Einfluss von Insulin und Östradiol auf die GHR-Expression am Modell
primärer boviner und porziner Hepatozyten
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von
Vera Maria Stiensmeier Salzkotten
Hannover 2021
Anatomisches Institut
Frau Prof. Dr. Marion Schmicke (geb. Piechotta) Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg Tiergesundheitsmanagement
1. Gutachter: Prof. Dr. Christiane Pfarrer, Prof. Dr. Marion Schmicke 2. Gutachter: Prof. Dr. Harald Sieme
Tag der mündlichen Prüfung: 20.05.2021
Die Dissertationsarbeit wurde durch die H. Wilhelm Schaumann Stiftung gefördert.
Alles Wissen und alle Vermehrung unseres Wissens endet nicht mit einem Schlusspunkt, sondern mit einem Fragezeichen.
Hermann Hesse
• V. Stiensmeier, M. Schmicke
o Untersuchung zu endokrinen Einflussfaktoren auf die GHR-Expression am Modell primärer boviner Hepatozyten
o Seminarreihe Buiatrik, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, Klinik für Rinder
o 23.04.2019
• V. Stiensmeier, M. Schmicke
o Untersuchung zu endokrinen Einflussfaktoren auf die GHR-Expression am Modell primärer boviner Hepatozyten
o ReproSymposium, Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg, Naturwissenschaftliche Fakultät III, Institut für Agrar- und Ernährungswissenschaften, Tiergesundheitsmanagement
o 06.08.2019
• V. Stiensmeier, M. Schmicke
o Endokrinologie primärer boviner und porziner Hepatozyten
o Wissenschaftliches Kolloquium, Martin-Luther-Universität Halle- Wittenberg, Naturwissenschaftliche Fakultät III, Institut für Agrar- und Ernährungswissenschaften, Tiergesundheitsmanagement
o 23.07.2020
• V. Stiensmeier, B. Bartling, S. Andres, K. Endriß, M. Schmicke o Ketose und endokrine Regulation im Hepatozyten
o 29. Jahrestagung der Fachgruppe "Innere Medizin und Klinische Labordiagnostik" der DVG, Online-Tagung
o 29.01.2021
• V. Stiensmeier, M. Schmicke
o Bedeutung der GHR-Expression für die Entstehung metabolischer Erkrankungen beim Nutztier: Modell an Hepatozyten
o Wissenschaftliches Kolloquium, Martin-Luther-Universität Halle- Wittenberg, Naturwissenschaftliche Fakultät III, Institut für Agrar- und Ernährungswissenschaften, Tiergesundheitsmanagement
o 25.02.2021
I
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1
2 Literatur 4
2.1 Die somatotrope Achse 4
2.1.1 Wachstumshormon 5
2.1.2 Growth Hormone Receptor 5
2.1.3 IGF-1 15
2.2 Regulation des Growth Hormone Rezeptors 18
2.2.1 Einflussfaktoren auf den GHR innerhalb der somatotrope Achse 18 2.2.2 Regulation der GHR-mRNA-Expression und des GHR-Proteins 20 2.2.3 Entkopplung der somatotropen Achse beim Rind 24
2.2.4 Hepatische GH-Resistenz beim Schwein 26
2.3 Endokrine Einflussfaktoren auf die peripartale Regulation der hepatischen
GHR-mRNA-Expression 29
2.3.1 Insulin 30
2.3.2 17β-Östradiol 32
2.4 Hypothesen 35
3 Material und Methoden 37
3.1 Spendertiere 37
3.2 Isolation primärer porziner und boviner Hepatozyten 38
3.2.1 Stammlösungen und Puffer 39
3.2.2 Entnahme, Spülung und Transport des Lebergewebes 40
3.2.3 Perfusion 41
3.2.4 Percoll®-Dichtegradientenzentrifugation 46
3.3 Kultivierung primärer boviner und porziner Hepatozyten 47
3.3.1 Kollagen 47
3.3.2 Kultivierung primärer boviner und porziner Hepatozyten 47
3.3.3 Gewinnung der Proben 49
3.4 Stimulation der GHR-mRNA-Expression 50
3.5 Auswertung 54
3.5.1 Morphologische Beurteilung der Hepatozyten in Kultur 54 3.5.2 Molekularbiologische Analysen der Zellproben 54
II
3.5.3 Analysen der Mediumproben 62
3.6 Statistische Auswertung 67
4 Ergebnisse 68
4.1 Zellviabilität und Morphologie 68
4.2 Genexpression 75
4.2.1 Bovine Hepatozyten 75
4.2.2 Porzine Hepatozyten 86
4.3 Analysen des Zellkulturüberstands 98
4.3.1 Harnstoff 98
4.3.2 LDHH 102
5 Diskussion 105
5.1 Methodendiskussion 106
5.1.1 Spendertiere 106
5.1.2 Methode 109
5.2 Einfluss von Insulin und Östradiol auf die Genexpression in primären bovinen
und porzinen Hepatozyten 125
5.2.1 Insulin 127
5.2.2 Östradiol 140
5.3 Übersicht tierartlich vergleichender Unterschiede und Ausblick 150
6 Zusammenfassung 152
7 Summary 155
8 Literaturverzeichnis 158
9 Anhang 179
9.1 Abkürzungsverzeichnis 179
9.2 Material 182
9.2.1 Geräte 182
9.2.2 Chemikalien 184
9.2.3 Hormone 186
9.2.4 Verbrauchsmaterial 187
10 Danksagung 190
III
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1. Schematische Darstellung der somatotropen Achse 4 Abbildung 2. Schematische Darstellung eines Growth Hormone Receptor
im aktiven Zustand
6 Abbildung 3. Schematische Darstellung des JAK-STAT-Wegs 9 Abbildung 4. Schematische Darstellung des MAPK-Wegs 10 Abbildung 5. Schematische Darstellung des PI3K-Wegs 11 Abbildung 6. Genexpression des Growth Hormone Receptor (GHR) nach
Edens und Talamantes (1998) modifiziert nach Stiensmeier (2021)
15
Abbildung 7. Schematische Darstellung der Entkopplung der somatotropen Achse
26 Abbildung 8. Schematische Darstellung der peripartalen Veränderungen
der Growth Hormone (GH) und Insulin-like Growth Factor-1 (IGF-1) Konzentrationen im Serum sowie der hepatischen Growth Hormone Receptor (GHR) Expression im Vergleich von Schwein und Rind nach Lucy (2001)
28
Abbildung 9. Schematische Darstellung der Regulation der Growth Hormone Receptor (GHR)-mRNA-Expression in primären bovinen und porzinen Hepatozyten durch Insulin
35
Abbildung 10. Schematische Darstellung der Regulation der Growth Hormone Receptor (GHR)-mRNA-Expression in primären bovinen und porzinen Hepatozyten durch 17β-Östradiol (E2) über den Östradiolrezeptor α (ERα)
36
Abbildung 11. Schematische Darstellung der Isolierung und Kultivierung primärer boviner und porziner Hepatozyten aus Lebergewebe
38
Abbildung 12. Vorbereitung des Lebergewebes für die Perfusion 42 Abbildung 13. Aufbau der Perfusionsapparatur zur Isolation primärer
Hepatozyten aus Lebergewebe
43 Abbildung 14. Dichtegradientenzentrifugation mit Percoll® 46 Abbildung 15. Probengewinnung an Tag 1, 4 und 6 der Kultur 49 Abbildung 16. Schematische Darstellung eines Plattenplans mit 12
Kulturplatten
51 Abbildung 17. Agarosegelelektrophorese von ausgewählten RNA-Proben 56 Abbildung 18. Beispiel einer Schmelzkurve aus der amplifizierten DNA der
Gene 18S rRNA und Albumin
61 Abbildung 19. Berechnung der relativen Genexpression nach der
∆∆Ct-Methode
62
IV
Abbildung 20. Berechnung der Laktatdehydrogenase (LDH)-Aktivität im Zellkulturüberstand
64 Abbildung 21. Berechnung der korrigierten Optische Dichte 66 Abbildung 22. Berechnung der Harnstoffkonzentration im Kulturmedium 66 Abbildung 23. Primäre porzine Hepatozyten unmittelbar nach der
Kultivierung
69 Abbildung 24. Veränderungen der Morphologie primärer boviner und
porziner Hepatozyten im zeitlichen Verlauf der Kultur in der hormonfreien Kontrolle
72
Abbildung 25. Vergleich der Morphologie primärer boviner und porziner Hepatozyten mit und ohne den Zusatz von Insulin in hoher Konzentration in Kombination mit Dexamethason
73
Abbildung 26. Einfluss von bovinem Insulin auf die GHR-total-, GHR-1A-, IGF-1- und IGFBP-2-mRNA-Expression in primären bovinen Hepatozyten der Perfusion Rind 1
79
Abbildung 27. Einfluss von Östradiol auf die GHR-total-, GHR-1A-, IGF-1- und IGFBP-2-mRNA-Expression in primären bovinen Hepatozyten der Perfusion Rind 2
81
Abbildung 28. Einfluss von bovinem Insulin auf die HNF4α-, Albumin- und Vimentin-mRNA-Expression in primären bovinen Hepatozyten der Perfusionen Rind 1 und 2
85
Abbildung 29. Einfluss von porzinem Insulin auf die GHR-total-, GHR-1A-, IGF-1- und IGFBP-2-mRNA-Expression in primären porzinen Hepatozyten der Perfusion Schwein 3
91
Abbildung 30. Einfluss von Östradiol auf die GHR-total-, GHR-1A-, IGF-1- und IGFBP-2-mRNA-Expression in primären porzinen Hepatozyten der Perfusion Schwein 6
93
Abbildung 31. Einfluss von porzinem Insulin auf die HNF4α-, Albumin- und Vimentin mRNA-Expression in primären porzinen Hepatozyten der Perfusionen Schwein 3 und 6
97
Abbildung 32. Harnstoffkonzentration im Zellkulturüberstand primärer boviner und porziner Hepatozyten
101 Abbildung 33. Vergleich der durchschnittlichen Harnstoffkonzentrationen
im Zellkulturüberstand primärer boviner und porziner Hepatozyten
101
Abbildung 34. LDH-Aktivität im Zellkulturüberstand primärer boviner und porciner Hepatozyten
103 Abbildung 35. Vergleich der durchschnittlichen LDH-Aktivität im
Zellkulturüberstand primärer boviner Hepatozyten
104
V
Abbildung 36. Sequenzen des alternativen Exon 1 des Growth Hormone Receptor Variante 1A beim Rind (bGHR-1A) und beim Schwein (pGHR-1A) nach Liu et al. (2000)
121
VI
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1. Einflussfaktoren auf die Expression der Growth Hormone Receptor (GHR)-mRNA in der Leber nach Flores-Morales et al. (2006) modifiziert nach Stiensmeier (2021)
30
Tabelle 2. Übersicht der verwendeten Spendertiere zur Entnahme von Lebergewebe für die Isolation und Kultivierung primärer boviner und porziner Hepatozyten
37
Tabelle 3. Zusammensetzung der Stammlösungen für die Spül-, Transport- und Perfusionspuffer
39 Tabelle 4. Zusammensetzung der Spül-, Transport- und
Perfusionspuffer
40 Tabelle 5. Berechnung der Viabilität und Zellzahl der Zellsuspension
nach Auszählung mittels Neubauer Zählkammer und Trypanblau-Färbung
45
Tabelle 6. Zusammensetzung des Adhäsionsmediums 48 Tabelle 7. Zusammensetzung des Kulturmediums 50 Tabelle 8. Die Hormone bovines respektive porzines Insulin und
17β-Östradiol wurden in konstant hoher Konzentration (INVARIANT) oder variierender Konzentration (VARIANT) zum Kulturmedium hinzugefügt
53
Tabelle 9. Zusammensetzung des RNA-Mix für die Agarose- Gelelektrophorese
55 Tabelle 10. Zusammensetzung des Mastermix A für die cDNA-Synthese 57 Tabelle 11. Zusammensetzung des Mastermix B für die cDNA-Synthese 57 Tabelle 12. Informationen zu den verwendeten Primern für die
Genexpressionsanalyse in primären bovinen und porzinen Hepatozyten
58
Tabelle 13. Pipettierschema für die qRT-PCR Reaktionsmixe 59 Tabelle 14. Temperaturprotokoll für die qRT-PCR 60 Tabelle 15. Pipettierschema zur Erstellung einer Standardkurve im
LDH-Assay
63 Tabelle 16. Zusammensetzung des Mastermix für den
Laktatdehydrogenase-Assay
63 Tabelle 17. Pipettierschema zur Erstellung einer Standardkurve für den
Harnstoff-Assay
65 Tabelle 18. Zusammensetzung des Mastermix für den Harnstoff-Assay 65 Tabelle 19. Übersicht der zur Auswertung herangezogenen Perfusionen
zur Gewinnung von primären bovinen und porzinen Hepatozyten
68
1
1 Einleitung
Die somatotrope Achse ist ein endokrines System, das unter anderem über komplexe Adaptationsmechanismen den Stoffwechsel moduliert (Etherton & Bauman, 1998). Bei der Milchkuh, aber auch bei Sauen, stellt der peripartale Zeitraum, bedingt durch das finale Wachstum des Fetus und die einsetzende Laktation, sehr hohe metabolische Anforderungen an den Organismus. Die notwendige peripartale metabolische Anpassung wird unter anderem über endokrine Adaptationsmechanismen innerhalb der somatotropen Achse vermittelt (Le Roith et al., 2001; Renaville et al., 2002).
Hierbei ist der Wachstumshormonrezeptor (Growth Hormone Receptor, GHR) ein zentrales Stellglied der ganzen endokrinen Achse. Zum einen vermittelt Wachstumshormon (Growth Hormone, GH) seine hepatische Wirkung über diesen Rezeptor. Zum anderen kommt es in katabolen Stoffwechselsituationen zu einer spezifischen hepatischen GH-Resistenz, die mit der deutlichen Verminderung der mRNA-Expression des GHR einhergeht. Infolgedessen wird weniger Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor 1 (Insulin-like Growth Factor-1, IGF-1) aus der Leber freigesetzt. Die IGF-1-Serumkonzentrationen sinken und der negative Feedbackmechanismus auf die Hypophyse wird vermindert, sodass die hypophysäre GH-Sekretion steigt (Le Roith et al., 2001).
Dieses Phänomen wird bei der Milchkuh als „Entkopplung der somatotropen Achse“
bezeichnet. Die erhöhten GH-Serumkonzentrationen führen zu einer Modulation der Nährstoffverteilung im Organismus und vermitteln darüber die peripartale metabolische Adaptation (Le Roith et al., 2001; Radcliff et al., 2003b). Eine Dysadaptation kann bei Milchkühen zu postpartalen Produktionserkrankungen führen, unter denen insbesondere die Ketose und das Lipomobilisationssyndrom von hoher Bedeutung sind (Esposito et al., 2014). Daher ist ein vertieftes physiologisches Verständnis der endokrinen Regulation der hepatischen GHR-mRNA-Expression wichtig, um entsprechende Prophylaxemaßnahmen durchführen zu können oder auch züchterisch einzugreifen.
2
Lucy (2008) beschreibt ein ähnliches Phänomen beim Schwein, das jedoch nicht unmittelbar peripartal, sondern erst im Verlauf der Laktation auftritt. Im Gegensatz zur Milchkuh ist die hepatische GH-Resistenz beim Schwein nicht physiologisch und mit einer pathologischen negativen Energiebilanz assoziiert.
Bislang ist allerdings unklar, welcher Faktor bzw. welche Faktoren die peripartale Verminderung der mRNA-Expression des hepatischen GHR bei Rind und Schwein vermitteln. Aus der Literatur ist bekannt, dass unter anderem Insulin und Östradiol an der Regulation der GHR-mRNA-Expression beteiligt sind. Insulin führt in vivo und in vitro sowohl beim Rind als auch beim Schwein zu einer Hochregulation der GHR-mRNA-Expression in der Leber (Brameld et al., 1995; Butler et al., 2003; Rhoads et al., 2004; Witte et al., 2019). Ebenso führt auch Östradiol in vivo zu einem Anstieg der GHR-mRNA-Expression in der Leber beim Rind (Çolak et al., 2011; Mense et al., 2015), während Ergebnisse aus in vitro Studien an murinen Hepatozyten widersprüchlich sind und keinen Einfluss von Östradiol auf die GHR-mRNA- Expression bestätigen konnten (Contreras & Talamantes, 1999). Bei Ratten sind in vivo zudem Unterschiede zwischen Kurz- und Langzeiteffekten von Östradiol bekannt. Östradiol vermittelt in einem akuten Effekt den Anstieg der IGF-1-mRNA- Expression in der Leber, während eine chronische Applikation von Östradiol über 10 Tage zu einer deutlichen Suppression der IGF-1-mRNA-Expression führt (Murphy &
Friesen, 1988).
In der vorliegenden Dissertation wurde erstmals der Einfluss von Insulin und Östradiol auf die Regulation der GHR-mRNA-Expression in primären bovinen und porzinen Hepatozyten untersucht. Für die Studie wurde ein etabliertes in vitro Kultursystem für primäre bovine Hepatozyten verwendet (Witte et al., 2019) und im Rahmen dieser Arbeit ein entsprechendes Verfahren für porzine Hepatozyten etabliert. Hierbei wurde erstmals insbesondere darauf geachtet, dass die entsprechenden Hormone in möglichst physiologischen Konzentrationen und auch in einem physiologischen Verlauf der Kultur zugesetzt wurden. Da es in vivo sowohl beim Rind als auch bei der Sau zu einem Absinken der Insulinkonzentration (Le Cozler et al., 1999; Piechotta et al., 2014) und einem Anstieg der Östradiolkonzentrationen (Kedves, 2016; Österlundh et al., 1998; Taverne et al., 1979) im Serum kommt, wurden im Rahmen der
3
vorliegenden Dissertation folgende Hypothesen an bovinen und porzinen Hepatozyten geprüft: 1) Insulin führt in über die Zeit hinweg sinkenden Konzentrationen zu einer Verminderung der GHR-mRNA-Expression in Hepatozyten, 2) Östradiol führt in über die Zeit steigenden Konzentrationen zu einer Verminderung der GHR-mRNA- Expression in Hepatozyten, 3) Der Zusatz von supraphysiologischen Insulinkonzentrationen und Dexamethason führt ebenfalls zu einer Verminderung der GHR-mRNA-Expression bei Rind und Schwein und 4) Es bestehen Unterschiede bezüglich der Regulation durch Insulin und Östradiol zwischen porzinen und bovinen Hepatozyten.
4
2 Literatur
2.1 Die somatotrope Achse
Die somatotrope Achse ist ein endokrines System und besteht aus GH und IGF-1 sowie den jeweiligen Bindungsproteinen und Rezeptoren. GH wird aus der Hypophyse freigesetzt und vermittelt seine Wirkung entweder direkt über den GHR oder indirekt über die Freisetzung von IGF-1 aus der Leber, das über den IGF-1 Rezeptor (IGF-1R) am Zielgewebe wirkt. Es besteht ein negativer Feedbackmechanismus durch IGF-1 auf die GH-Freisetzung aus der Hypophyse (Abbildung 1) (Le Roith et al., 2001;
Renaville et al., 2002).
Im Folgenden werden die einzelnen Komponenten der somatotropen Achse genauer dargestellt. Wenn möglich, wird dabei spezifisch Bezug auf tierartliche Unterschiede oder Gemeinsamkeiten zwischen Rind und Schwein genommen.
Abbildung 1. Schematische Darstellung der somatotropen Achse. Growth Hormone (GH) wird aus der Hypophyse freigesetzt und vermittelt seine Wirkung entweder direkt über den Growth Hormone Receptor (GHR) oder indirekt über die Freisetzung von Insulin-like Growth Factor-1 (IGF-1) aus der Leber, das über den IGF-1 Rezeptor (IGF-1R) am Zielgewebe wirkt. Es besteht ein negativer Feedbackmechanismus durch IGF-1 auf die GH-Freisetzung aus der Hypophyse.
5 2.1.1 Wachstumshormon
GH wird auch als somatotropes Hormon oder Somatotropin bezeichnet. Es wird in der Adenohypophyse synthetisiert und in Sekretionsgranula gespeichert. Die Sekretion von GH erfolgt pulsatil und in einem zirkadianen Rhythmus im Rahmen eines neuroendokrinen Regelkreises des hypothalamisch-hypophysären Systems. Dabei regulieren die hypothalamischen Hormone Growth Hormone Releasing Hormone (GHRH) und Growth Hormone Inhibiting Hormone (GHIH) die GH-Freisetzung positiv respektive negativ. GHRH und GHIH werden durch periphere Signale moduliert, unter denen beispielsweise auch Östradiol als endokriner Einflussfaktor eine Rolle spielt (Le Roith et al., 2001).
Im Blut wird GH spezifisch und reversibel an Growth Hormone Binding Protein (GHBP) gebunden, wodurch die Halbwertszeit und Bioverfügbarkeit des GH moduliert wird (Baumann et al., 1986). Strukturell stellt GHBP die extrazelluläre Domäne des GHR dar, die speziesspezifisch durch enzymatische Abspaltung vom GHR oder durch alternatives Spleißen der GHR-mRNA gebildet werden (Leung et al., 1987;
Schwartzbauer & Menon, 1998). Beim Rind und Schwein entstehen die GHBP durch enzymatische Abspaltung der extrazellulären Domäne des GHR, wobei beispielsweise bei der Ratte alternatives Spleißen der GHR-mRNA zur GHBP-Bildung führt (Baumbach et al., 1989; Bingham et al., 1994; Devolder et al., 1993).
Die physiologische Wirkung von GH auf den Organismus ist vielfältig. Namensgebend vermittelt GH das postnatale somatische Längenwachstum, darüber hinaus moduliert GH auch den Stoffwechsel und das Immunsystem. In der Leber stimuliert GH die Glukoneogenese und Proteinsynthese und vermittelt im Rahmen der somatotropen Achse die Freisetzung von IGF-1 (Kapitel 2.1.3) (Le Roith et al., 2001).
2.1.2 Growth Hormone Receptor
GH vermittelt seine Wirkung im Organismus entweder direkt über seinen Rezeptor am Zielgewebe oder indirekt über die Bildung von IGF-1 aus der Leber und anderen Organen (Abbildung 1) (Le Roith et al., 2001).
6
Der GHR wird in fast allen Geweben gebildet, allerdings mit höchster Konzentration in der Leber exprimiert (Mathews et al., 1989). Die komplexen Regulationsmechanismen der GHR-Expression werden in Kapitel 2.2 und mit Fokus auf Insulin und Östradiol, deren Einfluss auf die GHR-mRNA-Expression in dieser Dissertation untersucht wird, in Kapitel 2.3 näher erläutert.
Der GHR besteht aus zwei GHR-Molekülen. Diese sind transmembrane Proteine mit einer extrazellulären Domäne, welche die GH-Bindungsstelle enthält, einer transmembranen Domäne und einer intrazellulären Domäne, welche die intrazelluläre GH-Signaltransduktion vermittelt. GH ist der einzige natürliche Ligand des GHR (Abbildung 2) (Le Roith et al., 2001). Der GHR gehört zu den Klasse-I- Zytokinrezeptoren. Diese aktivieren infolge der Bindung des Liganden verschiedene intrazelluläre Signaltransduktionskaskaden, die zur Expression regulatorischer Proteine führen. Als Rezeptor ohne intrinsische Kinaseaktivität ist der GHR mit einer zytoplasmatischen Tyrosinkinase, der Januskinase (JAK), assoziiert und bildet mit dieser einen GHR-JAK-Komplex (Abbildung 2). GH aktiviert hauptsächlich die JAK2, kann aber auch JAK1 und JAK3 aktivieren (Carter-Su et al., 1996). In Abwesenheit des Liganden GH wird die JAK2 durch eine Pseudokinasedomäne inaktiviert (Saharinen et al., 2000).
Abbildung 2. Schematische Darstellung eines Growth Hormone Receptor (GHR) im aktiven Zustand. Durch die Bindung von Growth Hormone (GH) an den GHR kommt es zur Dimerisierung von zwei Rezeptormolekülen und Aktivierung des Rezeptors mittels Phosphorylierung (P) durch die rezeptorassoziierte Januskinase 2 (JAK2).
7 2.1.2.1 Signaltransduktion des GHR
Im Folgenden wird zur vollständigen Darstellung des GHR die intrazelluläre GH-Signaltransduktion erläutert. Diese ist allerdings nicht Bestandteil der Untersuchungen im Rahmen dieser Dissertation, da der Fokus zunächst auf der Regulation der GHR-mRNA-Expression durch Insulin und Östradiol liegt.
Die Aktivierung des GHR und die nachfolgende Stimulation der intrazellulären Signaltransduktion wird durch die Bindung von GH an den GHR initiiert. Ein GH-Molekül bindet dabei über seine zwei Bindungsstellen an die extrazellulären Domänen von zwei GHR-Molekülen und vermittelt infolgedessen die Dimerisierung dieser beiden GHR-Moleküle zu einem aktiven Rezeptor (Abbildung 2) (Carter-Su et al., 1996; Zhu et al., 2001). Durch die Dimerisierung des GHR wird der JAK-GHR-Komplex stabilisiert und die Konformation der JAK2 modifiziert, wodurch eine Transphosphorylierung der JAK2 erfolgt. Diese Aktivierung der JAK2 stellt das initiale Signal für die GH-Signaltransduktion dar. Nachfolgend phosphoryliert die JAK2 die intrazelluläre Domäne des GHR, was auch als Autophosphorylierung bezeichnet wird und zur Aktivierung der GHR führt. Infolgedessen entstehen an der intrazellulären Domäne des aktivierten GHR Bindungsstellen für verschiedene Signalmoleküle, die eine Src-homology (SH2)-Domäne oder Phosphotyrosin-Bindungsstelle aufweisen (Zhu et al., 2001).
Die intrazelluläre GH-Signaltransduktion wird über Multiprotein-Signal-Komplexe vermittelt, die aus verschiedenen Enzymen und Adaptermolekülen bestehen. Diese Adaptermoleküle vermitteln im Rahmen der unterschiedlichen Signaltransduktionskaskaden Protein-Protein-Kontakte, haben aber selbst keine intrinsische Aktivität. Zu diesen Signalproteinen gehören unter anderem Src homology 2/alpha collagen-related (SHC) und das Insulin-Rezeptor-Substrat (IRS) (Zhu et al., 2001).
Für die intrazelluläre Signaltransduktion von GH sind drei Hauptwege bekannt: Signal Transducer and Activator of Transcription (STAT), Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) und Phosphatidylinositol 3`-Kinase (PI3K). Diese werden im Folgenden detailliert dargestellt.
8
Zusätzlich zur GH-Wirkung über diese klassischen intrazellulären Signaltransduktionswege wurde bei porzinen Hepatozyten eine Translokation des GH-GHR-Komplexes in den Zellkern beschrieben. Die spezifische Funktion ist bisher jedoch ungeklärt (Hainan et al., 2018a; Hainan et al., 2018b).
2.1.2.1.1 Signal Transducer and Activator of Transcription
STAT-Moleküle sind Signaltransduktionsproteine, die als Transkriptionsfaktoren die Expression von Zielgenen beeinflussen. Zellbiologisch vermitteln STATs unter anderem Proliferation, Differenzierung und Apoptose von Zellen (Carter-Su et al., 1996).
Die STAT-Proteine binden mit ihrer SH2-Domäne an die intrazelluläre Domäne des GHR und werden durch die JAK2 phosphoryliert und aktiviert. Anschließend dissoziieren sie vom Rezeptor. Im Zytosol dimerisieren zwei aktivierte STAT-Moleküle über die SH2-Domäne und translozieren als Homo- oder Heterodimer in den Zellkern.
Durch eine Bindung an Promotoren und entsprechende Response-Elemente der DNA-Sequenzen stimulieren die STAT-Proteine die Transkription der Zielgene (Abbildung 3) (Herrington et al., 2000; Le Roith et al., 2001; Zhu et al., 2001).
Zu den durch GH aktivierten STAT-Proteinen gehören STAT1, STAT3 und STAT5, wobei die GH-Wirkung hauptsächlich von STAT5a und STAT5b vermittelt wird (Zhu et al., 2001). Im Gegensatz zu STAT5 können STAT1 und STAT3 auch unabhängig von der JAK2 aktiviert werden (Herrington et al., 2000).
Die Beendigung der GH-Signalwirkung über den JAK-STAT-Weg wird über Suppressors Of Cytokine Signalling (SOCS) vermittelt. GH induziert im Rahmen eines negativen Feedbackmechanismus die Expression von SOCS-1, SOCS-2, SOCS-3 und Cytokine-Inducable SH2-containing Protein (CIS), die mit der JAK2 interagieren und deren Tyrosinkinaseaktivität inhibieren (Adams et al., 1998; Birzniece et al., 2009;
Davey et al., 1999; Herrington et al., 2000). Über SOCS-Proteine gibt es auch durch andere Hormone induzierte Feedbackmechanismen, wie zum Beispiel hinsichtlich der Wirkung von Östradiol auf die GH-Signaltransduktion (Kapitel 2.3.2) (Leung et al., 2003).
9
Abbildung 3. Schematische Darstellung des JAK-STAT-Wegs. Der Growth Hormone Receptor (GHR) wird durch die Bindung von Growth Hormone (GH) aktiviert. Signal Transducer and Activator of Transcription (STAT)-Proteine werden durch die Januskinase 2 (JAK2) mittels Phosphorylierung (P) aktiviert. Zwei STAT-Proteine translozieren als Dimer in den Zellkern und beeinflussen dort als Transkriptionsfaktor die Expression von Zielgenen.
2.1.2.1.2 Mitogen Activated Protein Kinase
Der MAPK-Weg stellt einen komplexen Signaltransduktionsweg dar, der unter anderem Zellwachstum und die Differenzierung der Zelle reguliert (Carter-Su et al., 1996).
Die Signaltransduktion wird durch das Adapterprotein SHC initiiert. Dieses assoziiert über seine SH2-Domäne mit dem GHR-JAK-Komplex und wird anschließend durch die JAK2 phosphoryliert. Daraufhin wird ein Adapterproteinkomplex aus Growth Factor Receptor-Bound Protein 2 (Grb2) und Son Of Sevenless (SOS) rekrutiert, der das G-Protein Ras aktiviert und darüber eine dreistufige Phosphorylierungskaskade induziert: Ras aktiviert die MAPK-Kinase-Kinase Raf, die nachfolgend die MAPK- Kinase MEK aktiviert, die ihrerseits die MAPK ERK aktiviert. Die MAPK ist eine
10
Serin/Threonin-Kinase und phosphoryliert Transkriptionsfaktoren, die anschließend in den Zellkern translozieren und an Promotoren von Genen binden (Abbildung 4). Diese Signaltransduktionskaskade wird auch als „Ras-Raf-Mek-Erk-Weg“ bezeichnet (Abbildung 4) (Carter-Su et al., 1996; Zhu et al., 2001).
Abbildung 4. Schematische Darstellung des MAPK-Wegs. Der Growth Hormone Receptor (GHR) wird durch die Bindung von Growth Hormone (GH) aktiviert. Der Signalweg über die Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) wird über das Adapterprotein Src homology 2/alpha collagen-related (SHC) initiiert, das über den Adapterproteinkomplex aus Growth factor receptor-bound protein 2 (Grb2) und Son Of Sevenless (SOS) und das G-Protein Ras eine dreistufige Phosphorylierungskaskade der Kinasen Raf, MEK und ERK aktiviert.
2.1.2.1.3 Phosphatidylinositol 3`-Kinase
Die PI3K ist ein Enzym, das über seinen Signaltransduktionsweg Zellproliferation, Organisation des Zytoskeletts und den Zellmetabolismus reguliert.
Die Aktivierung der PI3K erfolgt über das Adaptermolekül IRS. Dieses wird zunächst durch JAK2 oder die JAK2-abhängige Focal Adhesion Kinase (FAK) phosphoryliert,
11
worauf IRS Bindungsstellen für Proteine mit SH2-Domäne bildet und so verschiedene Enzyme und Adapterproteine binden kann. GH stimuliert zelltypspezifisch die Bindung von IRS an die 85-kdA (p85)-Untereinheit der PI3K. Darüber hinaus ist auch eine IRS-unabhängige Aktivierung von PI3K möglich, indem die p85-Untereinheit direkt an den GHR bindet (Zhu et al., 2001).
Die PI3K vermittelt ihre Wirkung durch weitere nachgeschaltete Signaltransduktionswege. PI3K phosphoryliert Membranlipide und überführt Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat in Phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphat.
Dieses bindet und aktiviert die Serin/Threonin-Kinase Akt, die auch als Proteinkinase B bezeichnet wird. Akt reguliert über die Aktivierung oder Inhibierung weiterer Substrate den Zellmetabolismus (Abbildung 5) (Zhu et al., 2001).
Abbildung 5. Schematische Darstellung des PI3K-Wegs. Der Growth Hormone Receptor (GHR) wird durch die Bindung von Growth Hormone (GH) aktiviert. Die 85-kdA (p85)-Untereinheit der Phosphatidylinositol 3´-Kinase (PI3K) wird über das Adapterprotein Insulinrezeptorsubstrat (IRS) aktiviert und vermittelt über Phosphatidylinositol-4,5-biphosphat und Phosphatidylinositol-3,4,5-triphosphat (PIP) und die Serin/Threonin-Kinase Akt ihre Wirkung auf den Zellmetabolismus.
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Zusammenfassend ist festzuhalten, dass infolge der Bindung von GH an den GHR komplexe intrazelluläre Signaltransduktionskaskaden initiiert werden und es innerhalb dieser durch diverse Feedbackmechanismen zu einer Modulation der Signaltransduktion kommen kann. Eine Modulation der GH-Signalwirkung könnte auch im Rahmen der metabolischen Adaptation im peripartalen Zeitraum stattfinden. Da aus den Daten verschiedener in vivo Studien deutlich hervorgeht, dass peripartal in jedem Fall die mRNA-Expression des GHR vermindert ist, soll in der hier beschriebenen Arbeit zunächst die Genexpression des GHR im Hinblick auf endokrine Regulationsmechanismen untersucht werden. Im Folgenden wird daher die Modulation der GHR-mRNA-Expression genauer beschrieben.
2.1.2.2 Genexpression des GHR
Bei der Genexpression des GHR kommt es zur Entstehung verschiedener Isoformen des Rezeptorproteins, die während der Transkription durch Prozessierung der Prä-mRNA durch sogenanntes alternatives Spleißen des Exon 1 des GHR-Gens vermittelt wird (Edens & Talamantes, 1998). Beim Schwein sind die Isoformen GHR-1A und GHR-1B (Liu et al., 2000) und beim Rind die Isoformen GHR-1A, GHR-1B und GHR-1C bekannt (Jiang et al., 1999). Durch die Expression unterschiedlicher Transkripte kann der GHR gewebespezifisch reguliert werden. Die Isoform GHR-1A wird sowohl beim Rind als auch beim Schwein gewebespezifisch in der Leber exprimiert (Liu et al., 2000; Lucy et al., 2001). Zwischen dem porzinen und bovinen GHR-1A besteht eine Homologie von 83,8 % (Liu et al., 2000).
Die Genexpression des GHR setzt sich aus mehreren Teilschritten zusammen und beschreibt die Umsetzung der genetischen Information aus der DNA in ein GHR-Protein. Im ersten Schritt entsteht durch die Transkription der DNA die Prä-mRNA, die aus Introns und Exons besteht. Bei der weiteren als Spleißen bezeichneten Prozessierung werden die Introns, die den kodierenden Bereich unterbrechen, entfernt und die Exons miteinander verknüpft. Dadurch entsteht die reife mRNA, die als Matrize für die Translation des Proteins dient (Abbildung 6) (Berg et al., 2013).
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Abhängig von biologischen Signalen kann die Prä-mRNA im Rahmen des alternativen Spleißens unterschiedlich zusammengesetzt werden (Berg et al., 2013). Dabei wird erst während des Spleißvorgangs festgelegt, welche Genabschnitte Introns respektive Exons sind. Das alternative Spleißen des GHR wird durch die Promotoren 1-3 (P1 bis P3) vermittelt, die das jeweils alternative Exon 1 an das Exon 2 spleißen (Abbildung 6, Kasten). Dabei führt P1 zur Expression der GHR-1A-mRNA, P2 zur Expression der GHR-1B-mRNA und P3 zur Expression der GHR-1C-mRNA. P1 ist gewebespezifisch nur in der Leber aktiv, daher ist auch das Transkript GHR-1A leberspezifisch (Edens
& Talamantes, 1998; Jiang et al., 1999; Liu et al., 2000; Lucy et al., 1998).
Dennoch entstehen aus den verschiedenen GHR-mRNA-Transkripten identische GHR-Proteine, da sich das alternative Exon 1 außerhalb des Open Reading Frame für die Translation des Proteins befindet, da sich das Startcodon AUG für die Translation in Exon 2 befindet. Das Exon 1 sowie die ersten Basenpaare des Exon 2 befinden sich entsprechend in der sogenannten 5`-untranslatierten Region (Abbildung 6) (Edens &
Talamantes, 1998).
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Abbildung 6. Genexpression des Growth Hormone Receptor (GHR) nach Edens und Talamantes (1998) modifiziert nach Stiensmeier (2021). Die DNA wird im Rahmen der Transkription in Prä-mRNA umgeschrieben, die Introns und Exons enthält. Während der weiteren Prozessierung werden durch alternatives Spleißen der Prä-mRNA durch die Promotoren 1-3 (P1-3; Roter Pfeil) die Transkripte GHR-1A, GHR-1B respektive GHR-1C codiert. Da der Open Reading Frame erst an Exon 2 beginnt, führt die Translation der mRNA dennoch zu einem identischen GHR-Protein.
2.1.3 IGF-1
Nach Bindung von GH an den GHR und entsprechender intrazellulärer Signaltransduktion entsteht in verschiedenen Geweben, aber insbesondere in der Leber, IGF-1 (Hynes et al., 1987; Jones & Clemmons, 1995). IGF-1 ist ein Peptidhormon und wird auch als Somatomedin C bezeichnet, da es als Mediator von GH dessen indirekte Wirkung auf die Zielzelle vermittelt und ebenfalls das postnatale Wachstum, den Stoffwechsel und das Immunsystem moduliert (Jones & Clemmons, 1995). In einer in vivo Studie an Ratten wurde ein Einfluss von Östrogenen auf die IGF-1-mRNA-Expression in der Leber festgestellt (Murphy et al., 1987).
IGF-1 vermittelt seine Effekte an der Zielzelle über den IGF-1-Rezeptor (IGF-1R).
Hepatozyten exprimieren keine IGF-1R, daher besteht interessanterweise in der Leber kein spezifisches direktes Feedback von IGF-1, sondern nur ein indirektes Feedback im Rahmen des negativen Feedbackmechanismus auf die GH-Sekretion der Hypophyse sowie über die GH- respektive GHR-Expression (Abbildung 1) (Le Roith et al., 2001).
2.1.3.1 Insulin-like Growth Factor Binding Proteins
Im Blut wird IGF-1 an sechs spezielle IGF-Bindungsproteine (IGFBP-1 bis IGFBP-6) gebunden, die 95 - 99 % des zirkulierenden IGF-1 binden. Die IGFBP dienen als Transportproteine, beeinflussen die Verteilung von IGF-1 im Organismus und modulieren dessen Halbwertszeit und Bioverfügbarkeit. Außerdem können sie die Wirkung von IGF-1 an der Zielzelle inhibieren oder verstärken, da sie die Interaktion von IGF-1 mit seinem Rezeptor beeinflussen. Die Expression bestimmter IGFBP wird
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ebenfalls durch GH vermittelt, infolgedessen GH nicht nur die Freisetzung sondern auch die Aktivität von IGF-1 modulieren kann (Jones & Clemmons, 1995) .
Von besonderer Bedeutung ist der 150-kDa Ternärkomplex, bestehend aus IGF-1, IGFBP-3 und der Acid Labile Subunit (ALS). Der Komplex dient als Reservoir für 75 - 80 % des zirkulierenden IGF-1 im Blut (Le Roith et al., 2001). Der Ternärkomplex wird in der Leber synthetisiert, wobei die einzelnen Komponenten in unterschiedlichen Zelltypen gebildet werden: IGF-1- und ALS-mRNA wird in Hepatozyten exprimiert und unterliegen daher der Regulation durch GH über den GHR, während IGFBP-3-mRNA in den Endothelzellen exprimiert wird und daher nur indirekt der Regulation von GH durch IGF-1 unterliegt (Chin et al., 1994; Le Roith et al., 2001).
IGFBP-2 ist primär ein negativer Regulator von IGF-1, indem es durch die Bindung von IGF-1 dessen Wirkung an der Zielzelle inhibiert. Beispielsweise wurde bei Kühen mit inaktiven Ovarien eine vermehrte IGFBP-2-mRNA-Expression festgestellt, infolgedessen das Follikelwachstum in einem frühen Stadium sistierte (Zhao et al., 2019). Der Einfluss durch IGFBP-2 ist jedoch zelltypspezifisch und kann auch zu einem schwachen stimulierenden Effekt, beispielsweise in porzinen glatten Muskelzellen der Aorta in vitro, führen (Busby et al., 1992; Jones & Clemmons, 1995).
Die Expression der hepatischen IGFBP-2-mRNA unterliegt unter anderem metabolischen Einflussfaktoren. Eine Futterrestriktion führt bei Milchkühen zu einer erhöhten hepatischen IGFBP-2-mRNA-Expression (Gross et al., 2011) und in einer Studie an Milchkälbern wurden niedrigere IGFBP-2-Serumkonzentrationen bei Kälbern mit höherer Tränkemenge gemessen (Haisan et al., 2018). Auch bei ersterer Studie diskutierten die Autoren eine direkte Rolle von Insulin auf die IGFBP-2-mRNA-Expression, da die Insulinkonzentration im Serum bei diätetischen Beschränkungen vermindert ist (Thissen et al., 1999). Die erhöhte hepatische IGFBP-2-mRNA-Expression bei Futterrestriktion könnte demnach möglicherweise endokrin über die sinkenden Insulinkonzentrationen vermittelt werden.
Aus der Literatur ist bekannt, dass es in vivo im peripartalen Zeitraum bei Milchkühen zu einer Expressionssteigerung der IGFBP-2-mRNA in der Leber kommt (Gross et al., 2011) und eine erhöhte Plasmakonzentration des Bindungsproteins vorliegt (Laeger et
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al., 2014). Da die antepartalen IGFBP-2 Serumkonzentrationen von gesunden Kühen deutlich höher sind als die von postpartal an Ketose erkrankten Kühen, ist IGFBP-2 sogar ein potentieller Biomarker für Ketose (Piechotta et al., 2015). Auch in vitro konnte in bovinen Hepatozyten eine Verminderung der IGFBP-2-mRNA-Expression durch Insulin sowie Insulin in Kombination mit Dexamethason festgestellt werden, wohingegen Dexamethason allein zu einer signifikanten Steigerung der IGFBP-2-mRNA-Expression in bovinen Hepatozyten führt (Witte et al., 2019).
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2.2 Regulation des Growth Hormone Rezeptors
Der GHR wird zum einen über die Expression der GHR-mRNA und zum anderen über die Translation des GHR-Proteins sowie dessen Translokation an die Zelloberfläche reguliert. Zudem kann auch die Funktion des Rezeptors moduliert werden (Pratt et al., 2016). Diese Vorgänge sind von verschiedenen Faktoren abhängig und werden über komplexe Regulationsmechanismen beeinflusst. In der vorliegenden Dissertation liegt der Fokus auf der Regulation der GHR-mRNA-Expression durch Insulin und Östradiol.
Im Folgenden werden die bekannten Regulationsmechanismen des GHR dargestellt.
Dabei wird zunächst kurz auf die Regulation des GHR im Rahmen der somatotropen Achse eingegangen (Kapitel 2.2.1) und danach die bekannten Regulationsmechanismen der GHR-mRNA-Expression dargestellt (Kapitel 2.2.2).
Anschließend werden die bekannten Einflussfaktoren in den Kontext der sogenannten Entkopplung der somatotropen Achse gesetzt (Kapitel 2.2.3).
In diversen in vivo Studien konnte bereits ein Einfluss von Insulin und Östradiol auf die peripartale GHR-mRNA-Expression beim Rind und beim Schwein beobachtet werden, jedoch wurden bisher keine gezielten Untersuchungen in vitro durchgeführt, um diese Beobachtungen unter isolierten Bedingungen zu bestätigen. Daher wird der Einfluss von Insulin und Östradiol auf die GHR-mRNA-Expression in Hepatozyten in vitro erstmals im Rahmen dieser Dissertation untersucht. Mögliche Regulationsmechanismen durch Insulin und Östradiol werden in Kapitel 2.3 dargestellt.
2.2.1 Einflussfaktoren auf den GHR innerhalb der somatotrope Achse
Die somatotrope Achse (Abbildung 1) kann auf verschiedenen Ebenen beeinflusst werden: Der Freisetzung von GH aus der Hypophyse, der Modulation der GH-Bioverfügbarkeit durch GHBP, der Regulation der hepatischen GHR-mRNA-Expression und durch die Modulation der intrazellulären GH-Signaltransduktion.
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Auf Ebene der Hypophyse kann zum einen die neuroendokrin vermittelte GH-Sekretion über GHRH und GHIH reguliert werden, zum anderen kann die GH-Synthese auf Transkriptionsebene beeinflusst werden. Die hypophysäre GH-Sekretion unterliegt vor allem der Kontrolle durch Faktoren, die im direkten Zusammenhang mit dem metabolischen Status stehen. Beispielsweise inhibieren freie Fettsäuren die GH-Sekretion, während Leptin die GH-Sekretion durch die Regulation von GHRH und GHIH stimuliert (Le Roith et al., 2001). Die Expression von GH in der Hypophyse wird unter anderem durch Umweltfaktoren und endokrine Einflussfaktoren reguliert. Triiodthyronin (T3) und Glukokortikoide führen auf Transkriptionsebene zu einer gesteigerten, während Insulin im Gegensatz dazu zu einer verminderten GH-Expression führt (Tuggle & Trenkle, 1996).
Mit Bezug auf die hepatische GHR-mRNA-Expression und Signaltransduktion ist von Bedeutung, dass eine Autoregulation des GHR durch GH besteht. Die Effekte sind dabei zelltypspezifisch und abhängig von der Dauer der GH-Wirkung. In vivo führt eine längere GH-Substitution über drei bis sieben Wochen sowohl bei Milchkühen als auch bei Schweinen zu einem Anstieg der GHR-mRNA-Expression in der Leber (Brameld et al., 1996; Combes et al., 1997; Silva et al., 2017). Auch bei Ratten mit durch einen Hypophysentumor induzierten erhöhten GH-Serumkonzentrationen konnte eine erhöhte Bindungskapazität von GH in der Leber festgestellt werden (Baxter et al., 1982), während im Gegensatz dazu eine einmalige Applikation zu einer verminderten GH-Bindung in der Leber führte, die die Autoren auf eine Suppression der GHR-mRNA-Expression zurückführten (Maiter et al., 1988). Auch ein GH-Defizit führt zu einer Verminderung der GHR-mRNA-Expression in der Leber: Eine Hypophysektomie führte bei Kaninchen und Lämmern zu einer verminderten GH-Bindung in der Leber. Eine Substitution von GH führte zu einer Wiederherstellung der GH-Bindungskapazität bei Lämmern (Posner et al., 1980). Ebenso konnte an Mäusen mit einem GH-Defizit eine positive Korrelation zwischen der GH-Konzentration und der GHR- und IGF-1-mRNA-Expression in der Leber festgestellt werden, während GH keinen Einfluss auf die GHR-mRNA-Expression in der Hypophyse hatte (Iida et al., 2004). Die Regulation erfolgt dabei transkriptspezifisch, so führt beispielsweise die Substitution von GH bei trächtigen Sauen zu einer verminderten mRNA-Expression
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von GHR-1A während die GHR-1B-mRNA-Expression in der Leber unverändert bleibt (Liu et al., 2000). Im Widerspruch dazu steht eine Studie, die ebenfalls bei Ratten weder durch eine GH-Substitution noch durch ein GH-Defizit infolge einer Hypophysektomie einen signifikanten Einfluss auf die hepatische GHR-mRNA- Expression zeigte (Mathews et al., 1989). Mathews et al. (1989) stellten jedoch eine verminderte IGF-1-mRNA-Expression in der Leber von hypophysektomierten Ratten fest, die die Autoren als Ausdruck einer GHR-Regulation auf der posttranskriptionalen Ebene beurteilten, da die GHR-mRNA-Expression unverändert war (Mathews et al., 1989).
2.2.2 Regulation der GHR-mRNA-Expression und des GHR-Proteins
Die Wirkung von GH über den GHR kann entweder über Veränderungen am Liganden, am Rezeptor selbst oder der intrazellulären Signaltransduktion moduliert werden. Zu den Veränderungen am Rezeptor zählt zum einen die Expression der GHR-mRNA sowie die entsprechende Synthese der GHR-Proteine, die auf Ebene der Transkription, Translation oder auf posttranslationaler Ebene beeinflusst werden können (Flores-Morales et al., 2006). Verschiedene Faktoren können über die Regulation der Transkription des GHR-Gens die Höhe der GHR-mRNA-Expression in Hepatozyten modulieren, ebenso wie die Menge der anschließend aus der mRNA translatierten GHR-Proteine. Darüber hinaus kann auch die Translokation der GHR-Proteine an die Zelloberfläche reguliert werden, wodurch wiederum die Bindungskapazität für GH moduliert wird (Flores-Morales et al., 2006). Zum anderen kann der exprimierte GHR auf der Zelloberfläche durch Proteolyse der extrazellulären Domäne im Rahmen der Entstehung der GHBP beeinflusst werden, infolgedessen nur ein GHR-Rest, bestehend aus der transzellulären und intrazellulären Domäne des Rezeptors, an der Zelle zurückbleibt. Dies führt entsprechend zu einer Verminderung der Rezeptoren und einer verminderten Responsivität der Zelle auf GH (Wang et al., 2002; Zhang et al., 2001). Interessanterweise inhibiert GH durch die induzierte Dimerisierung des GHR diese Proteolyse, wobei die physiologische Funktion bisher jedoch nicht bekannt ist (Zhang et al., 2001).
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Die Expression der GHR-mRNA unterliegt einer Regulation durch verschiedene Einflussfaktoren. Zu diesen Einflussfaktoren zählen zum einen unveränderliche Faktoren wie das Alter, Geschlecht und die Rasse des Tieres und zum anderen variable Faktoren wie der Ernährungs- und Gesundheitszustand des Tieres und verschiedene endokrine Einflussfaktoren. Auf molekularer Ebene erfolgt die Regulation der GHR-mRNA-Expression über verschiedene Transkriptionsfaktoren, die an spezifische Bindungsstellen der DNA binden können (Schwartzbauer & Menon, 1998).
Alter: Die GHR-Expression ist abhängig vom Alter. Im Fetus wird kaum GHR-mRNA in der Leber exprimiert, sodass niedrige IGF-1-Serumkonzentrationen und durch das fehlende negative Feedback von IGF-1 auf die Hypophyse entsprechend hohe GH-Konzentrationen im Fetus vorliegen. Das pränatale somatische Wachstum scheint daher GH-unabhängig zu sein (Badinga et al., 1987; Schwartzbauer & Menon, 1998).
Auch in Neonaten ist die Expression der hepatischen GHR-mRNA zunächst sehr gering und nimmt erst mit dem Alter zu. Ebenso unterliegt die GHR-mRNA-Expression in Nieren, Herz und Muskulatur einem Einfluss durch das Alter (Mathews et al., 1989).
Die Expressionssteigerung hängt zeitlich mit der Reifung des GH-IGF-Systems zusammen (Badinga et al., 1987; Pierzchała et al., 2012). Erst mit steigender GHR-mRNA-Konzentration steigt auch die GHR-Dichte, was auf eine Regulation auf der Transkriptionsebene hinweist (Schwartzbauer & Menon, 1998). Im Gegensatz dazu erfolgt die Expression des Transkriptes GHR-1B unabhängig vom Alter und kann beim Rind bereits in Feten nachgewiesen werden (Lucy et al., 1998).
Geschlecht: Die Regulation der GHR-mRNA-Expression ist zudem geschlechtsspezifisch. Bei männlichen Schweinen konnte gezeigt werden, dass eine Kastration zu einer deutlichen und gewebespezifischen Beeinflussung der GHR-mRNA-Expression führt: Während diese in der Leber deutlich vermindert wird, steigt sie im Fettgewebe signifikant an (Wang et al., 2017). Bei Ratten führt ein induzierter Diabetes mellitus bei weiblichen Tieren zu einer deutlicheren GH-Resistenz in der Leber als bei männlichen Tieren (Baxter et al., 1980). Eine induzierte Hypothyreose führt bei weiblichen Ratten zu einer vermehrten Expression der hepatischen GHR- und GHBP-mRNA, während es bei männlichen Ratten zu einer
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verminderten Expression kommt (Romero et al., 1966). Zudem konnte bei trächtigen Ratten eine erhöhte GHR-mRNA-Expression in der Leber festgestellt werden (Mathews et al., 1989). Clodfelter et al. (2006) konnten an Mäusen zeigen, dass die geschlechtsspezifische Genexpression in der Leber, die 72 % der Gene in der Leber von Mäusen betrifft, vor allem durch STAT5b vermittelt wird, da bei STAT5b-Knock- Out-Mäusen die Expression von überwiegend männlichen Genen in der Leber herunterreguliert wurde, während die Expression der überwiegend weiblichen Genen hochreguliert wurde (Clodfelter et al., 2006). Die Autoren vermuteten eine indirekte Regulation über die Aktivierung von Transkriptions-Repressoren. Auch bei Schweinen konnte eine geschlechtsspezifische Regulation von Leberfunktionen festgestellt werden. Riedel et al. (2020) untersuchten das Proteom und Metabolom der Leber von GHR-Knock-Out-Schweinen und stellten teilweise eine unterschiedliche Regulation von Proteingruppen zwischen männlichen und weiblichen Tieren fest. Spezifische Untersuchungen einer geschlechtsspezifischen Regulation der hepatischen GHR-mRNA-Expression wurden allerdings bisher weder beim Rind noch beim Schwein durchgeführt.
Rasse: Bei Schweinen konnte außerdem ein Einfluss der Rasse auf die hepatische GHR-Expression festgestellt werden: In absteigender Reihenfolge exprimierten die Rassen Polnisches Edelschwein, Polnische Landrasse, Duroc und Piétrain unterschiedliche Mengen GHR-mRNA in der Leber (Pierzchała et al., 2012). Dies assoziierten die Autoren mit den unterschiedlichen Phänotypen der Rassen bezüglich der postnatalen Wachstumsraten und dem Muskelfleischanteil des Schlachtkörpers.
Energiebilanz: Die Energiebilanz hat einen gewebespezifischen Einfluss auf die GHR-mRNA-Expression. In der Leber führt ein Energiedefizit zur Verminderung der hepatischen GHR-mRNA-Expression (Schwartzbauer & Menon, 1998; Straus &
Takemoto, 1990). Bei Schweinen führte bereits eine geringgradig verminderte Energiezufuhr in vivo zu einer um bis zu 30 - 50 % verminderten Expression der hepatischen GHR-mRNA (Dauncey et al., 1994; Weller et al., 1994). Dabei hat die Dauer des Energiedefizits einen großen Einfluss. Eine Futterrestriktion über wenige Wochen führt zu einer verminderten GHR-Expression in der Leber (Dauncey et al., 1994; Katsumata et al., 2000), während eine Langzeit-Futterrestriktion (120 Tage) zu
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einer gesteigerten GHR-Expression in der Leber führt (Combes et al., 1997). Auch in vitro hat die Energieversorgung einen Einfluss auf die GHR-mRNA-Expression in Hepatozyten. An primären porzinen Hepatozyten konnte eine positive Korrelation zwischen dem Zusatz von Glukose zum Kulturmedium und der GHR-mRNA- Expression der Zellen festgestellt werden (Brameld et al., 1995).
Ebenso führen auch andere katabole Zustände wie beispielsweise schwere Erkrankungen zu einer verminderten Rezeptordichte oder Rezeptoraktivität des GHR in der Leber (Schwartzbauer & Menon, 1998). Endotoxine induzieren bei Mäusen in vivo eine Proteolyse der extrazellulären Rezeptordomäne und führen somit zu einer Insensitivität des hepatischen GHR. Dabei ist die Rezeptordichte in der Leber bereits nach kurzer Zeit deutlich vermindert, während die GHR-mRNA-Expression unverändert bleibt (Wang et al., 2008).
Hormone: Neben GH selbst (Kapitel 2.2.1) sind aus der Literatur weitere Hormone bekannt, die die GHR-mRNA-Expression in der Leber positiv oder negativ beeinflussen. Gegenstand der Untersuchungen dieser Dissertation sind Insulin und Östradiol, deren spezifische Beschreibung in Kapitel 2.3 folgt.
T3 stimuliert zum einen die Synthese und Sekretion von GH in der Hypophyse und beeinflusst somit indirekt den GHR in der Leber (Birzniece et al., 2009; Cabello &
Wrutniak, 1989). Zum anderen kann T3 darüber hinaus auch einen direkten Einfluss auf die hepatische GHR-Expression nehmen. In einer in vitro Studie an Hepatozyten von Zwergmäusen führte T3 zu einer erhöhten GH-Bindung infolge einer vermehrten GHR-Expression (Fouchereau-Peron et al., 1981). Entsprechende in vitro Untersuchungen an bovinen oder porzinen Hepatozyten konnten auch nach eingehender Literaturrecherche nicht gefunden werden.
Glukokortikoide sind ebenfalls Regulatoren der hepatischen GHR-mRNA-Expression.
Dies wurde sowohl in vivo als auch in vitro gezeigt. An Schaf-Feten konnte in vivo festgestellt werden, dass mit steigender Trächtigkeitsdauer sowohl die Cortisol als auch die hepatische GHR- und IGF-1-mRNA Konzentration steigen. Sinkende Cortisolkonzentrationen infolge einer Adrenalektomie führten jedoch zu einer verminderten hepatischen GHR- und IGF-1-mRNA-Expression, während eine Infusion
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von Cortisol sowohl bei adrenalektomierten Tieren als auch bei nicht adrenalektomierten Tieren zu einer gesteigerten GHR- und IGF-1-mRNA-Expression in der Leber führte (Li et al., 1996). Insbesondere Dexamethason konnte in vitro als negativer Regulator der GHR-mRNA-Expression nach 72 Stunden in bovinen Hepatozyten identifiziert werden (Witte et al., 2019). Interessanterweise konnte in porzinen Hepatozyten in vitro im Gegensatz dazu eine deutliche Steigerung der GHR-mRNA-Expression nach 24 Stunden durch Dexamethason in derselben Konzentration (100 nM) festgestellt werden (Brameld et al., 1995).
2.2.3 Entkopplung der somatotropen Achse beim Rind
In bisherigen Studien hat sich der hepatische GHR als zentrales Regulationselement zur Entkopplung der somatotropen Achse dargestellt. Im peripartalen Zeitraum kommt es bei der Milchkuh durch eine Verminderung der hepatischen GHR-Expression, die durch eine Verminderung der leberspezifischen GHR-1A-mRNA-Expression vermittelt wird (Kim, 2014; Kobayashi et al., 1999; Lucy et al., 2001; Radcliff et al., 2003), sowie vermutlich auch durch eine Veränderung der GH-Signaltransduktion zu einer hepatischen GH-Resistenz. Dies konnte bereits für verschiedene Milchkuhrassen gezeigt werden (Okamura et al., 2009). Infolgedessen wird weniger IGF-1 aus der Leber freigesetzt und der negative Feedbackmechanismus durch IGF-1 auf die Hypophyse vermindert, sodass die GH-Sekretion aus der Hypophyse steigt (Abbildung 7) (Lucy, 2008; Lucy et al., 2001). Im Vergleich dazu bleibt die Expression der GHR-1B- und GHR-1C-mRNA in Hepatozyten unverändert (Jiang et al., 2005).
Die Reduktion der GHR-mRNA-Expression beginnt bereits zwei bis drei Wochen ante partum, verläuft zunächst graduell und fällt in den letzten Tagen vor der Geburt stark ab (Radcliff et al., 2003a, 2003b, Piechotta et al. 2012). Dabei bestehen allerdings erhebliche tierindividuelle Unterschiede in der GHR-1A-mRNA- Konzentration (Radcliff et al., 2003b). Die Rekonstitution des physiologischen GH-Rezeptorlevels beginnt bereits eine Woche post partum (Jiang et al., 2005;
Radcliff et al., 2003a). Im Zusammenhang mit der Normalisierung der GHR-1A-mRNA- Expression erlangt die Leber innerhalb von 21 Tagen post partum auch die ursprüngliche Rezeptordichte des GHR wieder (Abbildung 8) (Kim, 2014).
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Die Entkopplung der somatotropen Achse wird beim Rind unter anderem mit der peripartalen negativen Energiebilanz (NEB) assoziiert, die aufgrund des hohen Energiebedarfs für die einsetzende Laktation entsteht und nicht durch die Futteraufnahme gedeckt werden kann (Bell, 1995; Fenwick et al., 2008). Die peripartale NEB verstärkt beim Rind die Entkopplung der somatotropen Achse, ist jedoch nicht der Auslöser wie Gross et al. (2011) durch die Induktion einer NEB zu einem späteren Laktationszeitpunkt zeigen konnten, zu dem die Genexpression des GHR konstant blieb (Gross et al., 2011).
Regulationsphysiologisch vermitteln die erhöhten GH-Konzentrationen im Serum die metabolische Adaptation an den erhöhten Energiebedarf im peripartalen Zeitraum durch die Mobilisierung von Energiereserven mittels Lipomobilisation und die Stimulation der Glukoneogenese in der Leber. Zudem erfolgt eine Modulation der Nährstoffverteilung im Organismus, da GH die insulinvermittelte Glukoseresorption antagonisiert. Da die Nährstoffaufnahme der Milchdrüse insulinunabhängig ist, führt dieser Mechanismus zu einer Priorisierung der Milchdrüse, wodurch GH die Milchproduktion begünstigt (Kim, 2014).
Interessanterweise bleibt bei Fleischkühen die hepatische GHR-total-, GHR-1A- und IGF-1-mRNA-Expression im peripartalen Zeitraum konstant. Folglich findet bei Fleischrindern keine Entkopplung der somatotropen Achse statt (Jiang et al., 2005).
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Abbildung 7. Schematische Darstellung der Entkopplung der somatotropen Achse.
Die sogenannte Entkopplung der somatotropen Achse wird peripartal durch eine Downregulation des hepatischen Growth Hormone Receptor (GHR) vermittelt, die zu einer hepatischen Growth Hormone (GH)-Resistenz führt. Infolgedessen wird die Freisetzung des Insulin-like Growth Factor-1 (IGF-1) und das negative Feedback von IGF-1 auf die Hypophyse vermindert, sodass die GH-Sekretion aus der Hypophyse steigt und GH in hoher Konzentration im Serum vorliegt.
2.2.4 Hepatische GH-Resistenz beim Schwein
Ein der Entkopplung der somatotropen Achse bei der Milchkuh ähnliches Phänomen ist auch bei der Sau beschrieben, das allerdings nicht unmittelbar peripartal, sondern erst zwei bis drei Wochen post partum auftritt (Abbildung 8) (Lucy, 2008). Wie bereits erwähnt ist die hepatische GH-Resistenz bei der Sau jedoch nicht physiologisch, sondern mit einer pathologischen negativen Energiebilanz assoziiert.
Bei der Sau kommt es nach der Geburt zu einem gleichzeitigen signifikanten Anstieg der GH-Konzentrationen sowie der IGF-1-Konzentrationen im Plasma (Abbildung 8).
Govoni et al. (2007) untersuchten hierzu bei Large White x Duroc Hybridsauen in der dritten bis vierten Trächtigkeit die GH- und IGF-1-Plasmakonzentrationen an Tag 30,
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60 und 90 der Trächtigkeit sowie an Tag 7 und 21 post partum und bei der ersten Rausche nach dem Absetzen der Ferkel. Von Tag 90 der Trächtigkeit zu Tag 7 post partum kam es zu einem signifikanten Anstieg der GH- und IGF-1- Plasmakonzentration (Govoni et al., 2007). Im Gegensatz zur Milchkuh ist die somatotrope Achse der Sau peripartal also nicht entkoppelt. Der Anstieg der GH- Serumkonzentration wird bei der Sau durch die Stimulation der Milchdrüse durch die Ferkel ausgelöst (Rushen et al., 1993).
Eine post partum auftretende hepatische GH-Resistenz wird bei Sauen durch eine negative Energiebilanz induziert, die im Vergleich zum Rind jedoch erst zwei bis drei Wochen nach der Geburt auftritt (Abbildung 8). Dies ist dadurch bedingt, dass die Milchleistung der Sau im Gegensatz zur Milchkuh erst mit dem zunehmenden Bedarf der Ferkel ansteigt. Entscheidend ist dabei das Ausmaß der negativen Energiebilanz, beispielsweise durch eine inadäquate Fütterung, denn unter physiologischen Umständen bleibt die Entkopplung der somatotropen Achse trotz kataboler Stoffwechsellage bei der Sau aus (Lucy, 2008). Buonomo und Baile konnten bei Schweinen durch eine Futterrestriktion über 48 Stunden eine Entkopplung der somatotropen Achse induzieren, die durch erhöhte GH- und verminderte IGF-1- Serumkonzentrationen gekennzeichnet war (Buonomo & Baile, 1991).
In dieser Dissertation wird erstmals die Regulation der GHR-mRNA-Expression durch peripartale Hormonkonzentrationen von Insulin und Östradiol in porzinen Hepatozyten in vitro untersucht. Da die hepatische GH-Resistenz bei der Sau wie beschrieben nicht unmittelbar mit dem peripartalen Zeitraum zusammenhängt, sondern auf eine pathologische NEB zurückzuführen ist und damit ein enger Zusammenhang zum Stoffwechsel besteht, wird in porzinen Hepatozyten jedoch eher ein Einfluss durch Insulin als durch Östradiol vermutet.
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Abbildung 8. Schematische Darstellung der peripartalen Veränderungen der Growth Hormone (GH) und Insulin-like Growth Factor-1 (IGF-1) Konzentrationen im Serum sowie der hepatischen Growth Hormone Receptor (GHR) Expression im Vergleich von Schwein und Rind nach Lucy (2001). Der Pfeil kennzeichnet jeweils den Zeitpunkt der Entkopplung der somatotropen Achse: Beim Rind beginnt die Verminderung der GHR-mRNA-Expression bereits vor der Geburt, während sie beim Schwein erst verzögert stattfindet.
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2.3 Endokrine Einflussfaktoren auf die peripartale Regulation der hepatischen GHR-mRNA-Expression
Die hepatische GHR-mRNA-Expression unterliegt im peripartalen Zeitraum dem Einfluss komplexer Regulationsmechanismen. Jedoch ist die GHR-mRNA-Expression nicht mit der tatsächlichen Rezeptordichte auf der Zelloberfläche, respektive der GH-Signalwirkung gleichzusetzen: Zum einen wird nicht jede GHR-mRNA in ein GHR-Protein translatiert und nicht jedes GHR-Protein transloziert dann auch tatsächlich an die Zelloberfläche. Zum anderen kann die intrazelluläre GH- Signaltransduktion (Kapitel 2.1.2.1) zusätzlich durch intrazelluläres Crosstalk durch verschiedene Einflussfaktoren verändert werden (Pratt et al., 2016; Roux &
Topisirovic, 2018). Sowohl die Regulation der Expression des GHR als auch der GH-Signaltransduktion ist für eine physiologische Interaktion von GH und GHR und für die Vermittlung der entsprechenden GH-Wirkung wichtig. Bis heute sind die Einflussfaktoren für die peripartalen Veränderungen dieser beiden Komponenten in der Leber weder beim Rind noch beim Schwein bekannt. In der vorliegenden Dissertation wird der Fokus auf die Regulation der GHR-mRNA-Expression in Hepatozyten gelegt.
Aus der Literatur sind diverse Faktoren bekannt, die die Expression der GHR-mRNA beeinflussen. Diese sind in Tabelle 1 dargestellt. Im Folgenden wird genauer auf die Hormone Insulin und Östradiol eingegangen, die in der hier beschriebenen Arbeit detailliert untersucht wurden.
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Tabelle 1. Einflussfaktoren auf die Expression der Growth Hormone Receptor (GHR)-mRNA in der Leber nach Flores-Morales et al. (2006) modifiziert nach Stiensmeier (2021).
Einflussfaktor Spezies in vivo/
in vitro
Einfluss auf den GHR Negative Energiebilanz Rind, Schwein in vivo
Erkrankungen, Endotoxine Maus in vivo
Glukosedepletion Schwein in vitro
GH (Einmalige Applikation) Ratte in vivo
GH (Chronische Applikation) Rind, Schwein, Ratte, Schaf
in vivo
GH-Defizit Kaninchen, Lamm,
Maus
in vivo
Trächtigkeit Maus in vivo
Insulin Rind, Ratte,
Schwein
in vivo, in vitro
Östrogene Rind in vivo,
in vitro
Triiodthyronin Maus in vitro
Glukokortikoide Rind in vitro
Schwein in vitro
Schaf in vivo
IGF-1 Ratte in vivo
2.3.1 Insulin
Insulin ist ein Peptidhormon und wird in den β-Zellen der Langerhans-Inseln des Pankreas synthetisiert. Insulin vermittelt seine Wirkung über den Insulinrezeptor (IR), der mit variierender Expressionsdichte in fast allen Geweben exprimiert wird (Berg et
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al., 2013), insbesondere auch in der Leber (Liu et al., 2010; Meyer et al., 1981). Insulin ist wesentlich an der Regulation der Glukosehomöostase beteiligt, indem es die Aufnahme und Metabolisierung von Glukose in die Zelle vermittelt, die Glykogensynthese und -speicherung steigert sowie die Glukoneogenese in der Leber und die Glykogenolyse hemmt (White & Kahn, 1994). In der Literatur sind verschiedene regulatorische Effekte von Insulin auf die Komponenten der somatotropen Achse und insbesondere auf den hepatischen GHR bekannt. Dabei moduliert Insulin sowohl die Expression als auch die Translokation des GHR sowie die intrazelluläre GH-Signaltransduktion. In dieser Dissertation wurde der Einfluss von Insulin auf die GHR-mRNA-Expression in primären bovinen und porzinen Hepatozyten untersucht.
Die Regulation des GHR durch Insulin erfolgt gewebespezifisch und konzentrationsabhängig. Es konnte sowohl in in vivo als auch in vitro Studien gezeigt werden, dass Insulin in der Leber zu einem Anstieg der GHR-mRNA-Expression sowie der GHR-Dichte führt, während der GHR in den meisten extrahepatischen Geweben durch den Einfluss von Insulin herunterreguliert wird (Baxter et al., 1980; Birzniece et al., 2009; Leung et al., 2000).
Bei Milchkühen konnte in vivo nach einer Insulininfusion eine Steigerung der GHR-total- und GHR-1A-mRNA-Expression in der Leber festgestellt werden (Butler et al., 2003; Rhoads et al., 2004). Allerdings waren die Insulinkonzentrationen in diesen Arbeiten 2- bis über 10-fach höher als physiologisch um den Geburtszeitpunkt. Vor der Geburt kommt es sowohl beim Rind als auch beim Schwein zu einer signifikanten Verminderung der Insulinkonzentrationen im Plasma. Beim Rind sinken die Insulinkonzentrationen von 25 µU/ml (4 Wochen ante partum) auf 4 µU/ml am Tag der Geburt (Piechotta et al., 2012; Piechotta et al., 2014). Beim Schwein kommt es zu einem Abfall von > 100 µU/ml (5 Tage ante partum) auf 6 µU/ml bis zur Geburt (Le Cozler et al., 1999). Auch in vitro führt Insulin in bovinen Hepatozyten zu einer Steigerung der GHR-mRNA-Expression (Witte et al., 2019). Ebenso konnte in porzinen Hepatozyten in vitro ein Anstieg der GHR-mRNA-Expression durch Insulin festgestellt werden (Brameld et al., 1995). Speziesübergreifend vermittelt Insulin in vivo auch bei Ratten mit induziertem Diabetes eine Steigerung der GH-Bindung in der Leber, was
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die Autoren auf eine erhöhte Rezeptordichte zurückführten (Baxter et al., 1980). In humanen Hepatomzellen führt Insulin ebenfalls zu einem Anstieg der GHR-mRNA- Expression und der GHR-Proteine (Leung et al., 2000).
Insulin beeinflusst die Expression des GHR in steigenden Konzentrationen biphasisch.
In humanen Hepatomzellen vermittelt Insulin in vitro bereits ab einer Konzentration von 0,1 nM einen Anstieg der GH-Bindung, der einen Peak bei 10 nM aufweist und anschließend zwar sinkt, aber erst bei einer Konzentration von 1000 nM wieder der GH-Bindung der Kontrollzellen ohne Insulinstimulation entspricht. Insulin vermittelte ebenfalls einen Anstieg der GHR-mRNA-Expression und deren Translation in GHR-Protein, jedoch kommt es ab einem Schwellenwert, der in der zitierten Studie bei 1000 nmol/l lag, zu einer Suppression der Translokation des GHR. Der Einfluss auf die GHR-mRNA-Expression wurde in dieser Studie nicht untersucht (Leung et al., 2000).
2.3.2 17β-Östradiol
17β-Östradiol (Östradiol, E2) ist ein Steroidhormon und zählt zur Gruppe der Östrogene. Im Vergleich zu Östron und Östriol ist es das wirksamste natürliche Östrogen. Östradiol wird in der Nebennierenrinde sowie beim weiblichen Tier in den Ovarien und während der Trächtigkeit in der Plazenta aus Cholesterol synthetisiert (Beato & Klug, 2000; Nelson & Bulun, 2001). Östrogene tragen im peripartalen Zeitraum zur Initiierung der Geburt, Abstoßung der Nachgeburt und Laktationsbeginn bei. In den letzten 14 Tagen vor der Geburt kommt es sowohl beim Rind als auch beim Schwein zu einem progressiven Anstieg der Plasmakonzentrationen von Östradiol.
Beim Rind kommt es zu einem Anstieg von etwa 90 pg/ml (2 - 3 Wochen ante partum) auf bis zu 450 pg/ml am Tag der Geburt (Kedves, 2016). Beim Schwein steigen die Östradiolkonzentrationen von etwa 100 pg/ml (2 Wochen ante partum) auf bis zu 600 pg/ml unmittelbar vor oder während der Geburt (Österlundh et al., 1998; Taverne et al., 1979).
Östradiol gelangt aufgrund seiner lipophilen Eigenschaften mittels Diffusion in die Zielzelle und vermittelt seine Wirkung in der Leber über den Östrogenrezeptor α (ERα), der für Östrogene den Hauptmediator im Stoffwechsel darstellt (Beato & Klug, 2000;
