hepatozyten mit Kupfferzellen über eine trennende Kollagenschicht in indirektem Kontakt (HKCid); Mono-Kultur von Hepatozyten (HMC). Anschließend wurde die Genexpresion von a) Nuclear factor-kappa-B-Inhibitor- alpha (NFκB-Inhibitor-α), Vimentin, Growth hormon receptor, alle Varianten (GHRtot) und Growth hormone receptor, Variante 1A (GHR1a) mittels RT-qPCR ermittelt. Ein Boxplot mit Whiskers gibt den Median von sechs Proben mit den 25 und 75% Quartilen sowie Minimum und Maximum an.

4.4.3 Zytokinkonzentration im Kulturmedium in Abhängigkeit des Entzündungshemmers

Um eine Produktion von Zytokinen durch Inflammation zu untersuchen, wurden die Konzentrationen von TNF-α (Tabelle 17) und IL-6 (Tabelle 18) im Kulturmedium an Tag

Messung mithilfe des TNF-α Bovine ELISA Kit von ThermoFisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) mit einem Messbereich von 0.1 bis 30 ng/mL; ø = Mittelwert ± Standardabweichung

ERGEBNISSE

Messung mithilfe des Bovine IL-6 ELISA Reagent von ThermoFisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) mit einem Messbereich von 78 bis 5000 pg/mL; ø = Mittelwert ± Standardabweichung

5 DISKUSSION

Um den Geburtszeitpunkt ist die Bindung von GH auf Hepatozytenmembranen beim Rind deutlich verringert. Da das gebundene GH mit der Transkription der GHR 1A mRNA korreliert, wurde eine verminderte GHR 1A Expression mit dem Absinken der IGF-I-Konzentrationen vor der Geburt beim Rind assoziiert. Diese hepatischen GH-Resistenz bei der Milchkuh wird eine bedeutende Rolle bei der peripartalen Stoffwechselregulation zugesprochen (Piechotta et al. 2015). Da allerdings bei in vivo Untersuchungen oft viele schwer kontrollierbare Faktoren auf die GHR1A Expression einwirken, sind in vitro Modelle für die gezielte Untersuchung einzelner Faktoren und Faktorenkombinationen eine sinnvolle Ergänzung zu Tierversuchen. Die Nutzbarkeit von Ratten oder humanen Hepatozytenkulturen für die Forschung metabolischer Stoffwechselerkrankungen der ruminierenden Milchkuh ist aufgrund speziesabhängiger Unterschiede in der Expression metabolischer Enzyme und Stoffwechselwege stark limitiert. Mit dem Ziel, die Funktion und die Einflussfaktoren auf die GHR1A-Expression und IGF-Produktion in der Leber zu untersuchen, wurde in der Arbeitsgruppe von Frau JProf. Schmicke in den vergangenen Jahren ein Isolations- und Kultivierungsprotokoll für primäre bovine Hepatozyten etabliert (Ehrhardt und Schmicke 2016, Witte et al. 2017)). Allerdings wurden in den bisherigen Arbeiten zwei wichtige Fragen außer Acht gelassen. Erstens wurde weder bei Ehrhardt und Schmicke (2016) noch bei Witte et al. (2017) sicher nachgewiesen, dass die Hepatozytenkultur rein war ist und keine hepatischen Makrophagen beinhaltete. Zweitens wurde nicht auf die Frage eingegangen, inwiefern eine Zugabe von Makrophagen einen Einfluss auf bovine Hepatozyten in der Kultur, beziehungsweise auf die GHR1A Expression hatte. Da die Bedeutung der immunregulatorischen Makrophagen gänzlich außer Acht gelassen wurde, war eines der Ziele dieser Arbeit die Etablierung der Isolation von Kupfferzellen aus der bovinen Leber und Ko-Kultivierung mit primären Hepatozyten. In vorherigen Studien von Ehrhardt und Schmicke (2016) und Witte et al. (2017) stellte sich Dexamethason als potenter entzündungshemmender Zusatz des Zellkulturmediums dar. Bei einer Konzentration von 100 nM konnte eine deutliche Verbesserung im Erhalt morphologischer und funktioneller Funktionen, wie den Erhalt von Polarität, Bildung von gallengangsähnlichen Kanälchen und Albuminsynthese, im Gegensatz zu der Kontrolle ohne Entzündungshemmer festgestellt werden. Da Dexamethason in Hepatozytenzellkulturen die Expression von GHR1A supprimiert, sollten des Weiteren

DISKUSSION

alternative Entzündungshemmer auf ihre Effizienz hinsichtlich der Unterdrückung der Dedifferenzierung in HMC und HKCid untersucht werden. Die Beurteilung erfolgte dabei vor allem über die Erfassung von Markern für Stoffwechselfunktion, Entzündungsreaktionen und Dedifferenzierung der Hepatozyten, sowie der Messung der GHR1A-Expression als endokrinologischer Marker.

Isolation von Hepatozyten und Kupfferzellen aus bovinen Lebern

Ehrhardt und Schmicke (2016) etablierten ein Protokoll zur Isolation und zur Kultivierung primärer boviner Hepatozyten aus Schlachthofmaterial. Im Durchschnitt wurden nach diesem Protokoll 60,5 ± 9,6% vitale Zellen gewonnen. Diese Werte wurden nach einer Aufreinigung mittels einer zusätzlichen Dichtegradientenzentrifugation mit Percoll erfasst. Da die Zellausbeute und Vitalitätsrate mit diesem Protokoll im Vergleich zu anderen Arbeitsgruppen (Giantin et al. 2012; Panda et al. 2015) sehr gering ausfiel, wurde das Isolationsverfahren in einer darauffolgenden Studie von Witte et al. (2017) modifiziert.

Obwohl für die eigenen Versuche das von Witte et al. (2017) etablierte Protokoll verwendet wurde, wichen die eigenen Ergebnisse bezüglich Zellausbeute und Viabilität der Hepatozyten aus Schlachthoflebern deutlich von deren Ergebnissen ab. Witte et al. konnten aus Schlachthoflebern mit einer langen warmen Ischämiezeit von etwa 30 min 3.572.324 ± 1.641.535 bovine Hepatozyten / g Leber bei einer Viabilitätsrate von 37,1 ± 9,8% vor der Dichtegradientenzentrifugation mit Percoll isolieren. In der eigenen Studie konnten aus Schlachthoflebern mit einer gleichlangen warmen Ischämiezeit eine höhere Zellausbeute mit höhere Viabilität gewonnen werden ( 9.143.694 ± 1.553.177 bovinen Hepatozyten / g Leber mit einer Viabilität von 57,7 ± 8,3 % (n = 5)). Da die Isolationstechnik nicht geändert wurde, kann die höherer Zellausbeute und Viabilität in der eigenen Studie nicht standardisierten Faktoren im Isolationsprotokoll zugeschrieben werden. Alpini et al. (1994) beschrieben eine ganze Liste an Faktoren, die die Ergebnisse einer Perfusion erheblich beeinflussen können.

Darunter wurde vor allem die Konzentration des Enzyms Kollagenase als möglicher Faktor für Schwankungen in Zellausbeute und Viabilität diskutiert. Eine zu hohe Kollagenaskonzentration führte zu übermäßigen Gewebeverdau mit Schädigung der Hepatozyten, während eine niedrigere Konzentration in schlecht verdautem Lebergewebe mit

einer geringen Zellausbeute, aber einer sehr hohen Viabilität, korrelierte (Alpini et al. 1994;

Gonçalves et al. 2007). Zu Beginn dieser Studie wurde eine neue Charge Kollagenase verwendet. Da die Enzymkonzentration und -aktivität zwischen verschiedenen Chargen sehr stark variiert (Queral et al. 1984) und auch nach Anbruch mit der Zeit stark abnimmt, erscheint dieser Faktor eine sehr plausible Erklärung für die Unterschiede zu der Vorgängerstudie. Damit zusammenhängende Faktoren sind zu einem die Perfusionszeit der Kollagenase und zum anderen die zwischen den verschiedenen Lebern variierende Perfusionsreichweite. Die Perfusionszeit der Kollagenase wurde in dem Protokoll von Witte et al. (2017) nicht standardisiert, sondern nach makroskopischer Beurteilung des Zustands des Lebergewebes beendet. Da es von außen oft schwer ersichtlich wart, wann eine ausreichende Verdauung des Lebergewebes stattgefunden hatte, zudem durch eine ungleichmäßige Perfusion oft auch Teile in der Tiefe des Leberstücks eine stärkere Perfusion erfuhren, ist die Enzymwirkung der Kollagenase ein Faktor, der sehr schwer kontrollierbar und damit starken Varianzen ausgesetzt ist.

Aus Kühen, die in der Klinik für Rinder in Hannover euthanasiert wurden, konnte im Durchschnitt 5 min nach der Euthanasie der Lobus caudatus entnommen werden. Aus diesen Lebern konnten in dieser Studie 17.421.712 ± 16.118.919 bovine Hepatozyten / Gramm Leber mit einer Viabilität von 72,8 ± 16,1 % (n = 7) isoliert werden. Der deutlich höhere Mittelwert der Zellzahl und Viabilität im Vergleich zu Lebern mit langer warmer Ischämiezeit aus Schlachthoflebern war vergleichbar mit den Untersuchungen von Witte et al. (2017). In dieser Arbeit konnte bereits gezeigt werden, dass aus Lebern, die einer kurzen Ischämiezeit ausgesetzt waren, größere Zellzahlen an vitaleren Zellen isoliert werden konnten als aus Lebern, die einer langen Ischämiezeit ausgesetzt waren. In der Studie von Witte et al. (2017) konnten mit einer ebenso langen warmen Ischämiezeit von etwa 5 min 13.674.406 ± 7.441.099 Hepatozyten / g Leber mit einer Vitalitätsrate von 78,2 ± 13,3% isoliert werden.

Verglichen mit diesen Ergebnissen war der Mittelwert der Zellausbeute in der eigenen Studie etwas höher, die Vitalität dagegen geringgradig geringer. Auffallend war aber auch, dass die Standardabweichung vor allem in Bezug auf die Zellausbeute sehr hoch war. Auch hier

Im Dokument Ko-Kultur primärer boviner Hepatozyten und Makrophagen (Seite 85-0)