Systembiologie regenerierender Hepatozyten
Koordination:
Hochschuldozent Dr. J. Timmer
Freiburger Zentrum für Datenanalyse und Modellbildung Universität Freiburg
Eckerstr. 1 79104 Freiburg
Professor Dr. Dr. h.c. H.E. Blum Medizinische Universitätsklinik Freiburg
Hugstetter Str. 55 79106 Freiburg
Zusammenfassung
Die Regeneration von Hepatozyten ist ein kontrollierter Wachstumsprozeß, der durch das koordinierte Zusammenspiel zahlreicher Signalübertragungswege präzise reguliert wird. Dabei ist Zeitpunkt, Ausmaß und Dauer der Aktivierung von Signalübertragungswegen entscheidend. Das beantragte Projekt hat zum Ziel, die Systemeigenschaften von regenerierenden Hepatozyten zu ermitteln. Hierzu wird das dynamische Verhalten der Signaltransduktion und Genexpression im zeitlichen Verlauf quantitativ erfaßt. Basierend auf diesen experimentellen Daten werden mathematische Modelle entwickelt, um die Regulation dieses dynamischen Prozesses aufzuklären.
Es werden Signaltransduktionswege modelliert, die für Proliferation, Differenzierung und Apoptose im Rahmen der Leberregeneration zentral sind. Die Modelle werden durch experimentelle Validierung ihrer Vorhersagen überprüft. Die Module der einzelnen Signalkaskaden werden in einem integralen Modell mit dem Ziel einer datenbasierten virtuellen Leberzelle verknüpft, um in silico das Systemverhalten zu untersuchen. Ein Verständnis der Systemeigenschaften regenerierender Hepatozyten wird dazu beitragen, Bedingungen für die kontrollierte Vermehrung und gezielte Differenzierung dieser Zellen zu definieren. Dies unterstützt die systematische Entwicklung einer Hepatozyten−Zellinie, bei der die in vivo Eigenschaften in vitro weitgehend erhalten sind und eröffnet neue Perspektiven auf dem Gebiet des tissue engineering.
Detaillierte Informationen zur Projektstruktur und Management/Koordination Das Gesamtprojekt gliedert sich thematisch in vier Unterbereiche:
A Etablierung und Validierung der Standardized Operating Procedures (SOPs) zur Isolierung und Kultivierung primärer Hepatozyten
PD Dr. F. von Weizsäcker, Abteilung für Gastroenterologie, Hepatologie und Infektiologie, Universitätsklinikum Freiburg
B Untersuchung spezieller Signaltransduktionswege und genetischer Netzwerke
B1 Dynamische Modellierung der JAK/STAT und SMAD Signaltransduktionskaskaden in primären Hepatozyten
PD Dr. U. Klingmüller, Max−Planck−Institut für Immunbiologie, Freiburg
B2 Dynamische Modellierung der transkriptionellen Aktivität von NF−κB in Hepatozyten Prof. Dr. I. Merfort, Institut für Pharmazeutische Biologie, Universität Freiburg
Dr. T. Sparna, Abteilung für Nephrologie, Universitätsklinikum Freiburg B3 Insulin und IGF−1 vermittelte Signaltransduktion in Hepatozyten
Dr. L. Mohr, Abteilung für Gastroenterologie und Hepatologie, Universitätsklinikum Freiburg B4 Funktion der Transkriptionsfaktoren CREB und SRF in der Leberregeneration.
Prof. Dr. G. Schütz, Deutsches Krebsforschungszentrum, Heidelberg
Prof. Dr. A. Nordheim, Institut für Zellbiologie, Fakultät für Molekulare Biologie, Universität Tübingen
B5 Quantitative und zeitlich auflösende Beschreibung dynamischer Prozesse bei der Regulation von Zielgenen des Wnt/β−Catenin−Signalwegs
PD Dr. A. Hecht, Institut für Molekulare Medizin und Zellforschung, Universität Freiburg B6 Mathematische Modellierung der Fas/CD95−induzierten Signalwege in primären Hepatozyten
Prof. Dr. Ch. Borner, Institut für Molekulare Medizin und Zellforschung, Universität Freiburg Prof. Dr. T. Dandekar, Fakultät für Bioinformatik, Universität Würzburg
B7 Die Bedeutung von Ovalzellen für die Leberregeneration − Modellierung der Differenzierung von Ovalzellen in adulten Hepatozyten
Dr. J. Donauer, Prof. Dr. G. Walz, Abteilung für Nephrologie, Universitätsklinikum Freiburg B8 Dynamik der Genexpression bei Ischämie und Regeneration der Leber
PD Dr. S. Benz, Abteilung für Chirurgie, Universitätsklinikum Freiburg Dr. J. Donauer, Abteilung für Nephrologie, Universitätsklinikum Freiburg
B9 Herstellung leberspezifischer Knock−Out Mäuse zur dynamischen Modellierung negativer feed−back Loops in der Leberregeneration
PD Dr. U. Klingmüller, Max−Planck−Institut für Immunbiologie, Freiburg C Entwicklung neuer Technologien zur quantitativen Proteinmessung
C1 Entwicklung von Antikörper Microarray Technologien für die Proteinquantifizierung Dr. U. Korf, Deutsches Krebsforschungszentrum, Heidelberg
C2 Quantitative Proteindetektion durch lumineszierende Nanopartikel
Dr. Th. Nann, Fakultät für Angewandte Wissenschaften, Universität Freiburg
C3 Modellierung zellulärer Signalwege im Hepatozyten unter Einsatz optischer Methoden zur Erfassung raumzeitlicher Dynamiken multipler Parameter
Dr. R. Nitschke, Life Imaging Center, Fakultät für Biologie, Universität Freiburg
D Bioinformatik, mathematische Modellierung und Systemanalyse
D1 Statistische Datenanalyse und Bioinformatik der arraybasierten quantitativen Assays Dr. W. Huber, Deutsches Krebsforschungszentrum, Heidelberg
D2 Mathematische Modellierung und Systemanalyse
HD Dr. J. Timmer, Zentrum für Datenanalyse und Modellbildung, Universität Freiburg
Die Gesamtkoordination des Verbundprojektes liegt bei Herrn HD Dr. J. Timmer. Den Kontakt zur nationalen Plattform Zellbiologie koordiniert PD Dr. F. von Weizsäcker. Frau PD Dr. U.
Klingmüller koordiniert die biochemischen und molekularbiologischen Aspekte. Herr HD Dr. J.
Timmer zeichnet für die Koordination der gemeinsamen Arbeiten mit der nationalen Plattform Bioinformatik/Modellierung verantwortlich.
Eine Evaluation der Arbeiten und ihrer synergistischen Vernetzung wird durch halbjährliche Review−Meetings gewährleistet werden. Zu diesen Treffen werden auch die anderen Verbundprojekte, die nationalen Plattformen Zellbiologie und Bioinformatik/Modellierung sowie Vertreter des Projektträgers und der Koordinator des Netzwerkes "Systembiologie" eingeladen.
Ausführliches Gesamtkonzept
Zur systembiologischen Untersuchung der Regeneration von Hepatozyten, werden datengestützte mathematische Modelle der wichtigsten Signalkaskaden und der Expression von Zielgenen etabliert und zu einem integralen Modell zusammengeführt.
Modellierung und Systemanalyse
Es gibt vermehrte Hinweise dafür, daß die regulatorischen Funktionen biologischer Systeme auf dem dynamischen Verhalten ihrer Signaltransduktionsnetzwerke beruht. Für Hepatozyten wurde z.B. gezeigt, daß eine anhaltende Aktivierung von ERK1/2 die DNA Synthese inhibiert, während eine transiente Aktivierung die DNA Synthese induziert (Biochem. J. 330:1451, 1998, s.a. Science 297:1018, 2002). Ein Verständnis derartiger systemischer Eigenschaften durch dynamische Modelle der Prozesse beinhaltet zwei Aufbaustücke: Die Struktur der Modelle und die Parameter.
Die Kernstruktur zahlreicher regulatorischer biochemischer Netzwerke ist qualitativ gut charakterisiert. Im Verhältnis dazu sind quantitative Daten über Parameter wie z.B. Reaktionsraten größtenteils unbekannt. In Untersuchungen der Systemeigenschaften dynamischer Modelle für ein bestimmtes biologisches System per Simulationsstudien werden diese Parameter häufig ad hoc gewählt oder Literaturwerte verwendet, die häufig unter anderen Bedingungen oder in unterschiedlichen Organismen ermittelt wurden. Es überrascht daher nicht, daß diese Werte mitunter um Größenordnungen variieren (Biochem. Biophys. Acta 615:103, 1980). Dieses stellt eine wesentliche Einschränkung eines rein simulationsgestützten Ansatzes zur Ermittlung von systemischen Eigenschaften biochemischer Netzwerke dar: Weicht das Verhalten des simulierten Systems von dem des biologischen ab, kann nicht entschieden werden, ob dieses durch falsche Annahmen über die Struktur des Modells, und damit den zu Grunde liegenden qualitativen Eigenschaften des biologischen Systems, oder falsch gewählte Parameter bedingt ist. Dieses Simulations−Dilemma soll in diesem Projekt dadurch gelöst werden, daß die Parameter der Modelle basierend auf quantitativen zeitaufgelösten Daten bestimmt werden. Dabei wird die anfängliche Struktur der Modelle aus dem vorhandenen qualitativen biochemischen Wissen abgeleitet. Lassen sich experimentelle Daten nach einer Optimierung der Parameter nicht hinreichend erklären, erfordert dieses eine Revision der qualitativen biologischen Vorstellungen. In enger Kooperation zwischen Modellierern und Biologen sind dann Veränderungen und Erweiterungen der Modelle zu erarbeiten. Modelle, die die experimentellen Daten zureichend beschreiben, sind durch Vorhersagen der Ergebnisse unabhängiger Experimente zu validieren. Daß dieses Konzept zu realisieren ist, haben wir (Klingmüller, Timmer) für den JAK−STAT Signalübertragungsweg gezeigt (PNAS 100:1028, 2003). Analog zu der erfolgreichen Anwendung auf den JAK−STAT Signalübertragungsweg, werden wir im vorliegenden Projekt eine Modellierung mit gewöhnlichen deterministischen Differentialgleichungen anstreben. Für die Parameterschätzung in diesem Typ dynamischer Systeme stehen grundsätzlich etablierte Methoden zur Verfügung (Biophys. J. 74:1694, 1998; Biotech. & Bioeng. 78:89, 2002), die für die spezifischen Belange zu erweitern sind. Dies bezieht sich insbesondere auf statitische Methoden der Modellvalidierung, der Modellselektion und der Identifizierbarkeitsanalyse. Basierend auf diesen Modellen werden die systemwissenschaftlichen Analysen durchgeführt. Hierbei stehen Robustheitsanalysen und die Untersuchung von positiven wie negativen Rückkopplungsmechanismen im Zentrum des Interesses. Diese Arbeiten werden in Kooperation mit der Plattform Bioinformatik/Modellierung (Gilles, Heinrich) durchgeführt. Untersuchungen bezüglich des Bifurkationsverhaltens der Modelle werden mit Plattform Bioinformatik/Modellierung (Herzel) durchgeführt.
Eine Modellierung mit gewöhnlichen Differentialgleichungen betrachtet das zu Grunde liegende System als einen well−stirred reactor, eine Annahme, die für die hochstrukturierte Zelle mit ihren aktiven und passiven Transportmechanismen offensichtlich nicht zutrifft. Die Tatsache, daß gewöhnliche Differentialgleichungen erfolgreich zur Modellierung von biochemischen Netzwerken eingesetzt werden können, begründet sich darin, daß z.B. Transportphänomene häufig in gewöhnlichen Differentialgleichungen durch effektive Ratenkonstanten beschrieben werden können. In Kooperation mit der nationalen Plattform Bioinformatik/Modellierung (Kummer) wird dieses Phänomen untersucht, indem Ratenkonstanten durch Molecular Modeling bestimmt werden.
Ist dieser Ansatz erfolgreich, können durch ihn die Anzahl der aus experimentellen Daten zu bestimmenden Parametern reduziert werden.
Um langfristig Modelle im Rahmen partieller Differentialgleichungen zu erstellen, die räumliche Transport−Effekte (Science 295:488, 2002) realistischer erfassen, werden wir für ausgewählte Teilprojekte mittels Imaging Techniken die standardisierte Datengrundlage für eine explizit raumzeitliche Modellierung schaffen.
Speziell für geringe Konzentrationen von Signaltransduktionsmolekülen ist eine deterministische Modellierung nicht adäquat und es ist eine stochastische Beschreibung zu wählen. Die Parameterschätzung in stochastischen Differentialgleichungen ist methodisch sehr viel schwieriger als in deterministischen Systemen (Chaos, Solitons & Fractals 11:2571, 2000). In Kooperation mit der Plattform Bioinformatik/Modellierung (Kummer) werden wir Methoden zur stochastischen Modellierung entwickeln und auf experimentelle Daten anwenden.
Für spezielle Teilprojekte sind bereits gemeinsame Arbeiten zur Modellierung und Systemanalyse mit der Plattform Bioinformatik/Modellierung vereinbart. Zur Modellierung der zeitlichen Dynamik der Genexpression während der Leberregeneration werden wir in Kooperation mit der Plattform Bioinformatik/Modellierung (Herzel) mit Hilfe von Clusteranalysen eine Reduktion des Zustandsraumes durchführen, um eine datenbasierte dynamische Modellierung im Sinne des
"coarse grained reverse engineering" (Biosystems 55:129, 2000; J. Comp. Biol. 8:429, 2001) durchzuführen. Die Analyse des Insulin/IGF und des NF−κB−Signalweges wird in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. Gilles durchgeführt, der Wnt/β−Catenin Signalweg wird in Kooperation mit Prof. Heinrich modelliert. In beiden Arbeitsgruppen liegen umfangreiche Vorarbeiten zu diesen Signalwegen in Nicht−Hepatozyten vor. Hier stellt sich die für den systembiologische Ansatz im generellen maßgebliche Frage, inwieweit Modelle, die an einem Organismus entwickelt worden sind, auf einen anderen übertragen lassen. Die bisher entwickelten Modelle beruhen zum Teil auf in vitro Parametern und unterliegen somit dem eingangs diskutierten Simulations−Dilemma. Wir werden in enger Kooperation mit der Plattform Bioinformatik/Modellierung die in den bisherigen Modellierungen gewonnenen Erfahrungen in der Anwendung auf den Hepatozyten nutzen und speziell die Frage nach der Kombination von in vitro basierten und datenbasierten Modellen, die für den gesamten systembiologischen Ansatz von großem Interesse ist, untersuchen.
Die ermittelten Modelle werden in der Systems Biology Markup Language (SBML) (Bioinformatics 19:524, 2003) dem Netzwerk "Systembiologie" zur Integration in eine Life Model Database zur Verfügung gestellt.
Von der Metabolic Control Analysis zu Signaling und Genetic Control Analysis
Von zentralem Interesse für ein systembiologisches Verständnis der Signaltransduktion und der Genregulation ist die Entwicklung einer Theorie analog zur Metabolic Control Analysis, die sehr erfolgreich in der kinetischen Analyse metabolischer Netzwerke eingesetzt worden ist. Die nationale Plattform Bioinformatik/Modellierung (Heinrich) hat maßgeblich zur Entwicklung der Metabolic Control Analysis (MCA) beigetragen (Heinrich, R. and Schuster, S. The Regulation of Cellular Systems, Chapman and Hall, New York, 1996.). Die Herausforderung für eine
Übertragung der Konzepte der MCA auf Signaltransduktionskaskaden und Genregulationsnetzwerke besteht zum einen darin, daß in diesen nicht Stofflüsse, sondern Informationsflüsse die zentrale Rolle spielen; zum andereren müssen transiente, nicht−stationäre Dynamiken betrachtet werden. Für Signaltransduktionskaskaden sind die konzeptionellen Grundlagen dieser Theorie durch die nationale Plattform Bioinformatik/Modellierung (Heinrich) gelegt worden (Mol. Cell 9:957, 2002). Wir werden diese Konzepte in enger Kooperation weiterentwickeln, für genregulatorische Netzwerke verallgemeinern und auf experimentelle Systeme anwenden.
Standardized Operating Procedures der Isolation und Kultivierung primärer Hepatozyten Um die Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Übertragbarkeit der Ergebnisse datengestützter Modelle zu gewährleisten, werden die Standardized Operating Procedures (SOPs) bezüglich Isolierung und Kultivierung von Hepatozyten der nationalen Plattform für Zellbiologie in unserem Verbund auf das Maussystem adaptiert und etabliert (von Weizsäcker). In Absprache mit der Plattform Zellbiologie wird ist ein Kriterienkatalog erstellt, an Hand dessen die SOPs validiert werden. Diese Validierung wird auch für die Kryokonservierung von Hepatozyten zum Transport durchgeführt. Die von der Plattform Zellbiologie etablierten customized DNA−Microarrays für Ratte und Mensch werden auf das Mausgenom übertragen und zur Validierung der SOPs eingesetzt. Die standardisierte Isolierung und Kultivierung humaner Hepatozyten wird logistisch vorbereitet. Entsprechende Kollaborationen mit Chirurgen werden etabliert.
Signalübertragungswege der Hepatozytenregeneration
Die Regeneration von Hepatozyten ist gekennzeichnet durch eine initiale Phase, in der die Zellen Replikationskompetenz erhalten, eine Expansionsphase und eine terminierende Phase, in der die Zellen in den Ruhezustand zurückgeführt werden. Dieser dynamische Prozeß wird durch ein reguliertes Zusammenspiel zahlreicher Signalübertragungswege kontrolliert. Hierbei sind Zeitpunkt, Ausmaß und Dauer der Aktivierung der Kaskaden entscheidend.
Während der initialen Phase der Leberregeneration spielt das Zytokin IL−6 eine entscheidende Rolle und induziert unter anderem die Aktivierung des JAK−STAT Signalwegs. In Analogie zu unserem (Klingmüller, Timmer) dynamischen Modell des Kernmoduls des STAT−5 Signalweges, werden wir ein datengestütztes Modell der STAT−3 Signalkaskade einschließlich negativer Rückkopplungsmechanismen durch SOCS Proteine aufstellen (Klingmüller). Um das Modell zu validieren und Vorhersagen zu testen, werden Hepatozyten von leberspezifischen knock−out Mäusen, z.B. SOCS defizienten Tieren, eingesetzt.
Ein weiterer wesentlicher Faktor in der Initiationsphase der Leberregeneration ist der Tumor Nekrose Faktor TNF−α, der die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF−κB induziert. Wir werden die Modulation der NF−κB−abhängigen Gene in primären Hepatozyten nach Stimulierung mit TNF−α und nach Transduktion von Hepatozyten mit Konstrukten zur NF−κB−Überexpression und zur Expression des NF−κB−Inhibitors IκB untersuchen, die TNF−α vermittelten NF−kB−
Aktivierung und IκB−Degradierung in ihrer zeitlichen Dynamik erfassen und durch Imaging Methoden die Dynamik der Kern−Translokation von NF−κB untersuchen (Merfort, Sparna).
Weitere an der frühen Phase der Leberregeneration beteiligte Faktoren sind Insulin und IGF−1, die nach Bindung an ihre Rezeptoren die Tyrosin−Phophorylierung des Insulin Rezeptor Substrates (IRS) induzieren. Dies vermittelt die Bindung von signalleitenden Molekülen an das Adapterprotein und führt zur Aktivierung der Phosphoinositide−3 Kinase und der MAP Kinase Kaskade, für die
ein mathematisches Modell aufgestellt wird (Mohr).
Dieses Modell der MAP−Kinase werden wir (Nordheim, Schütz) um die vier weiteren Zweige der Kaskade und ihrer Wechselwirkungen erweitern, die die Aktivierung des Serum−Response Faktors (SRF), CREB und CREM regulieren. Diese Faktoren regulieren die Transkription von Genen, die einen G0−G1 Übergang im Zellzyklus von Hepatozyten initiieren. Die im Kern gebildeten Komplexe werden stadienspezifisch untersucht. Um die zu erstellenden dynamischen Modelle zu validieren, wird die Regeneration von Hepatozyten von Wildtyp Mäusen mit der von SRF und CREB defizienten Mäusen verglichen. Die SRF und CREB Defizienz wird durch konditionelle knock−outs oder knock−down per RNA interference erreicht. In Kooperation mit der Plattform Bioinformatik/Modellierung (Herzel) werden bioinformatische Promotoranalysen der Zielgene durchgeführt und die modulare Organisation von Transkriptionsfaktorbindungsstellen co−
regulierter Gene untersucht.
Neben einer Beteiligung an der Initiation der Proliferation durch die Aktivierung entsprechender Zielgene, bewirkt der Wnt/β−Catenin Signalweg während der initialen Phase der Hepatozyten−
Regeneration eine Verminderung des Zell−Zellkontaktes. Wir (Hecht) werden den schnellen Anstieg derβ−Catenin Konzentration in der initialen Phase der Regeneration quantifizieren, und in Zusammenarbeit mit der Plattform Bioinformatik/Modellierung (Heinrich), basierend auf deren Vorarbeiten zum Wnt/β−Catenin Signalweg in Oozytenextrakten des Krallenfrosches X. Laevis ein mathematisches Modell dieses Signalweges etablieren. Die Kerntranslokation wird in ihrer raumzeitlichen Dynamik durch Imaging Methoden einer Modellierung zugänglich gemacht.
Moduliert wird die Regeneration von Hepatozyten wird durch das FasL/Fas Liganden System, das einerseits Apoptose induzieren kann, aber in Gegenwart von Zytokinen wie HGF, EGF oder TNF−
α die Proliferation stimuliert. Wir (Borner) werden in einer ersten Phase die Komplexbildung and Aktivierung der beteiligten Kaspasen messen, um ein datenbasiertes dynamisches Modell der Fas induzierten Apoptose aufzustellen. In einem zweiten Schritt werden wir die Apoptose durch Zytokine hemmen und ein Modell der proliferativen Antwort erstellen.
Für den kontrollierten Ablauf der Regeneration ist eine präzise Terminierung dieses Prozesses von zentraler Bedeutung. Ein wichtiger Ligand in diesem Zusammenhang ist TGF−β,das nach Bindung an seine Rezeptoren die SMAD−Signalkaskade aktiviert. Durch Rezeptor−Rekrutierung wird SMAD Serin−phosphoryliert, bildet eine Komplex mit co−SMADs und transloziert in den Nukleus.
Dort interagiert der Komplex mit Transkriptionsfaktoren und reguliert die Transkription von von Zielgenen, die z.B. für extrazelluläre Matrixproteine kodieren. In Analogie zu dem dynamischen Modell für den STAT−Signalweg werden wir (Klingmüller) ein datenbasiertes Modell der SMAD Signalkaskade erstellen. Vorhersagen des Modells werden in SMAD−defizienten Hepatozyten von konditionellen knock−out Mäusen getestet.
Zur Untersuchung der Genregulation während der Regeneration werden wir nach partieller Hepatektomie zeitaufgelöste Expressionsprofile von Ovalzellen (Donauer/Walz) und komplettem Lebergewebe (Benz/Donauer) erstellen. Die Modellierung dieser Daten wird Faktoren identifizieren, die am Beginn der Organregeneration stehen. Zur Validierung der Modelle werden Schlüsselgene in vivo überexprimiert und die Dynamik der Regeneration mit den Vorhersagen der Modelle verglichen.
Für die Programmierung der Hepatozyten während der Regeneration ist das Zusammenspiel der vorgestellten Signaltransduktionswege entscheidend. Basierend auf den Modulen der einzelnen Signalkaskaden werden wir ein komplexes Modell erstellen, dessen Ziel der datenbasierte virtual hepatocyte ist.
Quantitative Meßmethoden
Nahezu jede Veröffentlichung im Bereich der Systembiologie der jüngsten Zeit endet mit der Forderung nach Entwicklung quantitativer Meßmethoden: "Current experimental techniques allow us to observe the predicted systems behavior only in a qualitative manner. To determine quantitative accuracy of our models, techniques that quantitatively and selectively measure biochemical reactions within the cell must be developed" (Science 297:1018, 2002). Daher ist die Erhebung quantitativer Daten ein zentrales Anliegen unseres Projektes.
Um datengestützte dynamische Modelle der zu untersuchenden Signalübertragungswege zu erstellen, werden wir simultan ligandeninduzierte Rezeptoraktivität und die Konzentrationen der involvierten signalübertragenden Proteine, inklusive ihrer posttranslationen Modifikationen, wie z.B. Phophorylierung, zeitaufgelöst quantitativ messen. Zu Beginn des Projektes werden wir hierzu etablierte biochemische Verfahren wie quantitatives Immunoblotting, radioaktives Labelling und Enzyme linked immunoassays (ELISA) verwenden. Diese Techniken sind in der Anzahl der simultan meßbaren Komponenten begrenzt. Es ist daher für den Ansatz einer datenbasierten Modellierung von zentraler Notwendigkeit, Techniken zur quantitativen zeitaufgelösten Proteinmessung im Hochdurchsatz zur Verfügung zu haben. Bezüglich der Meßtechniken stehen wir in Kontakt mit Dr. F. Lottspeich, MPI für Biochemie, Martinsried, vom BMBF Netzwerks Proteomics, der für diesbezügliche Diskussionen im Januar nach Freiburg kam. Wir kamen überein, daß die sehr vielversprechende ICAT−Technik, die vom BMBF Netzwerk Proteomics entwickelt wird, zum momentanen Zeitpunkt sowohl aus technischen als auch als finanziellen Gründen für einen Einsatz in unserem Projekt noch nicht geeignet ist. Es ist abgesprochen, im Rahmen von Fortsetzungsantägen diese Technologien in unser Konzept aufzunehmen. Im Rahmen dieses Antrag verfolgen wir die Entwicklung von Proteinarrays (Korf) in Kombination mit Nanopartikel−
Technologie (Nann). Die Erfahrung in der Entwicklung von DNA−Microarrays hat gezeigt, daß eine bioinformatische Standardisierung und Qualitätskontrolle bei diesen Technologien von größter Wichtigkeit ist, um verläßliche und reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten. In Kooperation mit der Plattform Bioinformatik/Modellierung (Herzel) werden wir (Huber) die Entwicklung der Proteinarrays von Beginn an bioinformatisch begleiten.
Zur Erfassung raumzeitlicher Phänomene der Signaltransduktion werden wir (Nitschke) moderne Imaging Techniken einsetzen. In diesem Projekt wird dabei die Untersuchung der Dynamik der Kern−Translokation ausgewählter Signaltransduktionsmoleküle im Mittelpunkt stehen.
Die erhobenen Daten werden allen Arbeitsgruppen des Netzwerkes "Systembiologie" zur Verfügung stehen.
Ausblick
Das vorliegende Projekt hat ein systembiologisches Verständnis des regenerierenden Hepatozyten zum Ziel. Langfristig soll dieser Aspekt des Hepatozyten mit den Arbeiten zum Metabolismus der Plattform Zellbiologie und den Arbeiten zur Detoxifikation des Stuttgarter Verbundes zusammengeführt werden und zu einem ganzheitlichen Bild des Hepatozyten führen. Die Untersuchungen zur Insulin vermittelten Signaltransduktion in unserem Konsortium schlagen hierzu eine erste Brücke zwischen Proliferationsverhalten und Metabolismus. Die Modellierung der MAP Kinase weist bereits eine Verbindung zur Phase II der Detoxifikation auf.
Detaillierte Arbeitspläne der einzelnen Teilprojekte:
Teilprojekt A:
Etablierung und Validierung der Standardized Operating Procedures (SOPs) zur Isolierung und Kultivierung primärer Hepatozyten
Projektleiter: PD. Dr. F. Von Weizsäcker
Grundvoraussetzung für systembiologische Analysen an Hepatozyten sind standardisierte Protokolle zur ihrer Isolierung und Kultivierung. So ist bekannt, daß Hepatozyten je nach Art ihrer Isolierung sowie Art und Dauer ihrer Kultivierung unterschiedliche Phänotypen aufweisen. U. a.
dedifferenzieren Hepatozyten mit zunehmender Kulturdauer. Es ist daher vorgesehen, daß die nationale Plattform für Zellbiologie Standard Operating Procedures (SOPs) erarbeitet, die allen Teilnehmern des Netzwerks zur Verfügung gestellt werden. In der initialen Phase der Förderung muß nun geprüft werden, wie vergleichbar Hepatozyten sind, die unter Anwendung der SOPs in unabhängigen Experimenten und verschiedenen Laboratorien gewonnen wurden. Zur Validierung soll ein gemeinsam erarbeiteter Katalog von Kriterien herangezogen werden, der quantitativ erfaßbare Merkmale differenzierter Hepatozyten beinhaltet (Phase I und Phase II Stoffwechsel, polarisierter Transport, Albuminsekretion und Glucosestoffwechsel). Ferner soll ein von der Plattform für Zellbiologie hergestellter Customchip verwendet werden, um die Expressionsprofile der verschiedenen Hepatozytenpräparationen humaner Zellen zu vergleichen. Analog dazu stellt unser Verbund einen 22k Maus−DNA microarray zur Verfügung.
Erstes Jahr:
Die von der Plattform Zellbiologie für Ratten− und humane Hepatozyten in Vorarbeiten entwickelten SOPs werden auf Maushepatozyten adaptiert. Basistechniken, wie die Kollagenaseperfusion von Lebern (Maus, Ratte, human) sind in Freiburg bereits etabliert. Der Mitarbeiter dieses Teilprojektes wird sich in den Laboratorien der Plattform Zellbiologie die zusätzlich benötigten zellbiologische Techniken aneignen. Die SOPs werden vor Ort etabliert, den Arbeitsgruppen des Verbundes standardisiertes Zellmaterial zur Verfügung zu stellen, resp. diese beim Etablieren der Kultivierungsbedingungen zu unterstützen. Ferner dient dieses Vorgehen zur unabhängigen Validierung der SOPs und der Möglichkeit einer genaueren Analyse der Folgen des Transports von primären Hepatozyten. An die jeweiligen Teilprojekte des Freiburger Konsortiums angepaßt, sollen die SOPs in Kollaboration mit der Plattform Zellbiologie iterativ weiterentwickelt und optimiert werden.
Zweites Jahr:
Neben der systembiologischen Analyse regenerierenden Hepatozyten soll auch die Terminierung dieses Prozesses untersucht werden. Entsprechend soll zunächst die Stimulation der Hepatozytenproliferation im Kontext spezieller Signaltransduktionswege in vitro untersucht werden. nschließend wird überprüft, ob und wie diese Prozesse durch Veränderung der physiologischen Kulturbedingungen beeinflußt werden. In Zusammenarbeit mit der Plattform für Zellbiologie sollen folgende Parameter, die den Differenzierungsstatus von kultivierten Hepatozyten beeinflussen, untersucht werden: die Zusammensetzung der extrazellulären Matrix, die Matrixgeometrie und die An− bzw. Abwesenheit kokultivierter Nichtparenchymzellen. Langfristig soll der Minibioreaktor, der von der Plattform Zellbiologie entwickelt wird, in unserem Verbund als Verfahren zur Kultivierung unter physiologischen Oxygenierungsbedingungen etabliert und validiert werden, um statische und dynamische Kultivierungsbedingungen zu vergleichen.
Drittes Jahr:
Nach logistischen Vorbereitungen zur Bereitstellung von humanem Lebermaterial in den ersten beiden Jahren werden im dritten Jahr die SOPs für primäre humane Hepatozyten im Freiburger Konsortium etabliert und validiert.
Personalbedarf:
Zum Transfer der Standardized Operating Procedures (SOPs) von der Plattform Zellbiologie in unseren Verbund, für die Validierung der Prozeduren und die Bereitstellung standardisierter Hepatozyten für die Projekte unseres Verbundes wird eine Technische Assistentin (BAT V) beantragt. Es werden 5.000 E Reisemittel für 3 Jahre beantragt.
Verbrauchsmittel:
Es werden für 3 Jahre 30.000 E Verbrauchsmittel für Isolierung (Kollagenase, HepatoStim Kulturmedium) und Kultivierung (definierte serumfreie Kulturmedien, kollagenbeschichtete Zellkulturschalen, Cortison, DMSO, Insulin, EGF, Glukagon) von primären Hepatozyten und die Validierung des SOPs (Assays in Abstimmung mit der Plattform Zellbiologie zur Messung von Phase I und Phase II Stoffwechselwegen, polarisiertem Transport, Albuminsekretion und Glucosestoffwechselwegen) beantragt.
Teilprojekt B1:
Dynamische Modellierung der JAK/STAT und SMAD Signaltransduktionskaskaden in primären Hepatozyten
Projektleiterin: PD Dr. U. Klingmüller
Für den kontrollierten Wachstumsprozeß der Leberregeneration ist Zeitpunkt und Ausmaß der Aktivierung bestimmter Signaltransduktionswege entscheidend. Wesentlich für die initiale Phase der Leberregeneration ist die Interleukin (IL)−6 vermittelte Aktivierung der JAK−STAT3 Signaltransduktionskaskade, während TGF−β durch Aktivierung des SMAD Signalwegs die Induktion von extrazelluläre Matrix kodierenden Genen vermittelt und damit eine kontrollierte Termination gewährleistet.
Erstes Jahr:
(a) Übertragung des mathematisches Model des JAK−STAT5 Kernmoduls auf die JAK−STAT3 Signaltransduktionskaskade. Als Input−Funktion werden wir die gp130 Phosphorylierung in Folge der Ligandenbindung durch quantitatives Immunoblotting messen. Simultan erhobene Änderungen in der Gesamtmenge und der phosphorylierten Form von STAT3 im Zytoplasma werden zur Schätzung der dynamischen Parameter eingesetzt (Teilprojekt D2). Die zeitaufgelösten quantitativen Daten werden im Abstand von 0.5 bis 2 Minuten für einen Beobachtungszeitraum von 60 Minuten generiert. Diese Studien werden zunächst in der faktorabhängigen Zell−Linie BaF3 durchgeführt, die chimäre gp130 Rezeptoren, STAT3 und TGF−βRezeptoren exprimiert. Um das mathematische Model zu erweitern und das dynamische Verhalten im Kern zu erfassen, werden wir nach zelluläre Fraktionierung quantitative Messungen in zytoplasmatischen und nukleären Extrakten durchführen
(b) Analoge Übersetzung der SMAD Signaltransduktionskaskade in gekoppelte Differentialgleichungen (Teilprojekt D2). Die Quantifizierung der Aktivierung des TGF−β Typ I Rezeptors wird als Input−Funktion eingesetzt und zur Abschätzung der dynamischen Parameter wird die Menge an phosphoryliertem und unphosphhoryliertem SMAD2 und SMAD3 im Zytoplasma bestimmt. Wir werden die Auswirkung verschiedener
Wachstumsfaktorkonzentrationen auf das dynamische Verhalten des Systems testen. Die Messungen werden in Zeitintervallen von 2 bis 5 Minuten für einen Beobachtungszeitraum von 120 Minuten durchgeführt. Für die Etablierung experimenteller Bedingungen und Nachweismethoden werden die Studien anfänglich mit der faktorabhängigen Zell−Linie BaF3 durchgeführt.
(c) Zur Generierung von zeitaufgelösten quantitativen Daten werden wir quantitatives Immunoblotting basierend auf Chemielumineszenz und Detektion mittels LumiImager (Roche Diagnostics) einsetzen. Um eine Hochdurchsatzanalyse zu ermöglichen, werden wir in Zusammenarbeit mit Dr. Korf und Dr. Nann quantitative Proteinarrays etablieren. Dafür werden wir damit beginnen, Monoklonale Antikörper herzustellen, die spezifisch die phosphorylierte oder unphosphorylierte Form von STAT3, JAK1, SMAD2, SMAD3, TGF−β Typ I Rezeptor erkennen.
(d) In Zusammenarbeit mit Teilprojekt A werden wir die mit der nationalen Plattform Zellbiologie abgestimmten standardisierten Bedingungen für die Präparation und Kultivierung von primären Hepatozyten etablieren.
Zweites Jahr:
(a) Etablierung zeitaufgelöster quantitativer Daten für die IL−6 induzierte Aktivierung von gp130 und STAT3 in primären Hepatozyten zur Überprüfung und gegebenenfalls Verbesserung des dynamischen Models des JAK−STAT3 Signalwegs in Kooperation mit Teilprojekt D2.
(b) Etablierung zeitaufgelöster quantitativer Daten für die TGF−β induzierte Aktivierung von TGF−β Typ I Rezeptor, SMAD2 und SMAD3 in primären Hepatozyten zur Überprüfung und gegebenenfalls Verbesserung des dynamischen Models des SMAD Signalwegs in Kooperation mit Teilprojekt D2.
(c) Vergleich sowohl der Empfindlichkeit und Linearität der Detektion als auch der Spezifität von quantitativem Immunoblotting versus quantitativen Proteinarrays. Dieses wird Standards der Vergleichbarkeit der Messergebnisse dieser beiden verschiedenen Technologien etablieren.
Drittes Jahr:
(a) Erweiterung des mathematischen Models für den JAK−STAT3 Signalweg durch Einbeziehen negativer Rückkopplungsmechanismen. Dafür sollen vergleichende Messungen mit Wildtyp Hepatozyten und Hepatozyten, denen spezifisch in der Leber die Tyrosinphosphatase SHP2 oder der negative Regulator SOCS3 fehlen, durchgeführt werden. Diese sollen von leberspezifischen konditionellen Knock−out Mäusen gewonnen werden, die im Rahmen des Teilprojekts B9 hergestellt werden.
(b) Ergänzung des mathematischen Models für den SMAD Signalweg durch negative Rückkopplungsmechanismen. Dafür sollen vergleichende Messungen mit Wildtyp Hepatozyten und Hepatozyten, denen spezifisch das inhibitorische SMAD7 fehlt, durchgeführt werden. Die leberspezifische SMAD7 Knock−out Mauslinie wird im Rahmen des Teilprojekts B9 hergestellt.
(c) Quantitative Messung von Signaltransduktionskomponenten mittels quantitativer Proteinarrays.
(d) Wechselseitige Beeinflussung der JAK−STAT3 Signaltransduktionskaskade durch Kostimulation mit TGF−βbzw. der SMAD Signaltransduktionskaskade durch Vorbehandlung mit IL−6 und Verknüpfung der mathematischen Modelle (Teilprojekt D2). Vorhersage und experimentelle Validierung von Eingriffsmöglichkeiten in den kontrollierten Wachstumsprozeß der Leberregeneration.
Begründung des Personalbedarfs:
BAT IIa (2 x BATIIa/2): Für die parallele Analyse der JAK−STAT3 und SMAD Signaltransduktionswege ist entweder ein sehr erfahrener Postdoktorand oder zwei Doktoranden nötig. Es werden Reisemittel in Höhe von 5000 E für 3 Jahre beantragt.
Begründung des Sachmittelbedarfs:
Für dieses Projekt werden 50.000 E für 3 Jahre beantragt. Dabei werden für die Isolierung, Kultivierung und gezielte Stimulation von primären Maushepatozyten 25.000 E für Kollagenase, HepatoStim−spezial Medium, Kollagen−beschichtete Zellkulturschalen, Hepatocyte Attachment Medium, Fötales Kälberserum, Insulin, Glucagon, Inosin, Pyruvat, EGF, IL−6 und TGF−β veranschlagt. Für die biochemische Analyse mittels quantitativem Immunoblotting werden 15.000 E für Antikörper (anti− STAT3, anti−pSTAT3, anti−JAK1, anti−gp130, anti−SMAD2, anti−
pSMAD2, anti−SMAD3, anti−TGF−β−TypI Rezeptor, anti−pTGF−β−TypI Rezeptor, anti−TGF−β TypII Rezeptor), Protein A Sepharose, Nitrocellulose bzw. PVDF−Membran und für Chemielumineszenz Reagenzien benötigt. Außerdem wird es für das quantitative Immunoblotting und die Entwicklung zuverlässiger quantitativer Proteinarrays wichtig, sein hochspezifische monoklonale Antikörper herstellen zu lassen. Dafür werden 5.000 E geplant. Für die Haltung, Expansion und Zielverpaarung von Mäusen für die Präparation primärer Hepatozyten werden Tierhaltungskosten von 5.000 E veranschlagt.
Teilprojekt B2:
Dynamische Modellierung der transkriptionellen Aktivität von NF−κB in Hepatozyten Projektleiter: Prof. Dr. I. Merfort, Dr. T. Sparna
Ein wesentlicher Faktor in der Initiationsphase der Leberregeneration ist der Tumor Nekrose Faktor TNF−α der nach Rezeptorbindung die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF−κΒ ιnduziert.
Dieser liegt im Zytoplasma in einer inaktiven Form gebunden an die inhibitorische Untereinheit IκB, vor. Nach Aktivierung stimuliert NF−κΒ die Transkription verschiedener Gene, z.B. IL−6, STAT3 und c−myc und fördert auf diese Weise die DNA Replikation von Hepatozyten. Das NF−
κΒ−IκΒ Signalmodul stellt ein negativrückgekoppeltes Signaltransduktionsnetzwerk dar, das abhängig von der Dynamik des Stimulus ein bimodales Antwortverhalten in der Genexpression zeigen kann (Science 298:1241, 2002).
Erstes Jahr:
Wir werden die Modulation der NF−κB−abhängigen Gene in primären Hepatozyten einerseits nach Stimulierung mit TNF−α und andererseits nach transienter Transfektion von Hepatozyten mit Konstrukten zur NF−κB−Überexpression und zur Expression des NF−κB−Inhibitors IκB untersuchen. In Kooperation mit Teilprojekt B7 werden zeitabhängige Genexpressionsprofile mit Hilfe von Microarrays generiert. Die Überprüfung der erhaltenen Ergebnisse wird mittels quantitativer PCR durchgeführt. Dadurch werden die im Verlauf des Regenerationsprozesses induzierten Zytokine identifiziert.
Zweites Jahr:
Wir werden die TNF−α−vermittelten NF−κB−Aktivierung und IκB−Degradierung in ihrer zeitlichen Dynamik in murinen Hepatozyten quantifizieren. Ferner wird die zeitabhängigen Freisetzung von IL−8 bestimmt. Die Quantifizierung erfolgt per EMSA mittels Phosphoimager, durch Immunoblotting mittels Chemiluminescence und LumiImager, und durch Protein−Arrays (Teilprojekt C1) in Kombination mit Nanopartikeln (Teilprojekt C2).
Drittes Jahr:
Wir werden die Modulation des NF−κB−Signalweges während der Regeneration untersuchen.
Speziell wird die Beeinflussung der Dynamik der Expression der an der Regeneration beteiligten
Zytokine durch hepatoprotektiven Substanzen, z.B. Silybin, untersucht. Ferner werden Imaging Methoden (Teilprojekt C3) eingesetzt werden, um die Dynamik der Kern−Translokation von NF−
κB zu untersuchen.
Die erhobenen Daten werden genutzt, um in ein dynamisches Modell der NF−κB Aktivierung in Hepatozyten zu erstellen (Teilprojekt D2).
Für die Durchführung des Projektes sind zwei Doktoranden (2 BATIIa/2) vorgesehen.
Verbrauchsmittelkostenaufstellung für 3 Jahre:
Antikörper (IκB, p65/NF−κB) 9000 E Elektrophorese (Acrylamid/Puffer): 1000 E
Enzyme: 5000 E
Zellkulturmedien für Hepatozyten: 4000 E
Gewebekulturen: 4000 E
Glaswaren: 1000 E
Isotope: 2000E
Nylonmembranen: 2000 E
Fluoreszenzfarbstoffe: 4000 E
Microarray Herstellung 8000 E
Microarray Hybridisierung: 8000 E
RNA Präparation: 2000 E
Summe: 50000 E
Es werden Reisemittel für 3 Jahre in Höhe von 5000 E beantragt.
Teilprojekt B3:
Insulin und IGF−1 vermittelte Signaltransduktion in Hepatozyten Projektleiter: Dr. L. Mohr
Mitogene Signale des Insulin−/IGF−1 Systems spielen eine zentrale Rolle bei der Leberregeneration. Nach Bindung von Insulin bzw. IGF−1 an den Insulinrezeptor (IR) erfolgt die Autophosphorylierung des Rezeptors mit Aktivierung der Rezeptor−Tyrosinkinase. Nach Bindung der multifunktionellen Adaptermoleküle IRS−1 und IRS−2 sowie von Shc an den aktivierten IR kommt es zu einer Tyrosinphospholylierung der Adaptermoleküle an einer Vielzahl von Tyrosinresten, was zu einer weiteren Bindung und Aktivierung verschiedenster Signaltransduktionmoleküle führt. Dies resultiert in einer Aktivierung der zellulären PI3’Kinase und der MAP−Kinasen ERK1/2. Das Ziel des hier beantragten Vorhabens ist die detaillierte Gewinnung von Daten bezüglich einzelner Schritte der Insulin und IGF−1 vermittelten Signaltransduktion in primären Hepatozyten. Diese quantitativen und zeitaufgelösten Daten sollen dann die Grundlage für eine mathematische Modellierung des Insulin und IGF−1 Signaltransduktionsweges in primären Hepatozyten darstellen.
Erstes Jahr:
Primäre Maus−Hepatozyten werden nach den SOPs der nationalen Plattform Zellbiologie in Kultur genommen und auf ihre Homogenität und Differenzierung überprüft (Teilprojekt A). Diese
Hepatozytenkulturen dienen dann zur Charakterisierung der Kinetik einzelner gut quantifizierbarer Schritte der Insulin bzw. IGF−1 vermittelten Signaltransduktion. Nach mehrfachem Waschen der Hepatozytenkulturen und "hungern" der Zellen in wachstumsfaktorfreiem Medium erfolgt die Stimulation mit Insulin bzw. IGF−1. Es werden verschiedene Dosierungen im Rahmen physiologischer Konzentrationen eingesetzt. Die Hepatozyten werden anschließend zu genau festgelegten Zeitpunkten (Intervalle von ca. 1−2 min über 30−60 Minuten) geerntet und Zell−
Lysate hergestellt. Mittels dieser Zell−Lysate werden folgende Teilschritte der Insulin / IGF−1 vermittelten Signaltransduktion untersucht.
1. Autophosphorylierung des Insulinrezeptors nach Insulin / IGF−1 Exposition: Durch Immunpräzipitation (IP) des Insulinrezeptors (anti IR−AK) aus den Zell−Lysaten gefolgt von quantitativem Immunoblotting (Chemilumineszenz−Imaging) mittels anti−Phosphotyrosin Antikörpern (anti PY) wird eine Kinetik der Insulinrezeptor−Phosphorylierung in Abhängigkeit von den eingesetzten Insulin / IGF−1 Konzentrationen erstellt.
2. Bindung und Phophorylierung von IRS−1/2 an die phosphorylierten Insulinrezeptoren:
Durch IP mittels anti IR−AK und anschließend quantitatives Immunoblotting zur Bestimmung der koimmunopräzipitierten IRS−1/IRS−2 Adaptermoleküle. Anschließend erfolgt die Quantifizierung der Phosphorylierungskinetik der koimmunopräzipitierten IRS−1/IRS−2 Moleküle mittels anti PY.
Zweites Jahr:
Die Arbeiten des zweiten Jahres umfassen:
3. Bindung von Shc an die phosphorylierten IGF−1− bzw. Insulinrezeptoren:
Nach IP mit anti IR−AK erfolgt ein quantitatives Immunoblotting mittels anti−Shc AK.
4. Bindung von SH2−Domänen enthaltenden Signaltransduktionsproteinen an die koimmunopräzipitierten IRS−1/IRS−2 Adaptermoleküle:
Quantifizierung von an IRS−1/IRS−2 gebundenem Grb2/SOS, p85 PI3’Kinase und SHP2 und ihrer Bindungskinetik an IRS−1/IRS−2.
Drittes Jahr:
5. Analyse (Quantifizierung und Kinetik) der PI3’Kinase (PI3’K) Aktivierung sowie der MAPK−
Aktivierung in Maus Hepatozyten nach Insulin / IGF−1 Exposition:
Die Aktivität der IRS−1/IRS−2 assoziierten PI3’ K wird mittels eines PI3’K−Assays bestimmt und mit der zellulären Gesamt PI3’K Aktivität quantitativ verglichen. Mittels Antikörpern gegen aktivierte MAPK wird zudem die Kinetik der MAPK−Aktivierung nach Insulin/IGF−1 Exposition durch quantitatives Immunoblotting determiniert.
Die Modellierung des Insulin / IGF−1 Signaltransduktionswegs in Hepatozyten auf Grund der erhobenen Primärdaten erfolgt in enger Kooperation mit Teilprojekt D2 und der Plattform für Bioinformatik/Modellierung (Gilles).
Personalbedarf:
BAT IIa/2 (biologischer Doktorand/Doktorandin mit methodischer Vorerfahrung auf den Gebiet der Signaltransduktion) für den gesamten Zeitraum zur präzisen Analyse der Insulin/IGF−1 vermittelten Signaltransduktion sowie zur aktiven Mitwirkung an der Erstellung des mathematischen Modells.
Sachmittel:
Für quantitatives Immunoblotting und für Immunpräzipitationen werden große Mengen spezifischer Antikörper gegen Phosphotyrosin (anti PY), Insulinrezeptor (anti IR−AK), IRS−1 und IRS−2, Shc, Grb2, p85 PI3’Kinase, SHP2 sowie gegen die nativen und phosphorylierten Formen der MAP−Kinasen Erk1 und Erk2 benötigt. Weiterer Sachmittelbedarf besteht für Protein A
Sepharose, Nitrocellulose bzw. PVDF−Membran, Reagenzien für Chemielumineszenz, fötales Kälberserum sowie spezielle Zellkulturmedien für primäre Hepatozyten sowie Zellkulturplatten und Pipetten. Hierfür werden 30.000 E für drei Jahre beantragt.
Reisemittel: Es werden 5000 E für 3 Jahre beantragt.
Teilprojekt B4:
Funktion der Transkriptionsfaktoren CREB und SRF in der Leberregeneration.
Projektleiter: Prof. Dr. G. Schütz, Prof. Dr. A. Nordheim
Partielle Hepatektomie oder auch toxische Verletzung der Leber (durch CCl4 Behandlung) initiieren ein exakt reguliertes hepatozelluläres Regenerationsprogramm, unter sofortiger Aktivierung von Transkriptionsfaktoren und der einhergehenden Stimulation von Genen, den sogenannten "immediate−early" Genen (IEGs) (Science 276:60, 1997). Dabei stimulieren die von Kupferzellen sekretierten Zytokine TNF−α(Teilprojekt B2) und IL−6 (Teilprojekt B1) den Eintritt der ruhenden Hepatozyten in den aktiven Proliferationszyklus. Die IEG Aktivierung erfolgt in den Hepatozyten sofort, d.h. in den ersten Stunden nach partieller Hepatektomie und benötigt keine zelluläre de novo Proteinsynthese. Einige IEGs kodieren für Transkriptionsfaktoren, wie c−Fos, c−
Jun, c−Myc, Egr−1, Ets−2 und C/EBPs. Die Transkriptionsfaktoren CREB and SRF sind wichtige Regulatoren der IEG Antwort. Die Funktion von CREB und SRF in der Leberregeneration wurde bisher nicht systematisch analysiert. SRF Aktivität verlangt DNA Bindung an das regulatorische Serum−Response−Element (SRE) und nutzt dabei die Interaktion mit Partnerproteinen, den TCF Proteinen, die vom MAP Kinase Signalnetzwerk aktiviert werden. CREB wird ebenfalls durch MAPK Signalgebung reguliert. Während der Leberregeneration wird die Phosphorylierung von CREB induziert und die Homologen CREM Proteine werden vermehrt exprimiert. Zusätzlich ist bekannt, daß durch partielle Hepatektomie mehrere Zielgene von CREB aktiviert werden. SRF und CREB kooperieren bei der Aktivierung verschiedener IEGs, z. B. c−fos. Die Signalwege, die zur Aktivierung von CREB und SRF während der Leberregeneration führen sind unbekannt.
Wir werden die Funktion von CREB und SRF in der Leberregeneration durch konditionale, Hepatozyten−spezifische Deletion ("knock−out Mutagenese") der Creb und Srf Gene im Genom der Maus analysieren. Die entsprechenden Mausstämme mit "gefloxten" Loci für entweder Creb (im Crem(−/−) genetischen Hintergrund) oder Srf wurden bereits in Heidelberg und Tübingen erzeugt und Albumin−Cre Tiere, die die Rekombinase Cre spezifisch in Hepatozyten exprimieren, stehen für die notwendigen Verpaarungen zur Verfügung. Die genetischen, molekularbiologischen und biochemischen Methoden zur phänotypischen und funktionellen Charakterisierung der erzeugten Mäuse und Hepatozyten−Linien sind etabliert.
Mäuse mit Deletionen der Creb bzw. Srf Gene in der Leber werden einer phänotypischen Charakterisierung hinsichtlich Vitalität/Mortalität, Lebermorphologie, Leberfunktion und Regenerationspotential der Leber unterzogen. Die Studien werden durch die Erstellung von RNA Expressionsprofilen (Affymetrix GeneChip System) in den frühen Phasen der Leberregeneration ergänzt, um Schlüsselgene zu identifizieren, die von CREB und/oder SRF reguliert werden und für die Leberregeneration von Bedeutung sind.
Wir werden die Signalkaskaden identifizieren, die diese Zielgene aktivieren und wir werden die Funktionen dieser Signalkaskaden hinsichtlich der Proliferationskontrolle von (explantierten) Hepatozyten mit Hilfe spezifischer pharmakologischer Inhibitoren charakterisieren. Diese Systeme gestatten eine quantitative und kinetische Charakterisierung der Leberregeneration der Maus hinsichtlich
• essentieller genregulatorischer Prozesse und deren Steuerung (unter Einsatz von "nuclear run−on" Techniken, RT−PCR, phospho−spezifischer anti−SRF und anti−CREB Antiseren),
• beteiligter Signalprozesse (unter Nutzung aktivitätsspezifischer Antikörper gegen Kinasen)
• dynamischer Veränderungen von Protein−Phosphorylierungsmustern (unter Nutzung phospho−spezifischer Antiseren gegen verschiedene regulatorische Proteine).
Der hier präsentierte experimentelle Ansatz kombiniert molekulargenetische, molekularbiologische, biochemische und zellbiologische Strategien, die für eine systembiologisch orientierte, funktionelle Beschreibung des Prozesses der Leberregeneration im Rahmen der Teilprojekte D1 und D2 zur Verfügung gestellt werden.
Experimentalprogramm (3 Jahre)
−Mausgenetik (9−12 Monate): Verpaarung der Albumin−Cre−Maus mit der CREBflox (im CREM−/− Hintergrund) Maus oder der Srfflox Maus.
−Phänotypische Analyse (6 Monate): Vitalität/Mortalität, Lebermorphologie, Leberfunktion
−Leberregeneration in "knock−out" Tieren (partielle Hepatektomie): 6−9 Monate,
−Erstellung von Genexpressionsprofilen/Identifizierung von CREB/SRF Zielgenen: 6−9 Monate
−In vitro Kultivierung von CREB−defizienten und SRF−defizienten Hepatozyten: 3−6 Monate
−Quantitative und kinetische Charakterisierung von Signalkaskaden und genregulatorischen Prozessen. (3 Jahre)
Nutzung von phospho−spezifischen Antiseren gegen Komponenten
(a) des MAPK Netzwerks (anti−P−Erk, anti−P−JunK, anti−P−p38, anti−P−MK2, anti− P−pp90), (b) der Ca++−Signalwege (anti−P−CamKII) und
(c) der cAMP Signalgebung (anti−PKA).
Zur pertubativen Untersuchung dieser Signalübertragungswege werden folgende Inhibitoren eingesetzt: PD98059, U0126, SB203580.
Kostenkalkulation für 3 Jahre:
Gruppe Schütz (Heidelberg): 1x BAT V (TA)
Tierhaltung 10.000,−
GeneChips (Affimetrix) 22.000,−
Verbrauchsmaterialien 8.000,−
Reisen 2.500,−
Gruppe Nordheim (Tübingen): 1x BATIIa/2 (Doktorand)
Tierhaltung 15.000,−
Verbrauchsmat. / Biochem. 15.000,−
Reisen 2.500,−
Teilprojekt B5:
Dynamische Modellierung des Wnt/β−Catenin−Signalwegs während der Leberregeneration Projektleiter: PD Dr. A. Hecht
Der Wnt/β−Catenin−Signalweg spielt bei der progressiven Determinierung von Organen endodermalen Ursprungs wie der Leber eine entscheidende Rolle. Im Zuge der Regeneration nach 70%−iger Hepatektomie wird β−Catenin innerhalb von 5 Minuten aktiviert und wandert in den Zellkern. Eine Deregulation und damit Hyperaktivierung des β−Catenin−Signalwegs durch genetische Läsionen wird in bis zu 50% von Hepatoblastomen und hepatozellulären Karzinomen beobachtet. Aus diesen Beobachten läßt sich ableiten, daß eine streng regulierte Induktion wie auch Termination des Wnt/β−Catenin Signalwegs essentiell für die Gewebehomäostase der Leber ist.
Dabei beruhen zelluläre Antworten auf Wnt−Stimuli in Veränderungen der Genexpression, die durch die Aktivität von β−Catenin/T−Cell Factor−Komplexen hervorgerufen wird. Allerdings sind die Prozesse, die der cytoplasmatischen Aktivierung von β−Catenin und seinen Funktionen im Zellkern zugrunde liegen, in ihren Einzelheiten und wechselseitigen Abhängigkeiten bislang nicht verstanden. Ziel des Projektes ist daher die dynamische Modellierung von Abläufen, die während der Leberregeneration zur transkriptionellen Induktion von Wnt/β−Catenin Zielgenen und deren nachfolgender Abschaltung führen. Dabei wird initial eine vergleichende Analyse und Validierung von Modellen für cytoplasmatische Aspekte des Wnt/β−Catenin−Signalwegs vorgenommen, die von der nationalen Plattform (Heinrich) anhand eines in vitro Systems aus Oozytenextrakten des Krallenfrosches X. laevis formuliert wurden.
Erstes Jahr:
Zeitabhängige und quantitative Erfassung der intrazellulären Verteilung von β−Catenin:
Wnt−Stimulation führt zur Stabilisierung von β−Catenin, damit verbunden zu einem Anstieg der cytoplasmatischen Menge vonβ−Catenin, und schließlich zu seiner Translokation in den Zellkern.
Zur Aktivierung des Wnt/β−Catenin Signalübertragungswegs werden Hepatozyten mit Wnt−
konditioniertem Medium versetzt. Alternativ kann der Wnt−Signalweg durch Zugabe von 20 mM LiCl zum Medium aktiviert werden. Nach differentieller Detergens−Fraktionierung von Zelllysaten und quantitativen Western Blot Analysen werden die Gesamt−Menge an β−Catenin, der membrangebundene Anteil, der cytoplasmatische, lösliche Anteil, sowie die nukleäre Fraktion des Proteins bestimmt. Durch Messungen zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach Wnt−Stimulation werden dynamische Verschiebungen der Proteinmengen innerhalb der verschiedenen β−Catenin−
Fraktionen quantitativ bestimmt. Zusätzlich zu den biochemischen Analysen wird die intrazelluläre Verteilung und Relokation von β−Catenin durch Immunfluoreszenz verfolgt und quantifiziert. In diese Untersuchungen werden weitere kritische Komponenten des Wnt−Signalwegs miteinbezogen, die an cytoplasmatischen Aspekten der β−Catenin−Regulation beteiligt sind: Hierzu zählen Dishevelled, Axin, APC, Casein Kinase I, und β−TrCP. APC kann auch zwischen Cytoplasma und Zellkern wechseln, und dient als Carrier zur Ausschleusung vonβ−Catenin aus dem Zellkern. APC ist daher möglicherweise Bestandteil einer negativen Rückkopplungsschlaufe. Mehrfach−
Markierungen von Zellen mit Antikörpern gegen diese verschiedenen Proteine werden Aufschluß über Wnt−abhängige Veränderungen von Kolokalisation und Komplexbildung bzw.
Komplexauflösung dieser Faktoren geben. Die Kerntranslokation wird in ihrer raumzeitlichen Dynamik in Kooperation mit Teilprojekt C3 untersucht.
Zweites Jahr:
Zeitabhängige und quantitative Bestimmung von Interaktionen zwischen β−Catenin und T−Cell Faktoren (TCF):
Die Interaktion zwischen β−Catenin und den TCF Proteinen im Zellkern wird durch Coimmunpräzipitation untersucht. Hierzu werden β−Catenin−TCF−Komplexe aus unstimulierten Zellen, sowie zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Wnt−Stimulation aus Zelllysaten gefällt. Die jeweils vorhandenen β−Catenin−TCF−Komplexe werden durch Western Blot Analysen qualitativ und quantitativ verfolgt. Darüberhinaus werden die Hepatozyten mit Hilfe lentiviraler Vektoren transduziert, die β−Catenin−YFP(YN) und TCF4−YFP(YC) Fusionsproteine exprimieren. Die transduzierten Hepatozyten werden Wnt−stimuliert, und die β−Catenin−TCF Interaktion durch bimolekulare Fluoreszenz−Komplementation (Hu et al., Mol. Cell 2002, 9,789−798) der Fusionsproteine zeitaufgelöst und quantitativ analysiert.
Drittes Jahr:
Analysen zur temporären Ausbildung multifaktorieller Proteinkomplexe an Promotoren von Wnt/β−Catenin Zielgenen:
Die Wnt−induzierte Besetzung von Promotorelementen von Zielgenen wird zeitaufgelöst durch Chromatin−Immunpräzipitation quantifiziert. Durch Einsatz verschiedener Antikörper gegen β−
Catenin, T−Cell Faktoren, und Komponenten der allgemeinen Transkriptionsmaschinerie werden gleichzeitige und sequenzielle Interaktionen sichtbar.
Bestimmung der transkriptionellen Aktivierung von Wnt/β−Catenin Zielgenen:
Die nukleäre Akkumulation von β−Catenin und seine Interaktion mit TCF Proteinen, sowie die Besetzung von Promotorelementen ihrer Zielgene soll mit dem Verlauf der transkriptionellen Aktivierung dieser Gene korreliert werden. Hierzu wird die Promotoraktivität der Interleukin−8, Cyclin D1 und c−MYC Gene durch quantitative Echtzeit−PCR vor Wnt−Stimulation und zu verschiedenen Zeitpunkten nach Wnt−Stimulation bestimmt.
Die aus diesen Untersuchungen gewonnenen Daten werden durch Teilprojekt D2 in enger Kooperation mit der Plattform Bioinformatik/Modellierung (Heinrich) für integrative mathematische Modellierungen der cytoplasmatischen und nukleären Schenkel des Wnt/β−Catenin Signalwegs verwendet. Auf deren Basis werden qualitative und quantitative Vorhersagen über Abläufe und möglicherweise bislang unbekannte Komponenten oder Schritte des Signalwegs gemacht werden.
Personalbedarf:
Für das Projekt wird eine Doktorandenstelle (BAT IIa/2) beantragt.
Reisemittel:
Für Kongressbesuche und wissenschaftliche Kooperationen im Rahmen des Projekts werden Reisemittel in Höhe von 5000.− E für 3 Jahre beantragt.
Sachmittel:
Beim geplanten Projekt entstehen hohe Kosten durch umfangreiche Zellkulturarbeiten, für die Beschaffung von Antikörpern, sowie durch proteinbiochemische Verfahren. Deshalb werden für die drei Jahre des Vorhabens 50.000 E für folgende Verbrauchsmaterialien beantragt:
Zellkultur: 12000 E
Flüssigmedien, fötales Kälberserum, Penicillin/Streptomycin, Glutamin, HEPES, Pyruvat, MEM non−essential Aminosäuren, Trypsin−Lösung, Transfektionsreagenzien
Proteinbiochemie: 10000 E
Affinitätsmatrizes (Protein A− und Protein G−Sepharose), Chemikalien für Proteinkonzentrationsbestimmung, Chemilumineszenz−Reagenzien, Nitrozellulose
Antikörper und Proteinnachweise: 12000 E
Peroxidase− und Fluoreszenzfarbstoff−markierte, spezifische Sekundärantikörper, kommerziell erhältliche Primärantikörper, Auftragsherstellung von Antikörpern β−Catenin, APC, GSK3, Dishevelled, TCF−Proteine, Axin
Rekombinante DNA−Technologie: 8000 E
Reagenzien für cDNA−Synthese, reverse Transkription, quantitative und semiquantitative PCR, Restriktionsenzyme, DNA−modifzierende Enzyme, Taq−/Pwo−DNA−Polymerasen, Reagenzien
für die DNA und RNA Isolierung, Oligonukleotide, Rnase−Inhibitor Verbrauchsmaterialien und Feinchemikalien 8000 E
Puffersubstanzen, Salze, Antibiotika, Agarose, Acrylamid/Bisacrylamid, APS, TEMED, Protease−
Inhibitoren, Pipettenspitzen, Plastikwaren für Kultivierung von Zellen und Bakterien, Glaswaren, Sterilfilter
Teilprojekt B6:
Mathematische Modellierung der Fas/CD95−induzierten Signalwege in primären Hepatozyten
Projektleiter: Prof. Dr. Ch. Borner
Hepatozyten exprimieren den TNF−ähnlichen Todesrezeptor Fas/CD95. In einer normalen Leber führt die Aktivierung dieses Rezeptors zur Apoptose. Paradoxerweise bewirkt die Aktivierung des gleichen Rezeptors während der Phase der Leberregeneration eine erhöhte Hepatozyten Proliferation. Es scheint, daß der aktivierte Fas/CD95 Rezeptor über zwei verschiedene Proteindomänen gleichzeitig Signale zur Apoptose und Proliferation ins Zellinnere abgibt.
Während in normalen Hepatozyten der Apoptose Signalweg dominant ist, wird dieser in mitogenen Hepatozyten durch die Aktivierung von Apoptose−hemmenden Proteinen wie c−FLIP, Bcl−xL und IAPs unterdrückt, so daß der mitogene Fas/CD95 Signalweg zum Tragen kommt. Die Aktivierung dieser Proteine wird durch Cytokine wie HGF, EGF, TGF−β, Insulin, IL−1 und IL−6 bewerkstelligt, welche während der Leberregeneration auf Oberflächenrezeptoren der Hepatozyten binden und intrazelluläre, mitogene Signalwege anschalten. Ziel dieses Projektes ist es die Komponenten der apoptotischen und mitogenen Signalwege quantitativ zu messen, die Meßdaten mathematisch zu modellieren und mit Hilfe dieser Modelle Voraussagen zu treffen, unter welchen kostimulierenden Bedingungen die Hepatozyten Fas−abhängig proliferieren können.
1. Phase, apoptotischer Signalweg
In einer ersten Phase unseres Projektes möchten wir den apoptotischen Signalweg des Fas/CD95 Rezeptors mathematisch modellieren. Bis zur standardisierten Etablierung von murinen Hepatozytenkulturen nach den mit der nationalen Plattform Zellbiologie abgestimmten SOPs, wird die Modellierung an etablierten T− und B−Zellkulturen erprobt. Zu diesem Zweck werden wir die Zellen verschiedenen Konzentrationen eines agonistischen Fas Antikörpers oder eines rekombinanten oder aus Zellüberständen gewonnenen FasL (Fas Ligand) aussetzen und zu verschiedenen Zeiten folgende Signalübertragungskomponenten messen. (i) Die Menge an Fas (Rezeptor) Protein auf der Zelloberfläche vor und nach FasL oder anti−Fas Zugabe, mittels quantitativem anti−Fas ELISA. (ii) Die Menge an Fas, FADD und Caspase−8 im FasL−induzierten DISC Komplex mittels anti−Fas Immunopräzipitation (IP) und nachfolgenden anti−Fas, anti−
FADD und anti−Caspase−8 Western blots des präzipitierten Immunkomplexes. Die Proteinquantifizierung erfolgt über direkte Chemilumineszenzmessung der Western blots (ECL Western). (iii) Die Aktivität von membranständiger (im DISC gebundener) und löslicher (cytosolischer) Caspase−8, Caspase−3 und Caspase−9 mittels spezifischen fluorogenen Peptid Substraten in vitro. (iv) Die Aktivität von Caspase−8, Caspase−3 und Caspase−9 mittels FACS Analyse von Zellen, welche mit zellpermeablen, spezifischen Peptid Substraten gefüttert wurden (in vivo). (v) Die Menge an prozessierten (aktiven) Caspasen−8 (im DISC und löslich), −3 und −9 und deren Substrate (Mitochondrien−perforierendes BID und Endonukleasen Inhibitor ICAD) mittels ECL Western. (vi) Die Menge an ins Cytosol ausgeschütteten Cytochrome c,
Smac/DIABLO, HtrA2/Omi mittels quantitativem ELISA sowie transfektierten GFP−Cytochrome c mittels FACS and Video Time−Laps Analyse (Nitschke) (vii) Die Formation des Cytochrome c/Apaf−1/Caspase−9 Apoptosome Komplexes mittels anti−Apaf−1 IP und nachfolgenden anti−
Apaf−1, anti−Cytochrome c und anti−caspase−9 Western blots des präzipitierten Immunkomplexes (ECL Western). Zusätzlich erfolgt eine Apoptose Quantifizierung mittels FACS Analyse von Zellen, welche mit Annexin−V−GFP behandelt wurden (mißt Phosphatidylserine auf der Zelloberfläche) und FACS Analyse des TUNEL stainings (Inkorporation von fluoreszierendem dUTP an geschnittenen Stellen des Genoms). Alle erhobenen Daten werden für die systembiologische Analyse genutzt: (i) Analyse der beteiligten Proteindomänen, Proteinsequenzen einschließlich komparativer Genomik; (ii) Aufstellung von Differentialgleichungen (Teilprojekt D2) um ein mathematisches Modell des apoptotischen Fas Weges zu erhalten; (iii) aus (i) und (ii) werden qualitative und quantitative Vorhersagen gewonnen und getestet; (iv) das mathematische Modell wird anschließend verfeinert, insbesondere Hinzufügen, Wegstreichen, Modifizieren von Komponenten und Interaktionswegen. Der Zyklus (i)−(iv) wird in mehreren Etappen entsprechend den neuen experimentellen Daten wiederholt.
2.Phase, mitogener Signalweg
In einer zweiten Phase unseres Projektes möchten wir den mitogenen Signalweg von anti−Fas−
oder FasL−behandelten Hepatozyten modellieren, welcher entweder durch Hemmung des apoptotischen Weges mittels zellpermeablen Caspasen Hemmern wie Z−VAD.fmk oder mittels Zugabe von definierten Cytokin/Wachstumsfaktor Cocktails (EGF, TGF−β, HGF−1, Insulin, IL−
1b, IL−6 oder IL−15) begünstigt wird. Alle apoptotischen Signalkomponenten des Fas−Weges werden nochmals unter diesen Bedingungen gemessen um herauszufinden, auf welchem Niveau der apoptotische Fas Weg gehemmt wird. Zusätzlich bestimmen wir die Mengen und Aktivitäten der Apoptose−hemmenden Proteine c−FLIP, Bcl−xL, Bcl−2 und die verschiedenen IAPs. Dann messen wir die Signalkomponenten, welche in der mitogenen Wirkung von Fas und den ko−stimulierenden Cytokinen eine Rolle spielen (TRAF1−3, RIP kinase, AP−1, c−myc und NIK/IKK/IκB/NF−κB (in Kooperation mit Teilprojekt B2), und Komponenten der Ras/Raf/MAPK (EGF/TGF−β, HGF−1), MEKK−1/JNK (Fas), MyD88/IRAK−NF−κB (IL−1), PI−3K/Akt/BAD (Insulin (in Kooperation mit Teilprojekt B3) und EGF/TGF−α, HGF−1) und JAK−STAT (IL−6/IL−15) (in Kooperation mit Teilprojekt B1) Signalwege). Dafür werden zusätzlich zu obigen Messungen quantitative Protein Kinase Assays und Gel−Mobility Shifts (EMSA für NF−κB, AP−1) etabliert. Die Zellproliferation wird per [3H]Thymidin Einbau gemessen. Alle erhobenen Daten werden wieder für die systembiologische Analyse genutzt: (i) Analyse der beteiligten Proteindomänen, Proteinsequenzen einschließlich komparativer Genomik. Hierbei werden in dieser zweiten Phase des Projektes noch stärker die Analyse von Proteinfamilien, Genomanalyse, Analyse von Genexpressionsmustern etc.
genutzt. (ii) Aufstellung von Differentialgleichungen (Teilprojekt D2) um ein mathematisches Modell des mitogenen Fas Weges zu erhalten. Dies bedeutet für die Phase 2 erneut das Aufstellen eines zweiten, kompletten Satzes von Gleichungen. (iii) Aus (i) und (ii) werden erneut qualitative und quantitative Vorhersagen gewonnen und getestet; (iv) das mathematische Modell wird anschließend verfeinert, insbesondere Hinzufügen, Wegstreichen, Modifizieren von Komponenten und Interaktionswegen. Der Zyklus (i) −(iv) wird in mehreren Etappen entsprechend den hierfür gewonnenen neuen experimentellen Daten wiederholt werden. Die Verknüpfung der apoptotischen und mitogenen mathematischen Modelle soll zur Identifikation von zellulären Komponenten führen, die bislang noch nicht bekannt waren, beide Signalwege vervollständigen und miteinander verbinden.
Personal:
Für die Erhebung der quantitativen Daten wird eine Doktorandenstelle (BATIIa/2) beantragt. Für die bioinformatischen Analysen wird eine halbe Doktorandenstelle (BATIIa/4) beantragt.
Es werden für Reisemittel auf 3 Jahre 5000 E beantragt.
Verbrauchsmittelbedarf für 3 Jahre:
Antikörper (Caspasen, FADD, FLIP, Bcl−xL, MEK,MAPK) 10.000 Euro
ELISA kits 10.000 Euro
Caspase Inhibitoren 10.000 Euro
Cytokine 10.000 Euro
Fluorogene Substrate 3.000 Euro
TUNEL kit für DNA Fragmentierung, Thymidin Einbau 3.000 Euro Zellkulturmedien (spez. Hepatozyten) 4.000 Euro
Total 50.000 Euro
Teilprojekt B7:
Die Bedeutung von Ovalzellen für die Leberregeneration − Modellierung der Differenzierung von Ovalzellen in adulten Hepatozyten
Projektleiter: Dr. J. Donauer, Prof. Dr. G. Walz
Die Leber verfügt über ein ungewöhnliches Regenerationspotential und bis zu 2/3 der Lebermasse kann bei Mäusen innerhalb von 10 Tagen ersetzt werden. Dieser typische Regenerationsprozeß wird durch die Gabe von 2−Acetylaminofluoren (2−AAF), einem Proliferationshemmer, signifikant verändert. Die Leberregeneration geht nun überwiegend von sog. Ovalzellen aus. Ovalzellen sind kleine Epithelzellen mit Progenitorzelleigenschaften und können u.a. in Gallengangsepithel, Hepatozyten, intestinales Epithel, Pankreas− und Prostatazellen differenzieren. Ovalzellen weisen hämatopoetische Marker wie Thy−1, CD34, c−kit und Flt−3 auf, und zumindest ein Teil der Ovalzellen stammt aus dem Knochenmark. Im vorliegenden Projekt soll die Differenzierung dieser Progenitorzellen in adulte Hepatozyten modelliert werden.
Erstes Jahr:
Charakterisierung von Ovalzellen
Zunächst wird das Genprofil von isolierten Ovalzellen (Maus) charakterisiert. Hierzu werden Mäuse zunächst 7 Tage mit 2−AAF behandelt. Anschließend erfolgt eine partielle Hepatektomie, welche die Akkumulation von Ovalzellen in der Leber begünstigt. Mit Hilfe eines anti−Thy1−
Antikörpers und FACSorting können 95−97% reine Ovalzellpopulationen isoliert werden. Das Genprofil dieser gereinigten Ovalzellpopulation wird als Ausgangsbedingung definiert und mit dem Genprofil von Hepatozyten aus unbehandelten Mäusen verglichen. Die technische Voraussetzung für die Expressionsanalyse von kleinen Zellmengen ist die Anwendung von Gold− bzw.
Silberpartikel für die Hybridisierung, um so mit RNA−Mengen von 0,5−1,0 µg auszukommen.
Differenzierung von Ovalzellen im Rahmen der Leberregeneration
Ovalzellen besitzen ein bemerkenswertes Potential, sich in eine Reihe unterschiedlicher Zellen zu differenzieren. Die Differenzierung von Ovalzellen in Hepatozyten soll über einen Zeitraum von ca. 10 Tagen mit Hilfe von Genexpressionsprofilen charakterisiert werden. Zu diesem Zweck werden Mäuse 7 Tage mit 2−AAF behandelt; es erfolgt anschließend eine partielle Hepatektomie.
Jeweils an den postoperativen Tagen 1 bis 10 werden Expressionsprofile bestimmt. Zusammen mit
den Teilprojekten B8 und D2 und der nationalen Plattform Bioinformatik/Modellierung (Herzel) wird mit Hilfe von hierarchischen Clusterdenodrogrammen soll zunächst untersucht, wie reproduzierbar die Differenzierung von Ovalzellen in Hepatozyten abläuft. Clusterdendrogramme zeigen Verwandtschaftsgrade auf: wir erwarten, daß sich Ovalzellen im zeitlichen Verlauf der Leberregeneration nach der partiellen Hepatektomie durch ein bestimmtes Genmuster auszeichnet und dynamische Veränderungen aufweist.
Zweites Jahr:
Modellierung der Differenzierung von Ovalzellen
Der von uns eingesetzte Mikroarray (22 K) enthält ca. 500 Transkriptionsfaktoren, Proto−
Oncogene und Wachstumsfaktoren. Es sollen Algorithmen entwickelt werden, welche die Transkriptionsfaktoren bzw. Proto−Oncogene in eine zeitliche Beziehung zueinander stellen. Diese Algorithmen sollen Faktoren identifizieren, welche am Beginn von Signalkaskaden stehen und komplexe biologische Programme initiieren können. Um Signalkaskaden auf Expressionsebene zu definieren, werden zusätzlich primäre Hepatozyten nach den Standard Operating Procedures der Plattform Zellbiologie kultiviert. Diese werden mit aktivierenden Mutanten (z.B. v−ras) lentiviral infiziert oder mit definierten Wachstumsfaktoren behandelt, und die durch diese Manipulation erzeugte Genexpressionsmuster erstellt. Durch Cluster−Analysen können Markergene für bestimmte Signalkaskaden identifiziert werden; bei Nachweis dieser Markergene kann dann auf die Aktivierung von definierten Signalkaskaden zurückgeschlossen werden.
Drittes Jahr:
Validierung von Modellen und Identifizierung von "Master Switch"−Genen
Zur Validierung werden Schlüsselgene in Ovalzellen mittels transienter Transfektion oder lentiviralem Gentransfer exprimiert. Handelt es sich tatsächlich um ein Gen, welches in der weiteren Differenzierung eine Schlüsselposition einnimmt und weitere Signalkaskaden aktiviert, so sollte sich die Aktivierung dieser Signalkaskaden und möglicherweise die Differenzierung von Ovalzellen mittels Mikroarrays nachweisen lassen.
Die Entwicklung der Algorithmen zur Identifizierung von Schlüsselgenen und die Modellierung des Differenzierungsprozesse von Ovalzellen wird von der Teilprojekt D2 und der Plattform Bioinformatik/Modellierung (Herzel) geleistet. Der Nachweis der Aktivierung von spezifischen Signalkaskaden (TGF−ß/SMAD, IGF, Apoptose) und Validierung auf der Proteinebene wird in Zusammenarbeit mit den Teilprojekten B1, B3, B5 und B6 durchgeführt.
Personalbedarf:
Die Experimente (Mikroarrays, lentiviraler Gentransfer) sollen von einem Doktoranden (BAT IIa/2) durchgeführt werden. Es werden Reisemittel in Höhe von 5000 E für 3 Jahre beantragt.
Verbrauchsmittelbedarf für 3 Jahre:
Die Sachmittel (42.000 E) werden für die Herstellung und Auswertung von Mikroarrays (ca. 500 Euro pro Mikroarray) benötigt. Ferner werden Mittel für Kulturmedien (4000 Euro), Herstellung von Retroviren (2000 Euro), Fluoreszenzmikroskopie und Western Blot−Analyse (Antikörper, etc.) (2000 Euro) benötigt.
