Chemikalien
10x PBS Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
Acetylsalicylsäure Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
Ampuwa® Fresenius Kabi, Bad Hombruch; Deutschland
bovines Insulin Sigma-Aldrich, St. Louis, USA CaCl2*H2O AppliChem, Darmstadt, Deutschland
Chlorophorm AppliChem, Darmstadt, Deutschland
Collagen from rat tail tendon Roche, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
Collagenase P Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
Desoxyribonuklease I, AMPD1 Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
Dexamethason Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
DHEA Selleckchem, Houston, USA
DMEM, 10x Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
dNTPs (10 mM) Eurogentec, Seraing, Lüttich, Belgien Percoll®, Dichte 1,116 g/ml Merck, Darmstadt, Deutschland ProLong® Gold antifade reagent Dako, Hamburg, Deutschland
EGTA Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
HOT FIREPol EvaGreen qPCR Supermix Solis BioDyne, Tartu, Estland
Hydrocortison Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
Isopropanol Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland
ITS Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
K2HPO4 AppliChem, Darmstadt, Deutschland
KCl Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
KH2PO4 AppliChem, Darmstadt, Deutschland
ANHANG
131
L-Glutamin Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
MgCl2 (50 mM) ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA MuLV-Reverse Transcriptase (50 U/µl) ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA
NaCl Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
PCR Buffer (10x) ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA Penicillin/ Streptomycin Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
Primer Eurofins Genomics, Ebersberg, Deutschland
Random Hexamers (50 µM) ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA RNase Inhibitor (20 U/µl) ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA TRIzol Reagent® Ambion, ThermoFisher Scientific, Waltham,
Massachusetts, USA
Trypan Blue Solution, 0,4% Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Williams‘ Medium E, ohne Glucose,
W1105-05
Biomol, Hamburg, Deutschland Williams‘ Medium E, P04-29500 PAN-Biotech, Aidenbach, Deutschland
Release® WDT, Garbsen, Deutschland Bottle-Top-Filter mit PES-Membran Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland
CELL STAR Tubes (15 ml, 50 ml) Greiner Bio-One, Kremsmünster, Österreich DNA LoBind Tube (1,5 ml; 2 ml) Eppendorf, Hamburg, Deutschland
Flat Optical 8-Cap Strip Biozym, Hessisch Oldendorf, Deutschland
Gaze, steril WDT, Garbsen, Deutschland
Histoacryl B.Braun Petzold, Melsungen, Deutschland
132
Kanüle mit Spitzenolive WDT, Garbsen, Deutschland
Klemme WDT, Garbsen, Deutschland
Neubauer Zählkammer Marienfeld-Superior, Paul Marienfeld, Lauda Königshofen, Deutschland
PCR TW 8-Tube Stripe 0,1 ml Biozym, Hessisch Oldendorf, Deutschland Pipettenspitzen (2,5 µl, 10 µl, 20 µl,100 µl,
200 µl, 1000 µl, 5000 µl)
Biozym, Hessisch Oldendorf, Deutschland
Pinzette WDT, Garbsen, Deutschland
Silikonschläuche und Verbindungsstücke Landgraf Laborsysteme HLL, Langenhagen, Deutschland
Skalpellklingen WDT, Garbsen, Deutschland
Spritzen (50 ml, 10 ml) WDT, Garbsen, Deutschland
Zellschaber Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland
Kits
IL-6 Bovine Uncoated ELISA Kit, ESS0029 ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA
Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit, L3224 ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA
RNA 6000 Nano Kit Agilent Technologies , Santa Clara, Kalifornien, USA TNF alpha Bovine ELISA Kit, EBTNF ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts,
USA
Urea Assay Kit, ab83362 Abcam, Cambridge, UK
Antikörper
Monoclonal Anti-CK18 antibody Dako, Hamburg, Deutschland Polyclonalclonal Rabbit Anti-Cow Cytokeratin
ANHANG
133 Geräte
2100 Bioanalyzer Agilent Technologies, Santa Clara, Kalifornien, USA
Biofuge Fresco Heraeus, Hanau, Deutschland
Brutschrank Modell MCO-18AIC(UV), Sanyo, Osaka, Japan
Hettich Zentrifuge EBA 20 Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany Hettich Zentrifuge Universal 30RF Andreas Hettich, Tuttlingen, Deutschland Pipetten (2,5 µl, 10 µl, 20 µl,100 µl, 200 µl,
Reax Top Shaker Heidolph, Schwabach, Deutschland
Sterilbank Kojair KR-210 Safety, Kojair Tech Oy,
Vilppula, Finnland
TECAN GENios Pro Tecan Group AG, Männedorf, Schweiz Thermocycler CFX96, C1000 Touch Bio-Rad Labratories, Inc., Hercules,
Kalifornien, USA
Thermomixer ThermoMixer comfort, Eppendorf, Hamburg,
Deutschland
TProfessional Thermocycler Biometra, Göttingen, Deutschland
Homogenisator VDI 12 VWR International, Radnor, Pennsylvania, USA
Wasserbad Thermed 5001, GFL, Burgwedel, Deutschland
Zoom Stereomikroskop SZX7 Olympus Corporation, Tokio, Japan
134 Ergebnisse der LIVE-DEAD®-Färbung
Tabelle 19: Auswertung der LIVE-DEAD®-Färbung. Es wurden pro Kulturform (HMC, HKCd, HKCid) jeweils in 4 Gesichtsfelder die lebenden (grün gefärbten) und toten (rot gefärbten) Hepatozyten ausgezählt.
1 2 3 4 Mittelwert:
HMC: lebend: 109 131 103 71 103,5
tot: 20 25 25 21 22,75
insg.:126,25
HKCd: lebend 30 99 93 98 80
tot 8 35 24 16 20,75
insg.:100,77
HKCid: lebend 99 121 117 84 105,25
tot 23 24 25 13 21,25
insg.:126,5
ANHANG
135 Vergleich von Housekeeper-Genen
Tabelle 20: Vergleich der Genexpression verschiedener Housekeeper
Probe 18S Actin PRS9
Hierfür wurden wahllos Proben aus unterschiedlichen Versuchsgruppen verwendet, um zu beurteilen, ob unterschiedliche Behandlung der Zellen die Genexpression der Housekeeper beeinflusst.
0
136
Mittelwert ± Standardabweichung der Genexpressionen in den Kulturen HKCd, HKCid und HMC in Abhängigkeit der Kulturdauer
rel. Ratio
Tag Albumin HNF 4a GHR1a n
HKCd
1 1,82 ± 0,8802 0,7296 ±0,4193 2,725±1,861 6
2 3,78 ±1,161 0,9352±0,237 10,93±2,276 6
3 7,04 ±2,077 0,9737±0,2095 8,731± 2,51 6
4 0,91 ±0,6078 0,9252±1,36 11,8 ±21,29 6
7 7,99 ±4,355 1,195±0,5561 19,63 ±15,08 6
HKC
1 4,04 ±3,18 0,8379±0,3999 3,583 ±2,762 6
2 12,89±5,866 1,684±0,7078 21,04 7±7,886 6
3 12,43±11,83 1,27±0,5389 10,69 ±5,58 6
4 3,73±2,317 0,9142±0,6353 9,019± 10,11 6
7 16,56±7,22 1,81±0,6137 20,04 ±6,806 6
H
1 2,07±2,095 0,7822 ±0,3571 10,64 ±12,19 6
2 3,99±1,263 1,12 ±0,2532 41,42 ±11,48 6
3 2,79±1,598 0,9238 ±0,3452 33,55 ±16,92 6
4 0,76±0,6135 0,4047 ±0,1307 9,799 ±4,207 6
7 13,79±5,734 1,599 ±0,5108 74,66 ±26,63 6
ANHANG
137
Mittelwert ± Standardabweichung der Harnstoffkonzentration im
Zellkulturüberstand in den Kulturen HKCd, HKCid und HMC in Abhängigkeit der Kulturdauer
Tabelle 21: Mittelwert ± Standardabweichung der Harnstoffkonzentration im Zellkulturüberstand in den Kulturen HKCd, HKCid und HMC in Abhängigkeit der Kulturdauer
Mittelwert ± Standardabweichung Kulturform
Tag HKCd HKCid HMC
1 720,5 ± 196,4 641,2 ± 168,9 671,8 ± 194,3
2 862,7 ± 137,2 775,8 ± 47,7 848,5 ± 255,7
3 1005,0 ± 206,4 891,5 ± 66,9 893,5 ± 53,6
4 939,6 ± 78,8 1002,0 ± 116,5 970,4 ± 28,8
7 1287,0 ± 194,2 1145,0 ± 72,4 1456,0 ± 207,6
138
Mittelwert ± Standardabweichung der Genexpressionen in den Kulturen HKCid und HMC in Abhängigkeit des Entzündungshemmers
Tabelle 22: Mittelwert ± Standardabweichung der Genexpressionen in den Kulturen HKCid und HMC in Abhängigkeit des Entzündungshemmers
Mittelwert ± Standardabweichung
NFkBi Vimentin GHRtot GHR1a
HKCid
kein Entz.hemmer 17,09 ± 3,43 1,02 ± 0,23 1,88 ± 2,10 2,32 ± 2,30 DHEA phys. 11,98 ± 15,95 0,32 ± 0,20 0,48 ± 0,25 0,46 ± 0,35 DHEA pharm. 23,92 ± 35,19 0,15 ± 0,04 0,25 ± 0,23 0,28 ± 0,26 DHEA+Aspirin 9,98 ± 8,07 1,40 ± 0,98 0,93 ± 0,65 1,99 ± 3,81 Aspirin 25,88 ± 9,95 1,74 ± 1,08 1,27 ± 0,99 0,66 ± 0,71 Hydrocortison 17,46 ± 21,50 0,87 ± 0,94 0,96 ± 0,97 1,01 ± 1,25 Dexamethason 17,23 ± 13,64 2,07 ± 2,46 1,19 ± 1,58 0,95 ± 1,50 HMC
kein Entz.hemmer 23,48 ± 15,81 1,31 ± 1,02 1,37 ± 1,28 1,57 ± 1,88 DHEA phys. 23,77 ± 14,12 0,65 ± 0,30 1,83 ± 0,80 3,48 ± 2,83 DHEA pharm. 7,67 ± 12,3 0,27 ± 0,14 0,58 ± 0,78 0,32 ± 0,20 DHEA+Aspirin 41,51 ± 24,65 3,32 ± 2,14 1,85 ± 0,71 1,31 ± 0,71 Aspirin 44,53 ± 27,89 3,05 ± 2,19 3,36 ± 2,06 2,39 ± 2,46 Hydrocortison 25,73 ± 32,66 1,39 ± 1,62 0,69 ± 0,69 1,61 ± 2,50 Dexamethason 12,76 ± 6,942 1,11 ± 0,61 0,62 ± 0,70 0,35 ± 0,29
ANHANG
139
Mittelwert ± Standardabweichung der Harnstoffkonzentration im Zellkulturüberstand in den Kulturen HKCid und HMC in Abhängigkeit des Entzündungshemmers
Tabelle 23: Mittelwert ± Standardabweichung der Harnstoffkonzentration im Zellkulturüberstand in den Kulturen HKCid und HMC in Abhängigkeit des Entzündungshemmers
Mittelwert ± Standardabweichung Kulturform
HKCid HMC
Kein Entzh. 604,0 ± 92,9 591,2 ± 125,1
Dexamethason 820,7 ± 106,9 827,8 ± 30,1
Hydrocortison 746,0 ± 190,1 728,7 ± 116,2
DHEA pharm. 578,1 ± 89,7 571,8 ± 98,7
DHEA + Aspirin 647,3 ± 154,8 547,6 ± 63,4
Aspirin 549,7 ± 58,3 542,8 ± 83,2
DHEA phys. 638,0 ± 120,7 566,6 ± 127,3
140 11 Danksagung
Zuallererst möchte ich meiner Doktormutter JProf. Dr. Marion Schmicke für die Überlassung der Thematik dieser Dissertation danken. Besonderen Dank auch für dein offenes Ohr, deine Geduld und deine schnellen Lösungsvorschläge, wenn es bei der Laborarbeit mal nicht ganz rund gelaufen ist. Danke für die unglaublich schnelle Korrektur meiner Arbeit. Vielen Dank außerdem für dein Vertrauen bei der Befundung und die Weitergabe deines Wissens in dem sehr spannenden Fachgebiet der Endokrinologie.
Dr. Jan-Dirk Häger vom Anatomischen Institut der Tierärztlichen Hochschule Hannover möchte ich ebenfalls ganz herzlich danken, für die riesige Unterstützung und Beratung bei der morphologischen Darstellung der Zellen. Danke, dass du dir unzählige Stunden genommen hast, um mich in die immunhistologische Färbung der Hepatozyten und die Durchführung der mikroskopischen Aufnahmen meiner Zellen einzuweisen. Danke für dein Vertrauen, mir das Labor und das Mikroskop auch an den Wochenenden zu überlassen!
Ein großes Dankeschön geht an Stafanie Witte und Yette Brockelmann, die mich in die Zellkultur und die darauffolgende Probenbearbeitung eingeführt haben. Bei anfänglichen Unsicherheiten wart ihr immer zu Stelle und konntet meine Fragen beantworten. Steffi, vielen Dank für deine ausgiebige Vorarbeit, mit der du die Grundlage für meine Dissertation gelegt hast und dir, Yette, vielen Dank für deine ganzen Pipettierschemata!
Für eine wunderbare Arbeitsatmosphäre und eine gute Zusammenarbeit danke ich dem gesamten Team der Endokrinologie! Die Arbeit mit euch hat immer Spaß gemacht .
Martina Baumgarten danke ich für das Messen der Harnstoff-, IL-6- und TNF-α-Proben!
Obwohl die Zeitplanung in den letzten Wochen etwas chaotisch wurde, warst du immer sehr geduldig mit mir! Angela Jordan will ich für ihre Unterstützung bei der Leberzellkultur danken, vor allem unser Aufenthalt in Dummerstorf wird mir im Gedächnis bleiben! Vielen Dank an Christel Hettel für deine Hilfe, wenn ich im Labor wieder irgendetwas nicht finden konnte und deine Geduld mit meinen nicht enden wollenden Bestellungsaufnahmen. Lina und
ANHANG
141
Elli bedanken sich vor allem bei Sonja Bodenstein für einige zusätzliche Kilos ;-) und wunderbare Streicheleinheiten mittags! Beim Mittagstisch werden sie in Zukunft aber auch ganz bestimmt Angela und Martina vermissen…
Danken will ich außerdem den Mitarbeiterinnen aus dem Geschäftszimmer der Klinik für Rinder für ihre Hilfe bei der Ausstellung von Verträgen, Reisekostenanträgen oder Rechnungen!
Für das Probenmaterial für die anfänglichen Versuche danke ich besonders Herrn Dr.
Dusinski und seinem Team vom Schlachthof Westfleisch Minden-Lübbecke. Vielen Dank, dass die Probeentnahmen immer wieder so unkompliziert abliefen und für Ihr Interesse an unseren Versuchen.
Frau Prof. Dr. Hoedemaker, PhD als Leitung der Klinik für Rinder danke ich für die Bereitstellung der Labore und für die Überlassung von Leberteilen euthanasierter Patienten.
In diesem Zusammenhang will ich mich besonders bei PD Dr. Maike Heppelmann und Dr.
Wolfgang Kehler bedanken, die immer wieder an mich gedacht haben.
Bei meiner Mutter, Thomas und Anne-Kathrin will ich mich für das Blitz-Korrektur-Lesen in der letzten Nacht vor der Abgabe bedanken! Danke, dass ihr das so schnell gemeistert habt, obwohl ihr an meinen Zeitsprüngen fast verzweifelt seid.
Ein riesiger Dank geht an Dennis, der mir während der stressigen Phasen der Laborarbeit und der Abschlussarbeiten den Rücken freigehalten und mich immer unterstützt hat. Danke auch dafür, dass du die Assistenten immer fortwährend an mich errinnert hast! Ohne dich wäre mein Probenumfang wahrscheinlich nur halb so groß gewesen .