Glukokortikoide - Ko-Kultur primärer boviner Hepatozyten und Makrophagen

2 LITERATUR

2.4.1 Glukokortikoide

In der Zellkultur sind Glukokortikoide die am häufigsten eingesetzten Entzündungshemmer.

Glukokortikoide sind physiologische Hemmer entzündlicher Reaktionen. Das natürliche Glukokortikoid Cortisol (Hydrocortison) wird in einem zirkadianen Rhythmus in der Nebennierenrinde aus Cholesterol gebildet. Der im Hypothalamus gebildete Corticotropin releasing factor (CRF) fördert im Hypophysenvorderlappen die Ausschüttung von Adrenocortikotropen Hormon (ACTH), welches wiederum die Cortisolbildung in der Zona fasciculata der Nebennierenrinde stimuliert. Die Ausschüttung proinflammatorischer Zytokine im Rahmen eines entzündlichen Geschehens stimuliert die Hypothalamus-Hypophysen-Nebennierenachse und damit eine vermehrte Sekretion von CRH und ACTH (Herman et al.

2016). Dexamethason, welches in der Zellkultur eingesetzt wird, hat eine 30- bis 40-mal stärkere glukokortikoide Potenz als das physiologische Cortisol oder das dementsprechende synthetische Hydrocortison (Karow und Lang-Roth 2018). Der Zusatz von Dexamethason wirkt sich in vitro positiv auf die Synthese von Leberproteinen wie Albumin mRNA aus, deren Konzentration ohne Zusatz von Entzündungshemmern nach einem Tag in Kultur sinkt (Moshage et al. 1985). Da die gemessene Albumin-Konzentrationen zwar im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollen signifikant höhere Werte aufweisen, aber zu keinem Zeitpunkt die Werte von frisch isolierten Zellen übersteigen, ist unklar, ob Dexamethason einen stimulierenden, einen stabilisierenden Effekt oder sogar eine Kombination aus beiden ausübt (Moshage et al. 1985). Wie bereits in Kapitel 2.2.2 erwähnt, hat Dexamethason auch einen positiven Einfluss auf den Erhalt epithelialer Eigenschaften der Hepatozyten in Kultur.

Hepatozyten in Kulturen ohne den Zusatz von Dexamethason dagegen nehmen spindelförmige Gestalt an und gleichzeitig gehen wesentliche enzymatische Aktivitäten und metabolische Funktionen verloren (Guguen-Guillouzo und Guillouzo 2010).

Im Zytoplasma von Lymphozyten und Makrophagen befinden sich Glukokortikoidrezeptoren (GR), die im unligierten Zustand an Hitzeschockproteinrezeptoren gebunden sind. Die Bindung von Glukokortikoiden bewirkt die Dissoziation des Hitzeschockproteins und damit die Aktivierung der GR. Der Kortikoid-Rezeptor-Komplex transloziert vom Zytoplasma in den Zellkern, wo er durch die Bindung an „glucocorticoid responsive elements“ Zielgene entweder exprimiert oder auch supprimiert (Karow und Lang-Roth 1999). Ein Großteil der immunsupprimierenden Wirkungen von Glukokortikoiden wird durch die Hemmung des oben genannten Transkriptionsfaktors NF-κB vermittelt. Glukokortikoide können nach Bindung an Glukokortikoidrezeptoren NF-κB durch direkte Protein-Protein-Wechselwirkung hemmen (Karow und Lang-Roth 1999). Darüber hinaus sind Glukokortikoide in der Lage, die Transkription des IκBα-Gens zu induzieren, was zu einer erhöhten IκBα-Proteinsynthese führt. Wenn NF-κB aus IκBβ durch Stimulation mit TNF-α freigesetzt wird, bindet NF-κB schnell an das durch den Einfluss von Glukokortikoiden synthetisierte IκBα, wodurch die Menge an NF-κB, die an dem Zellkern ankommt, deutlich reduziert wird (Auphan et al. 1995;

Dekruyff et al. 1998; Scheinman et al. 1995). Das hat zur Folge, dass die Synthese zahlreicher proinflammatorischer Proteine, unter anderem die der proinflammatorischen Zytokine (IL-1, IL-2, IL-6), unterdrückt wird. In Ko-Kulturen mit Kupfferzellen wurde selbst eine LPS-induzierte Ausschüttung von TNF-α in der Anwesenheit von 1 µM Dexamethason um 80%

gesenkt, während die IL-6-Konzentration vollständig unterdrückt wurde. Die Ergebnisse von Rose et al. (2017) zeigen, dass Dexamethason hauptsächlich die Konzentrationen an proinflammatorischen Zytokinen, wie IL-6, IL-1α, IL-12, Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor und TNF-α deutlich reduziert, während antiinflammatorische Zytokine, wie IL-10 und IL-4 nur minimal beeinflusst werden. Mozo et al. (2004) wiederum konnten eine erhöhte IL-10-Expression in mit Dexamethason und anderen Steroiden vorbehandelten Monozyten nachweisen. Die Effekte der Glukokortikoide stellen sich dabei dosisabhängig und proportional zu der Steroidpotenz dar (Mozo et al. 2004; Rose et al. 2017).

Durch die Induktion der Synthese des Hemmproteins Lipocortin, das die Phospholipase A2-Synthese inhibiert, die die Verstoffwechselung von Phospholipiden zu Arachidonsäure leitet, greifen Glukokortikoide außerdem in den Arachidonsäurestoffwechsel ein. Da Glukokortikoide somit einen Schritt früher in den Arachidonsäurestoffwechsel eingreifen als NSAIDs, hemmen sie zusätzlich zu der Prostaglandinsynthese auch die Leuktriensynthese.

LITERATUR

25 2.4.2 DHEA

Dehydroepiandrosteron (DHEA) wird als Vorläufer der Sexualsteroide, katalysiert von Cytochrom P 450, über einige Schritte aus Cholesterol metabolisiert (Miller 2002). Den Hauptbildungsort von DHEA stellt die Zona reticularis der Nebennierenrinde dar, die Sekretion erfolgt primär in sulfatierter Form (DHEAS). Um allerdings eine biologische Wirkung entfalten zu können, muss DHEAS zu DHEA umgewandelt werden. Die dafür benötigten Sulfatasen werden in verschiedenen Zellen exprimiert, unter anderem in Monozyten und Makrophagen (Hennebold und Daynes 1994; Ruoff und Daniel 1991). In Hoden und Ovarien wird DHEA dann weiter zu Androgenen und Östrogen metabolisiert (Labrie et al. 2005). Doch nicht nur als Vorläufer der Sexualsteroide spielt DHEA eine grundlegende Rolle. DHEA moduliert die Endothelfunktion, reduziert Entzündungen, verbessert die Insulinsensitivität, den Blutfluss, die zelluläre Immunität, den Knochenstoffwechsel, die sexuelle Funktion, unterstützt die Neuroprotektion und verbessert auch die kognitive Funktion (Traish et al. 2011). Vor allem in der Immunregulation wird DHEA eine Bedeutung beigemessen, wobei die im Serum lösliche Form von DHEA, DHEAS, um einiges weniger wirkungsvoll bzw. funktionslos ist (Padgett und Loria 1998).

Dies unterstreichen Studien, in denen die Mortalität von Mäusen während viraler Infektionen durch die Behandlung mit DHEA um 50 bis 90% reduziert werden konnten (Loria 1992).

Gundlach et al. (2017) konnten im Rahmen einer Studie an der Tierärztlichen Hochschule Hannover bei gesunden Rindern eine im Blut zirkulierende DHEA-Konzentration von 2,5 µg/ml feststellen. Die Konzentration des Vorgängers DHEAS mit 28,8 µg/ml war demgegenüber höher. Bei Tieren, welche sich in einem entzündlichen Prozess befanden, konnte eine signifikante Erhöhung der DHEA-Konzentration festgestellt werden, während die Konzentration von DHEAS gleich blieb, beziehungsweise eher abnahm. Padgett und Loria (1998) wiesen DHEA einen entzündungshemmenden Effekt nach, der dadurch begründet ist, dass Makrophagen in der Sekretion proinflammatorischer Zytokine supprimiert werden. Die Studien von Iwasaki et al. (2004) liefern einige Hinweise darauf, dass dieser Effekt durch eine Hemmung der Transkriptionsfaktoren NF-κB und AP1 vermittelt wird. Dabei war der hemmende Effekt von DHEA auf die NF-κB-abhängige Transkription nach Stimulation mit TNF-α oder IL-1β signifikant stärker als die Hemmung der basalen NF-κB-abhängigen Transkription. Im Gegensatz dazu wird durch aktivierte Glukokortikoidrezeptoren sowohl

basale als auch Zytokin-stimulierte, NF-κB-vermittelte Transkription mittels direkter Protein-zu-Protein-Interaktion gehemmt. Bei einer gleichzeitigen Supplementation von DHEA und Glukokortikoiden in vitro konnten additive Effekte festgestellt werden (Blauer et al. 1991;

Iwasaki et al. 2004; Padgett und Loria 1998). Dies widerspricht einigen in vivo-Studien, die daraufhin deuten, dass DHEA mit der immunsuppressiven Wirkung von Glukokortikoiden, wie Cortisol und Kortikosteron interferieren könnte (Blauer et al. 1991; Daynes und Araneo 1989; Daynes et al. 1990). Die potenzierende Wirkung von DHEA und Glukokortikoiden lässt auf zwei voneinander unabhängige Mechanismen der Entzündungshemmung schließen.

Da zelluläre Effekte von Zytokinen zumindest teilweise über radikale Sauerstoffspezies vermittelt werden und DHEA in der Lage ist, die Bildung freier reaktiver Sauerstoffspezies zu hemmen (Mohan et al. 1993), vermuten Iwasaki et al., dass eher die Kaskade gehemmt wird, durch welche die Zytokine NF-κB aktivieren, und nicht NF-κB selbst. Auch nach eingehender Literaturrecherche konnte keine Arbeit gefunden werden, in der zuvor DHEA als Entzündungsmodulator in einer Hepatozytenzellkultur eingesetzt wurde. Die Untersuchung von DHEA als Entzündungshemmer in der Hepatozytenkultur ist Bestandteil der hier beschriebenen Arbeit.

2.4.3 Acetylsalicylsäure

Acetylsalicylsäure ist ein schmerzstillender, entzündungshemmender, fiebersenkender und thrombozytenaggregationshemmender Wirkstoff. 1897 gelingt Felix Hoffmann, einem Chemiker der Firma Bayer, erstmals die Isolierung von Acetylsalicylsäure in reiner Form.

Von der Synthese bis zur ersten klinischen Anwendung der Acetylsalicylsäure verging lediglich ein Jahr (Kuhnert 2000). Seit Anfang des 20. Jahrhunderts produziert Bayer AG den Wirkstoff unter dem Markennamen Aspirin. Neben dem flächendeckenden Einsatz als Schmerzmittel, Antirheumatikum und zur Fiebersenkung, findet die Acetylsalicylsäure aufgrund ihrer thrombozytenaggregationshemmenden Wirkung niedrigdosiert auch als Sekundär- und Tertiärprophylaxe zur Vorbeugung von Herzinfarkten und Schlaganfällen bei arteriosklerotischen Gefäßveränderungen Verwendung. Du et al. (2016) konnten anhand von Knochenmarkstroma-Zellkulturen zeigen, dass Aspirin in niedrigen Dosen (1µM und 10µM) das Zellwachstum verbessert und die Apoptoserate reduziert, während hohe Dosen (100µM

LITERATUR

und 1000µM) das Zellwachstum hemmen und zu Apoptose führen. Die entzündungshemmende Wirkung von Acetylsalicylsäure entsteht zumindest teilweise durch die Hemmung von Prostaglandinen, deren Biosynthese im entzündeten Gewebe deutlich erhöht ist. Genauer hemmt Acetylsalicylsäure das ubiquitär auftretende, membrangebundene Enzym Cyclooxygenase (COX), welches als Untereinheit der Prostaglandin-Synthase maßgeblich an der Prostaglandinbiosynthese beteiligt ist und in die Isoformen COX-1 und COX-2 unterteilt werden kann (Smith et al. 2000). Durch die Bindung an einen der beiden Monomere des COX-Dimers wird die Prostanoidbildung abgeschaltet, indem die Umsetzung von Arachidonsäure zu PGG2 verhindert wird (Brune 1992). Aus PGG2 entstehen unter anderem die vier wichtigsten bioaktiven Prostaglandine: Prostaglandin E2 (PGE2), Prostacyclin (PGI2), Prostaglandin D2 (PGD2) und Prostaglandin F2α (PGF2α). Wie der Großteil anderer, nicht-steroidaler Entzündungshemmer wirkt Aspirin unselektiv sowohl auf COX-1 wie auch auf COX-2. Bei einer niedrigen Dosierung von Aspirin wird zwar die Prostglandinsynthese gehemmt, aber für die Behandlung entzündlicher Geschehen ist eine deutlich höhere Dosierung notwendig. So hemmt die Behandlung von entzündlichen Lungenepithelzellen mit Aspirin erst in einer Dosierung von 20 µg/ml die Sekretion der proinflammatorischen Zytokine IL-1β und IL-8 (Yoo et al. 2001). Eine Hemmung der Prostglandinsynthese wird jedoch schon bei Konzentrationen von 2 µg/ml erreicht (D'Acquisto et al. 1997). Dies lässt darauf schließen, dass Aspirin auch unabhängig von der Unterbrechung des Arachidonsäurestoffwechsels in das Entzündungsgeschehen eingreift. Der zelluläre Kinasekomplex (IKK), der IκB phosphoryliert und damit dessen Abbau und Translokation von NF-κB induziert, besteht aus zwei Kinasen, IKK-α und IKK-β. Aspirin hemmt spezifisch die IKK-β-Aktivität durch Bindung an diese Kinase. Dadurch wird die ATP-Bindung reduziert und IκB kann nicht mehr von NF-κB translozieren. Somit wirkt Aspirin auch ROS-induzierter NF-kB-Aktivierung, die durch die Phosphorylierung von IkB vermittelt wird, entgegen (Kutuk und Basaga 2003). Diesen Schutz vor oxidativem Stress konnten Podhaisky et al. (1997) bereits an kultivierten Endothelzellen demonstrieren. Eine 24-stündige Inkubation mit Wasserstoffperoxid reduzierte die Lebensfähigkeit der Zellen deutlich. Durch eine Vorinkubation mit Aspirin erreichten sie eine erhöhte Vitalität in konzentrationsabhängiger Weise um bis zu 64% der Kontrolle. Interessanterweise wird die Expression von COX-2, die maßgeblich für die massive Produktion von PGs an

Entzündungsstellen verantwortlich ist, transkriptionell durch NF-κB reguliert (D'Acquisto et al. 1997).

MATERIAL UND METHODEN

3 MATERIAL UND METHODEN

Die Herstellerangaben sämtlicher verwendeter Chemikalien, Verbrauchsmaterialien und Geräte sind dem Anhang (Kapitel 10) zu entnehmen.

Leberzell-Isolation

Die Gewinnung primärer Hepatozyten erfolgte teils aus Lebern vom Schlachthof (Westfleisch SCEmbH, Minden-Lübbecke, Deutschland) und teils aus Lebern von Rindern, die in der Klinik für Rinder der Tierärztlichen Hochschule Hannover aufgrund infauster Prognose euthanasiert wurden. Die Zeit zwischen Tötung über Blutentzug und der Gewebeentnahme am Schlachtband im Fall der Tiere, die im Schlachthof getötet wurden betrug ca. 30 Minuten.

Bei den in der Klinik für Rinder getöteten Tieren betrug die Zeit zwischen der Injektion der Euthanasie mittles Release^® bis zur Entnahme eines Leberteilstückes durch einen Schnitt in der rechten Flanke dagegen nicht länger als 5 min.

Für die Zellisolation wurde ein Leberstück benötigt, welches von allen Seiten außer einer Schnittfläche von der Leberkapsel begrenzt ist. Die Vorarbeiten von Ehrhardt und Schmicke (2016) zeigten, dass sich hierfür am besten ein ca. 5 x 10 cm großes Stück des Processus caudatus eignet, welches ein Gewicht von 35-70g aufweisen sollte. Direkt nach der Entnahme wurden die Leberstücke über auf der Schnittfläche befindliche Gefäßanschnitte zunächst mit 200 ml eisgekühltem, EGTA-haltigem (Tabelle 4) und anschließend mit 250 ml EGTA-freiem Perfusionspuffer (Tabelle 4), welche zuvor aus den in Tabelle 3 aufgeführten Stammlösungen hergestellt wurden, mittels einer Knopfkanüle gespült. Ziel dieser Spülung war, das Lebergewebe von Blut zu befreien und gleichzeitig die Temperatur des Leberstückes von Körpertemperatur zügig auf ca. 4°C herunter zu kühlen, um die Stoffwechselaktivität der Zellen zu minimieren. Nach der Spülung wurden die Leberstücke in einem 250 ml Weithalsgefäß mit ca. 200 ml eisgekühltem, EGTA-freiem Perfusionspuffer auf Eis in das Zellkulturlabor der Rinderklinik der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover verbracht.

Die Isolation der Hepatoyzten fand nach dem verbesserten Protokoll von Witte (et al. 2017) statt, welches durch die zusätzliche Isolation von Kupfferzellen aus derselben Leber in der hier beschriebenen Arbeit ergänzt wurde. Vor Beginn der Perfusion wurde das Gewicht des

Leberstückes bestimmt, um die Kollagenasekonzentration zu berechnen (1 mg Kollagenase/g Lebergewebe). Anschließend wurde das Leberteilstück in 37°C warmen, EGTA-freien Perfusionspuffer gebracht und mit diesem gespült, um eine Re-Erwärmung des Gewebes zu erreichen. Dann wurden vier Knopfkanülen in die Gefäßöffnungen eingeführt, und diese mit Histoacryl-Gewebekleber fixiert, sowie weitere Gefäßanschnitte weitestgehend mit diesem Gewebekleber verschlossen. Anschließend wurde die Leber mit EGTA-haltigem Puffer (Tabelle 4) mittels einer Schlauchpumpe 5 min lang nicht-rezirkulierend mit einer Durchflussrate von 40 ml pro Minute perfundiert (Abbildung 3). Die Pufferlösung stand zuvor in einem 41°C warmen Wasserbad und wurde mindestens eine halbe Stunde vor und während der Perfusion mit 95% O2 und 5% CO2 begast, um die Lösung mit Sauerstoff zu sättigen. Auf die EGTA-haltige Pufferlösung folgte, ebenfalls im nicht-rezirkulierenden System, eine fünfminütige Zwischenspülung mit einem Calciumchlorid-(CaCl2)-haltigen Perfusionspuffer (Tabelle 4). Calcium ist für die enzymatische Wirkung von Kollagenase notwendig. Im nächsten Schritt wurde dem CaCl2-haltigen Perfusionspuffer Kollagenase hinzugefügt, und das Pumpensystem wurde in ein rezirkulierendes System umgebaut. Die Perfusion mit CaCl2-haltigen Perfusionspuffer mit Kollagenase erfolgte in einem Zeitraum zwischen 6-7 min und wurde beendet, wenn das Lebergewebe makroskopisch weich und schwammig erschien. Nach dieser Drei-Schritt-Kollagenaseperfusion wurden die Knopfkanülen entfernt, das perfundierte Leberstück in Stopp-Lösung (William’s E Medium [WEM] mit 20 % fetalem bovinen Serum [FBS]) gelegt und die Leberkapsel mit einem Skalpell eröffnet. Die Zellen wurden vorsichtig manuell aus dem Gewebe herausmassiert und mittels weiterer Stopplösung herausgewaschen.

Anschließend wurde die so entstandene Zellsuspension (Abbildung 3) durch Gaze in einem 50 ml Falconröhrchen filtiert und bei 60 x g für 3 min bei 4°C in einer Kühlzentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wurde vorsichtig in 50ml-Falconröhrchen überführt und für die darauffolgende Kupfferzellgewinnung auf Eis aufbewahrt. Das Zellpellet wurde in gekühltem WEM + 10%-FBS aufgenommen. Es folgte eine Zählung der Zellen in einer Neubauerzählkammer unter dem Lichtmikroskop mit 100-facher Vergrößerung. Dafür wurden 20 µl der Zellsuspension mit 180 µl Trypanblau vermischt. Der Farbstoff diffundierte durch defekte Zellmembranen in das Zellinnere. So erschienen geschädigte Zellen unter dem Mikroskop dunkelblau, während sich Zellen mit einer intakten Zellmembran ungefärbt

MATERIAL UND METHODEN

darstellten. Aus der in der Neubauerzählkammer ermittelten Zellzahl wurde der Gehalt vitaler Zellen pro ml und das Verhältnis lebender zu toter Zellen errechnet.

Abbildung 1: Leberperfusion: Spülung des Leberstückes durch geeignete Gefäßanschnitte (1), Fixation der Knopfkanülen und Vorbereitung des Leberstückes zur Perfusion (2), Apparatur zu Gewebeperfusion (3,4), Leber nach Kollagenaseperfusion (5), Filtern der Zellsuspension durch Gaze (6), Zellsuspension (7).

32 Tabelle 3: Zusammensetzung der Stammlösungen

Stammlösung [g/l] Hersteller

Glucose 4,62 Sigma-Aldrich, St. Louis, USA

KH-Puffer: NaCl 83 Sigma-Aldrich, St. Louis, USA

KCl 1,8 Sigma-Aldrich, St. Louis, USA

KH2PO4 1,6 Applichem, Darmstadt, Deutschland

HEPES 60 Sigma-Aldrich, St. Louis, USA

EGTA 40 Sigma-Aldrich, St. Louis, USA

Ca2Cl 20 Applichem, Darmstadt, Deutschland

Nach Einwaage der Chemikalien in jeweils 1 Liter destilliertes und autoklaviertes H2O wurden die Stammlösungen KH, HEPES und EGTA mit NaOH auf einen pH-Wert von 7,4 eingestellt. Alle Lösungen wurden mithilfe eines 0,2 µm-Bottle-Top-Filter mit PES-Membran (Carl Roth, Karsruhe, Deutschland) steril filtriert und bis zur Verwendung bei 4°C gelagert.

CaCl2 = Calciumchlorid, EGTA = Ethylenglycol-bis(aminoethylether)-N,N,N‘,N‘-tetraacetat, HEPES = Hydroxyethylpiperazin-Ethansulfonsäure, KH= Kaliumhydrid.

Tabelle 4: Perfusionspuffer für die Isolation primärer boviner Hepatozyten und Kupfferzellen.

CaCl2 = Calciumchlorid, EGTA = Ethylenglycol-bis(aminoethylether)-N,N,N‘,N‘-tetraacetat, HEPES = Hydroxyethylpiperazin-Ethansulfonsäure (pH auf 7,4 eingestellt), ITS = Insulin-Transferrin-Selen, KH= Kaliumhydrid, Dexamethason und ITS stammen von Sigma- Aldrich (St. Louis, USA), Aminosäuren und Na-Pyruvat von der Merck KGaA (Darmstadt, Deutschland).

MATERIAL UND METHODEN

3.1.1 Aufreinigung boviner primärer Hepatozyten

Mittels einer anschließenden Dichtegradientenzentrifugation wurden vitale von toten Hepatozyten und anderen Zellen über ihre Dichte separiert (Abbildung 3). Hierfür wurde die Zellsuspension mithilfe der errechneten Zellzahl verdünnt, bis eine Zellzahl von 5-6 Millionen vitaler Zellen pro ml erreicht war. Eine 25%-ige Percoll-Lösung, die nach Berechnung mithilfe der Formel in Abbildung 2 eine Dichte von 1,036 g/ml aufwies, wurde in einem 50 ml Falcon vorgelegt und gut vermischt. Anschließend wurden 5 ml der Zellsuspension vorsichtig auf die Oberfläche aufgetragen. Hierbei sollten sich die Zellsuspension und die Percoll-PBS-Lösung nicht vermischen. Die Falconröhrchen wurden bei 4°C für 8 min mit 1 000 x g zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand mittels einer Pasteurpipette abgenommen und verworfen und das Zellpellet in WEM mit 10 % FBS aufgenommen. Es folgte ein weiterer Zentrifugationsschritt bei 60 x g für 3 min bei 4°C.

Der Überstand wurde erneut verworfen und das Zellpellet wieder in WEM aufgenommen.

Danach wurde erneut die Zellzahl und die Viabilität bestimmt.

Abbildung 2: Formel zur Einstellung der gewünschten Dichte für die Dichtegradientenzentrifugation (Biochrom GmbH, Berlin).

34 3.1.2 Gewinnung boviner Kupfferzellen

Die Kupfferzellen wurden aus derselben Leberzellisolation gewonnen wie die Hepatozyten.

Nach dem zweiten Zentrifugationsschritt wurde der Überstand, welcher größtenteils nicht-parenchymale Zellen enthält, in ein 50 ml Falcon überführt, welches daraufhin bei 300 x g für 5 min bei 4°C zentrifugiert wurde. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet in 10 ml William’s E Medium mit 10% FBS aufgenommen. Mittels einer Zwei-Dichtegradienten-Zentrifugation wurden Fibroblasten und Kupfferzellen von restlichen Hepatozyten und Zellfragmenten getrennt (Smedsrød et al. 1985). Hierfür wurde ein 50 ml Falcon vorbereitet, in dem 10 ml 25%iges Percoll über 10 ml 50%iges Percoll geschichtet wurden. Die Zellsuspension wurde vorsichtig aufgetragen und das Falcon 5 min bei 1350 x g und 4°C zentrifugiert. Zwischen den beiden Schichten befanden sich nach der Zentrifugation Kupfferzellen und Fibroblasten. Die weitere Auftrennung erfolgte über selektive Adhäsion der Kupfferzellen an unbehandeltes Plastik. Dafür wurde die Zellschicht zwischen den Dichtegradienten mit einer Pipette abgenommen, in Medium resuspendiert und nochmals 2 min bei 250 x g und 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde abermals vorsichtig mit der Pasteurpipette abgesaugt und das Sediment auf eine unbehandelte Plastikplatte gegeben. Als Kulturmedium diente WEM mit Zusatz von 10% FBS. Die Platte wurde dann zur Inkubation für 15 min in den Brutschrank bei 37 °C, 95 % Sauerstoff (O2) und 5 % Kohlenstoffdioxid (CO2) gestellt. Nach Ablauf dieser 20 min wurde das Medium zusammen mit nicht-adhärenten Zellen abgesaugt und die dem Plastik anhaftenden Kupfferzellen zweimal mit PBS gespült. Pro Well wurde 1 ml 1:10 Trypsin aufgetragen, welches 3 min bei 37°C inkubierte. Mittels WEM mit 10% FBS wurde die enzymatische Wirkung des Trypsins gestoppt. Die Zellen wurden nun durch Schwenken und zusätzlich mit einem Zellschaber gelöst und anschließend in einem 15 ml Falcon gepoolt. Die Zellen wurden 1 Minute bei 1300 x g zentrifugiert und anschließend der Überstand abgenommen. Das Pellet wurde in einem Volumen von 1 ml WEM aufgenommen und durch Vortexen bei 600 Umdrehungen/min resuspendiert. Es folgte eine Zählung und Beurteilung der Viabilität der Zellen mittels Trypanblau in einer Neubauerzählkammer, wie bereits oben beschrieben.

MATERIAL UND METHODEN

Abbildung 3: Zentrifugationsschritte nach Perfusion. Die durch die Perfusion gewonnene Zellsuspension (1), wird durch einen dreiminütigen Zentrifugationsschritt mit 60 x g in einen NPC-haltigen Überstand (2a) und ein Hepatozyten-haltiges Sediment (2b) unterteilt. Das NPC-Material wird durch eine 5-minütige Zentrifugation bei 300 g pelletiert (3). Dieses Pellet wird auf ein zwei-Dichte-Gradient-Kissen von 25% und 50% Percoll geladen (4). Nach einer fünfminütigen Zentrifugation bei 2300 x g sammeln sich Kupffer- und Endothelzellen zwischen den zwei Dichtegradienten (4a). Diese Schicht wird vorsichtig abgenommen und durch eine Zentrifugation bei 900 x g pelletiert (4b). Das Pellet wird auf unbehandelten Petriglasschalen ausplattiert (4c).

Währenddessen werden die Hepatozyten (2b) ausgezählt und ein 25% Dichtegradient mit 5 ml der mit Hepatozyten angereicherten Suspension (5000-6000 Zellen/ ml) beladen (5). Nach einem 8-minütigen Zentrifugationsschritt bei 1000 x g sammeln sich die aufgereinigten Hepatozyten als Pellet (6) und können daraufhin ausplattiert werden(7).

Kultivierung primärer boviner Hepatozyten

Spätestens einen Tag vor dem Versuch wurden 12-Well Platten mit 1 mg/ml Kollagen beschichtet. Dafür wurden 10 mg lyophilisiertes Kollagen mit 9 ml 0,2%-iger Essigsäure bedeckt und für etwa sechs Stunden zum Lösen bei 4°C in den Kühlschrank gestellt. Das gelöste Kollagen wurde daraufhin ausschließlich auf Eis weiterverarbeitet. Durch die Zugabe von 1 ml Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium mit Phenolrot konnte der pH-Wert der Kollagenlösung bestimmt werden. Mit 1 Molarer Natronlauge wurde dieser anschließend auf 7,4 eingestellt. Um die 12-Well Platten zu beschichten, wurden pro Well 165 µl Kollagen aufgetragen und durch vorsichtiges Schwenken möglichst gleichmäßig auf dem Wellboden verteilt. Die Kulturplatten wurden über Nacht bei 37°C in den Brutschrank gestellt, damit das Kollagen sich verfestigen konnte. Beschichtete, nicht verwendete Platten wurden in

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