Isolierung, Kultivierung und Charakterisierung boviner Darmepithelzellen

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Aus den Instituten für Pathologie und Virologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover

Isolierung, Kultivierung und Charakterisierung boviner Darmepithelzellen

INAUGURAL-DISSERTATION

zur Erlangung des Grades einer

Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von

Stephanie Pickartz

aus Rheindahlen-Mönchengladbach

Hannover 2002

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Wissenschaftliche Betreuung: Priv.Doz. Dr. E. Liebler-Tenorio Prof. Dr. I. Greiser de Wilke

1. Gutachter: Priv.Doz. Dr. E. Liebler-Tenorio

2. Gutachter: Prof. Dr. H. Naim

Tag der mündlichen Prüfung: 27.11.2002

Gefördert durch die DFG im Rahmen des

Sonderforschungsbereichs 280 „Gastrointestinale Barriere“

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Meinen Eltern

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1. EINLEITUNG ... 1

2. LITERATURÜBERSICHT... 2

2.1. KULTURSYSTEME FÜR EPITHELZELLEN... 2

2.1.1. Primärkulturen ... 2

2.1.2. Permanente Zellinien aus Adenokarzinomen vom Kolon ... 2

2.2. ISOLIERUNGSMETHODEN VON DARMEPITHELZELLEN FÜR DIE PRIMÄRKULTUR... 3

2.2.1. Mechanische Methoden... 3

2.2.2. Chelation ... 4

2.2.3. Enzymatischer Verdau... 5

2.2.4. Vergleichende Untersuchungen zu Methoden der Zellseparierung... 7

2.3. KULTIVIERUNG VON DARMEPITHELZELLEN... 9

2.3.1. Medien und Supplemente... 9

2.3.2. Extrazelluläre Matrix ... 12

2.4. METHODEN ZUR ANREICHERUNG DER DARMEPITHELZELLEN... 13

2.5. METHODEN ZUR HERSTELLUNG PERMANENTER DARMEPITHELZELLINIEN... 14

2.5.1. Verwendung transgener Tiere ... 15

2.5.2. Transfektion primärer Zellinien ... 15

2.6. CHARAKTERISIERUNG VON DARMEPITHELZELLKULTUREN... 17

2.6.1. Morphologie des Epithelzellverbandes und der einzelnen Darmepithelzelle ... 18

2.6.1.1. Undifferenzierte Darmepithelzellen ... 18

2.6.1.2. Differenzierte Darmepithelzellen ... 18

2.6.2. Proliferationsverhalten ... 19

2.6.3. Intermediärfilamente, Zytoskelett, Zellverbindungen... 20

2.6.4. Enzymausstattung... 21

2.6.5. Sonstige Zellmarker... 23

3. MATERIAL UND METHODEN... 25

3.1. MATERIAL... 25

3.1.1. Tiere ... 25

3.1.2. Sonstige Materialien... 26

3.2. METHODEN... 26

3.2.1. Entnahme des Darmes... 26

3.2.2. Aufbereitung des Darmes ... 26

3.2.3. Anfertigung von Gewebsschnitten ... 27

3.2.3.1. Paraplastschnitte... 27

3.2.3.2. Gefrierschnitte ... 27

3.2.3.3. HE-Färbung der Gewebsschnitte ... 30

3.2.4. Zellseparierung ... 30

3.2.4.1. Trypsinverdau... 32

3.2.4.2. Kollagenase/Dispaseverdau... 32

3.2.4.3. Thermolysinverdau... 33

3.2.5. Zellkultivierung, Passagierung und Konservierung ... 33

3.2.6. Anreicherung der Epithelzellfraktion ... 34

3.2.6.1. Kollagenbeschichtung der Kulturschalen ... 34

3.2.6.2. Vorinkubationsschritte ... 34

3.2.6.3. Trypsinierung ... 35

3.2.6.4. Zugabe von Kollagenase zum Medium ... 35

3.2.7. Untersuchung der Zellkulturen auf Kontamination mit BVD-Virus, bzw. Mykoplasmen... 35

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3.2.8.2. Rasterelektronenmikroskopie ... 38

3.2.9. Proliferationsmessungen ... 39

3.2.9.1. Bestimmung des zellzyklusassoziierten Ki67-Antigens ... 39

3.2.9.2. Messung der Stoffwechselativität... 40

3.2.10. Nachweis von Intermediärfilamenten... 41

3.2.10.1. Cytokeratin... 41

3.2.11. Nachweis von Immunglobulin M ... 42

3.2.12. Enzymnachweise... 42

3.2.12.1. Enzymhistochemische Nachweise ... 42

3.2.12.2. Quantitativer biochemischer Enzymnachweis... 45

4. ERGEBNISSE ... 47

4.1. MORPHOLOGISCHE BEFUNDE AN DEN ZUR ZELLGEWINNUNG VERWENDETEN FETALEN RINDERDÄRMEN 47 4.1.1. Histologische Befunde und Zellproliferation... 47

4.1.2. Enzymexpression in der Mukosa ... 49

4.1.2.1. Enzymhistochemische Untersuchungen ... 49

4.1.2.1.1. Alkalische Phosphatase ... 49

4.1.2.1.2. Laktase ... 49

4.1.2.1.3. Aminopeptidase M ... 52

4.1.2.2. Biochemischer Nachweis von Saccharase-Isomaltase... 52

4.2. VERGLEICHENDE UNTERSUCHUNG VERSCHIEDENER ISOLIERUNGS- UND KULTIVIERUNGSMETHODEN FÜR FETALE BOVINE DARMEPITHELZELLEN... 53

4.2.1. Zellisolierung ... 53

4.2.1.1. Trypsinverdau... 53

4.2.1.2. Kollagenase-Dispase-Verdau ... 55

4.2.1.3. Thermolysinverdau... 57

4.2.2. Kultiviermethoden ... 60

4.2.2.1. Nährmedien ... 60

4.2.2.2. Zusatz von fetalem Kälberserum ... 61

4.2.3. Methoden zur Anreicherung der Epithelzellfraktion ... 62

4.2.3.1. Kollagenbeschichtung und Vorinkubation ... 62

4.2.3.2. Kollagenasezusatz zum Medium ... 66

4.2.3.3. selektives Trypsinieren der Fibroblasten ... 70

4.2.3.4. optimierte Methode zur Anreicherung der Darmepithelzellen in der Zellkultur... 70

4.3. PROLIFERATIONSMESSUNGEN, ENZYMHISTOCHEMISCHE UND MORPHOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN AN DEN ZELLKULTUREN 1 - 4... 71

4.3.1. Herkunft der Kulturen ... 71

4.3.2. Methoden der Isolierung und Kultivierung ... 71

4.3.3. Untersuchung auf Kontamination mit BVD-Virus / Mykoplasmen... 71

4.3.4. Proliferationsmessungen ... 72

4.3.4.1. Bestimmung der Stoffwechselaktivität ... 72

4.3.4.2. Vergleich der Zellproliferation anhand der Expression zellzyklusassoziierten Ki67-Antigens ... 75

4.3.5. Expression von Epithelzellmarkern, pan-Cytokeratin, CK 8 und CK 19 ... 76

4.3.6. Nachweis von Immunglobulin M ... 77

4.3.7. Nachweis von alkalischer Phosphatase, Laktase, Aminopeptidase M und Saccharase-Isomaltase 77 4.3.7.1. Enzymhistochemie ... 77

4.3.7.2. Biochemische Untersuchung auf Saccharase-Isomaltase ... 77

4.3.8. Transmissionselektronenmikroskopische Befunde ... 80

4.3.9. Rasterelektronenmikroskopische Befunde... 84

5. DISKUSSION ... 94

6. ZUSAMMENFASSUNG ... 102

7. SUMMARY ... 104

8. LITERATURVERZEICHNIS ... 106

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10. DANKSAGUNG ... 126

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1. Einleitung

Das Virus der Bovinen Virusdiarrhoe (BVDV) gehört zum Genus Pestivirus innerhalb der Familie Flaviviridae. Es sind zwei Spezies, BVDV 1 und BVDV 2, bekannt. Aufgrund des Verhaltens in Zellkulturen wird weiterhin ein nicht-zytopathogener (nzp) und ein zytopathogener (zp) Biotyp unterschieden.

Die akute Infektion seronegativer immunkompetenter Rinder verläuft in der Regel milde bis inapparent; sie kann jedoch zu einer intrauterinen Infektion des Fetus führen. Eine transplazentare Infektion hat je nach Reifegrad des fetalen Immunsystems unterschiedliche Folgen. Erfolgt eine Infektion mit dem nzp BVDV im ersten Trächtigkeitsdrittel, wird beim Fetus eine Immuntoleranz gegen das nzp BVDV induziert, die eine lebenslange Viruspersistenz mit sich bringen kann. Werden diese persistierend virämischen Rinder später in ihrem Leben mit einem homologen zp BVDV infiziert, so erkranken sie an der Mucosal Disease (MD). Die MD ist durch Erosionen an den kutanen Schleimhäuten und unstillbaren blutig-wäßrigen Durchfall gekennzeichnet. Erkrankte Tiere dehydrieren und verenden innerhalb von zwei Wochen.

Bei der MD breitet sich das Virus von den Tonsillen über die lymphatischen Einrichtungen des Darmes bis in die Epithelschicht der Darmschleimhaut aus, wobei vorrangig die Epithelzellen in den Krypten infiziert werden. In infizierten Krypten kommt es zu einem Untergang der Epithelzellen in Form von Apoptose.

Bisher wurde das Verhalten von BVDV in der Zellkultur auf etablierte Zellinien wie beispielsweise FKN-Zellen und MDBK-Zellen untersucht, da keine Darmepithelzellkulturen, die die eigentlichen Zielzellen des Virus darstellen, existierten. Um die molekularen Mechanismen der virusinduzierten Zellzerstörung bei der Mucosal Disease des Rindes in den Zielzellen des BVDV untersuchen zu können, sollten in der vorliegenden Arbeit Methoden zur Etablierung von Primärzellkulturen boviner Kryptepithelzellen erarbeitet werden und Zellinien hergestellt und charakterisiert werden.

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2. Literaturübersicht

2.1. Kultursysteme für Epithelzellen 2.1.1. Primärkulturen

Bei normalen, nicht neoplastischen Zellen des Darmepithels unterscheidet man zwei Primärkultursysteme: die Monolayerkultur, bei der die Zellen zunächst durch diverse Isolationstechniken vom Ursprungsorgan getrennt werden, und die Organkultur, bei der kleine Stücke intakter Mukosa direkt in Kultur gebracht werden. Da in den folgenden Abschnitten der Literaturübersicht überwiegend auf Monolayerkulturen eingegangen wird, sollen hier kurz die Besonderheiten der Organkultur angesprochen werden.

Bei der Organkultur war die Überlebenszeit der Zellen limitiert, da nach anfänglicher Proliferation der Zellen bald eine Differenzierung mit einhergehendem Sistieren des Wachstums stattfand (KONDO et al. 1985). Besonders die Organkultur von Darmstücken adulter Individuen unterlag rascher Nekrose und Degeneration (KEDINGER et al. 1980;

TRIER 1976). Sofern als Ausgangsmaterial fetaler Darm verwendet wurde, ließ sich die Überlebensspanne der Zellen bis auf einen Monat verlängern. Zwar ging innerhalb der ersten Tage in Kultur die Originalstruktur der Mukosa verloren und die Zahl der Mitosen nahm innerhalb einer Woche drastisch ab, es entstanden jedoch morphologisch und funktionell stabile, differenzierte Epithelzellen. Bei älteren Feten konnte im Vergleich zu jüngeren Feten generell eine schlechtere Zellausbeute festgestellt werden (QUARONI 1985).

2.1.2. Permanente Zellinien aus Adenokarzinomen vom Kolon

Die aus tumorösen Gewebe gewonnenen Zellen hatten eine hohe Ähnlichkeit mit fetalen Zellen: sie reagierten beispielsweise mit demselben Antikörper, der Bestandteile der Oberflächenmembran (Vorläufer des Enzyms Sucrase-Isomaltase) des fetalen oder auch neonatalen Mäusedarms markierte (QUARONI 1986b). Sofern die Kolonkarzinomzellen auf dem Mesenchym fetaler Ratten angezüchtet wurden, wiesen sie teilweise auch Eigenschaften differenzierter Zellen auf (FUKAMACHI et al. 1986).

Die Zellinie Caco-2 (ATCC-Nummer HTB-37) wurde aus einem kolorektalen Adenokarzinom des Menschen in relativ differenziertem Zustand gewonnen. In Kultur zeigten die Zellen ein langsames Wachstum und überlebten etwa 30 Tage, bis sie sich schließlich von ihrer Unterlage lösten. Caco-2-Zellen wuchsen im Monolayer und wiesen

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Charakteristika auf, die den Kryptzellen des fetalen Kolons entsprachen (GRASSET et al.

1984).

T84-Zellen (ATCC-Nummer CCL-284) entstammten einer Lungenmetastase eines humanen Kolonkarzinoms. Selbst nach Transplantation der Tumorzellen auf BALB/C-Nacktmäuse behielten die Zellen histologisch die Charakteristika des Kolonkarzinoms bei. Die T84-Zellen wuchsen im Monolayer, ähnelten jedoch in ihren Eigenschaften eher den adulten Kryptzellen (MADARA u. DHARMSATHAPHORN 1985).

Die Zellinie HT29 (ATCC-Nummer HTB-38) wies die Besonderheit auf, in glukosefreien Nährmedien unter Zugabe von weiteren Supplementen (humanes Transferrin, nicht- essentielle Aminosäuren) vom undifferenzierten in einen differenzierten Status zu wechseln (PINTO et al. 1982). Diese Zellen besaßen eine hohe Ähnlichkeit mit adsorptiven, bzw.

Becherzellen. Auch war es möglich, die HT29-Zellen einer Subklonierung zu unterziehen (HUET et al. 1987).

2.2. Isolierungsmethoden von Darmepithelzellen für die Primärkultur

Zur Isolierung der Darmepithelzellen für die Monolayerkultur wurden diverse Methoden angewandt, die unterschiedlich erfolgreich waren. Man kann prinzipiell zwischen der mechanischen Isolierung, der Chelation und dem enzymatischen Zellverdau unterscheiden.

Teils fanden auch Kombinationen mehrerer Techniken Verwendung. Bei der mechanischen Methode wird die Mukosa von der unterliegenden Muskelschicht geschabt oder die Zellen werden mittels Vibration gelöst. Bei der Chelation wird der Zell-zu-Zellkontakt durch Depletion des extrazellulären Kalziums verringert. Beim enzymatischen Zellverdau werden durch Behandlung mit Enzymlösungen Proteinkomponenten und Oberflächenrezeptoren des Darmes hydrolisiert und die Epithelschicht hierdurch abgelöst. Die Kultivierbarkeit von Enterozyten war bei den verschiedenen Spezies in unterschiedlichem Ausmaß von der Technik der Zellisolierung abhängig (s. 2.2.4.).

2.2.1. Mechanische Methoden

Bei der mechanischen Methode mittels Vibration wurden im Vergleich zu den anderen Möglichkeiten der Zellgewinnung weniger Zellen freigesetzt und die Vitalität der Zellen war stark vermindert, da sie durch den Vibrationsvorgang deutlich traumatisiert wurden. Zudem wurden mit dieser Technik eher Zellen der Villusspitze, d.h. ausdifferenzierte, nicht

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proliferierende Epithelzellen vom umgebenden Gewebe gelöst (EADE et al. 1981). Selbst wenn es gelang, eine große Anzahl von Epithelzellen zu isolieren, degenerierten diese und wurden von mesenchymalen Zellen überwachsen (PERREAULT u. BEAULIEU 1996).

Zur Isolierung von Darmepithelzellen der Ratte wurde die mechanische Behandlung des Darmes (STÖRSTRAND 1968), oder eine Kombination von mechanischen Methoden, z. B.

leichtem Schütteln (WEISER 1973), oder starker longitudinaler Vibration (HARRISON u.

WEBSTER 1969) zusammen mit der Einwirkung von Citrat- oder EDTA-haltigen Puffern auf die Darmschleimhaut angewandt. Während mit der Weiser-Methode Zellfraktionen von verschiedenen Abschnitten der Darmvilli freigesetzt wurden, wurde bei starker mechanischer Gewaltanwendung (Harrison-Webster-Methode) das Villusepithel gesamt abgelöst.

Gemeinsam war all diesen Techniken, daß zwar anfänglich große Zahlen an lebenden Zellen gewonnen wurden, die jedoch, in Kultur eingebracht, binnen kurzer Zeit ihre Vitalität verloren. Dies geschah zum Teil schon nach einigen Stunden, da sich die Zellen nicht auf den Kulturgefäßen festsetzten. Sofern einige der Enterozyten doch noch hafteten, waren sie spätestens nach einer Woche nicht mehr lebensfähig.

2.2.2. Chelation

Die sequentielle Isolierung von Enterozyten der Maus durch Chelation wurde nach der Methode von RAUL et al. (1977) durchgeführt. Hierdurch sollte eine getrennte Charakterisierung der Krypt- und Villusepithelzellen erreicht werden. Die Darmepithelzellen wurden durch eine Mischung aus EDTA und Dithiothreitol unter schwacher Agitation in mehreren Etappen freigesetzt. Es lösten sich zunächst die Villus- und dann die Kryptepithelien ab. Während sich die Epithelzellen der Zotten als ganze Schleimhautlagen und Einzelzellen lösten, wurden die Zellen aus den Kryptregionen als Gesamteinheiten separiert (POTHIER u. HUGON 1980). Die Vitalität der auf diese Art gewonnenen Epithelzellen lag anfänglich bei 80 bis 90 %. Bereits nach 24 bis 48 Stunden traten jedoch starke Degenerationserscheinungen auf.

Auch die Ursprungsepithelzellen der konditionell immortalisierten Epithelzellinien H-2Kb- tsA58 transgener Mäuse (s. 2.5.) wurden durch Inkubation der Darmschleimhaut in EDTA und Dithiothreitol freigesetzt (WHITEHEAD et al. 1993). Um die Krypten vollständig zu lösen, wurde das bereits dem Verdau unterworfene Gewebe in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) resuspendiert und kräftig geschüttelt. Hierbei erhielt man schließlich eine Kryptepithelzellpopulation frei von Kontamination mit Fibroblasten.

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2.2.3. Enzymatischer Verdau

Langlebige Primärkulturen undifferenzierter Epithelzellen junger Ratten konnten QUARONI und Mitarbeiter (1979) über Dissoziation der Darmzellen von kleinen Gewebsstückchen durch den Verdau mit Kollagenase etablieren. Aus den durch enzymatischen Verdau gewonnenen und ausgesäten Zellen entstanden nach drei bis vier Wochen Epithelzellkolonien, die nach Selektion mit Klonierzylindern weiter vermehrt wurden. Die auf diese Weise etablierten intestinalen epithelialen Zellinien (IEC´s) waren über einen Zeitraum von sechs Monaten subkultivierbar.

Eine weitere Möglichkeit, Epithelzellen der Ratte zu isolieren, stellt die intravaskuläre Perfusion von Darmabschnitten mit Kollagenase und anschließende Spülung des Darmlumens mit serumhaltiger Pufferlösung, um die freigesetzten Epithelzellen zu erhalten, dar (HARTMANN et al. 1982). Wurde diese Methode sequentiell angewendet, so lösten sich zunächst die Epithelzellen der Villusspitzen, dann die im mittleren und zuletzt die im unteren Villusbereich. Sowohl die auf diese Art gewonnenen Epithelzellen der Zotten, als auch die nach dem Verdau noch im Darm haftenden Epithelzellen der Krypten, zeigten eine intakte Ultrastruktur. Die Vitalität der Zellen lag bei 95 %. Dies spricht für die Unschädlichkeit des zur Isolierung verwendeten Enzyms für Epithelzellen.

FUKAMACHI (1992) konnte durch einen enzymatischen Verdau mit Kollagenase und anschließende mechanische Trennung der epithelialen von der mesenchymalen Zellschicht Primärepithelzellkulturen aus Darmfragmenten fetaler Ratten etablieren. Bei dieser Methode wurde der epitheliale Anteil mit einer Kollagenase-Hyaluronidasemischung durch wiederholtes Auf- und Abpipettieren der auf diese Weise verkleinerten Gewebsstücke behandelt. Die auf diese Art gewonnenen Zellen wiesen zwar innerhalb der ersten Tage in Kultur Proliferation auf, jedoch zeigten sich nach vier Wochen Degenerationserscheinungen und Subkultivierungsversuche verliefen ohne Erfolg.

Zur Etablierung transimmortalisierter Epithelzellen von zwanzig Tage alten L-PK/TAg 1 transgenen Mäusefeten (s. 2.5.) wurde der gesamte Darm zunächst in kollagenasehaltigem Medium inkubiert, die Villi mit sterilen Nadeln abgetrennt und nach Villusspitze und –basis separiert (BENS et al. 1996). Im Laufe der nun folgenden Kultivierung wuchsen die Epithelzellenzellen der Villusbasis an. Sie waren allerdings mit Zellen der glatten Muskulatur verunreinigt.

Um primäre Darmepithelzellkulturen vom Schwein zu erstellen, wurden intestinale Explantate eines 3½ Jahre alten Minipigs einem progressiven Kollagenaseverdau nach der

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Methode von QUARONI und Mitarbeitern (1979) unterzogen (KAEFFER et al.1993). Zwei von insgesamt 64 aus dem Ileum gewonnenen Epithelzellinien wiesen nach mehreren Generationen entweder eine epitheliale oder aber eine fibroblastische Morphologie auf und wurden im weiteren Verlauf mit einem SV 40 Plasmid immortalisiert (s. 2.5.).

Langzeitkulturen normaler humaner Kolonepithelzellen wurden durch drei unterschiedliche Methoden des enzymatischen Verdaus gewonnen (BATEN et al. 1992). Die mit Abstand höchste Zellausbeute und höchste Lebensfähigkeit der Zellen wurde nach Verdau der Darmmukosa mit einer niedrigkonzentrierten Enzymmischung aus Kollagenase, Trypsin und EGTA in einem Stomacher Blender registriert. Die erhaltene Zellpopulation bestand überwiegend aus Epithelzellen, war jedoch mit Fibroblasten verunreinigt. Etwas vermindert wurde sowohl der Zellgewinn als auch der Anteil an lebenden Zellen, wenn anstelle der Kollagenase der Trypsinanteil in der Enzymmischung erhöht wurde. Fand der Verdau nicht in einem Stomacher Blender, sondern in einem Erlenmeyerkolben auf einem Magnetrührer statt, so reduzierten sich Zellausbeute und Vitalität der gewonnenen Zellen nochmals. Die Möglichkeit, durch den Einsatz eines Stomacher Blenders die Konzentration an proteolytischen Enzymen relativ niedrig zu halten, kam letztlich dem Wachstum der Zellen zugute, da durch lange Inkubationszeiten bzw. hochkonzentrierte Enzymlösungen Schaden an der Membranstruktur der so behandelten Zellen festgestellt wurde (GIBSON D´AMBROSIO et al. 1986). Hierdurch wurde die Haftung der Zellen auf den Kulturgefäßen erschwert.

Dünndarmepithelzellen von menschlichen Feten im Alter von 20 bis 22 Wochen wurden durch Kultivierung von Darmstückchen in Medium mit Kollagenasezusatz gewonnen (SANDERSON et al. 1995). Klone aus Epithelzellen, die von diesen Darmsegmenten ausgehend auf den Zellkulturschalen wuchsen, wurden weitervermehrt, wohingegen fibroblastenhaltige Zellinseln verworfen wurden.

Eine Isolierungsmethode für menschliche Darmepithelzellen, durch die Epithelzellen ohne Verunreinigung mit mesenchymalen Zellen gewonnen werden können, stellt der Verdau der Zellen mit Thermolysin dar (PERREAULT u. BEAULIEU 1996). Diese Technik erwies sich als besonders effektiv für Epithelzellen von siebzehn bis neunzehn Wochen alten Feten. Bei niedrigerem Alter war die Zellausbeute geringer, bei über zwanzig Wochen alten Feten nahm die Kontamination mit Myofibroblasten Überhand. Die durch Thermolysinverdau gewonnenen Epithelzellen wuchsen über mehrere Passagen.

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2.2.4. Vergleichende Untersuchungen zu Methoden der Zellseparierung Ein Methodenvergleich unterschiedlicher enzymatischer Isolierverfahren für Darmepithelzellen der Ratte ergab, daß die Verwendung einer Mischung der beiden Enzyme Kollagenase und Dispase für den Zellverdau optimal für den Erhalt proliferierender Primärkulturen war (EVANS et al. 1992). Die niedrige tryptische Aktivität dieser Enzyme bewirkte, daß das Epithel seine dreidimensionale Integrität beibehielt. Dies war von großer Bedeutung für die Proliferation der Zellen im Verlauf der folgenden Kultivierung (GIBSON et al. 1989). Die durch diese Technik freigesetzten epithelialen „Organoide“, bestehend aus Zotten- und Prae-Kryptepithelzellen mit anhaftenden mesenchymalen Zellen, zeigten sehr gute Haftung an den Kulturgefäßen und konfluierten nach zehn bis vierzehn Tagen. Sie waren mindestens einen Monat kulturvierbar.

Der Vergleich mit verschiedenen anderen Techniken zur Zellisolierung, bei denen die Chelation und enzymatischer Verdau eingesetzt wurde, zeigte, daß bei Verwendung von EDTA, EGTA und einer modifizierten Weiser-Technik zwar reine Epithelzellfraktionen gewonnen werden konnten, diese Zellen allerdings unfähig waren, an den Kulturgefäßen zu haften, bzw. ein Wachstum der Zellen ausblieb (EVANS et al. 1992). Bei der Isolierung der Zellen mittels Trypsinierung wurden sowohl epitheliale als auch mesenchymale Zellen freigesetzt; sie hafteten und proliferierten jedoch nicht in den Kulturgefäßen. Sofern Kollagenase alleine verwendet wurde, erhielt man Klumpen an Epithelzellen, die sich relativ gut festsetzten und auch vermehrten. Kam Dispase als alleiniges Enzym zum Einsatz, so lösten sich nur einzelne Epithelzellen, die zwar auf den Kulturgefäßen hafteten, jedoch nicht mehr proliferierten. Die mit Abstand besten Ergebnisse wurden bei der Verwendung der Kollagenase-Dispasemischung erzielt (s.o.).

Zur Gewinnung von Kaninchenenterozyten für Transplantationszwecke wurden die Chelation mit EDTA und die warme Trypsinierung verglichen (NGUYEN et al. 1993). Nach der unter Vibration in einem Inkubatoren stattfindenden Inkubation der Mukosa mit der Chelationslösung, die aus EDTA, EGTA und Dithiothreitol bestand, wurde die Schleimhaut in PBS suspendiert und zur Freisetzung der Zellen gut geschüttelt. Diese Methode erfolgte in Anlehnung an die von WHITEHEAD und Mitarbeiter (1987). Der Verdau der Mukosa mit warmer Trypsinlösung wurde nach der Methode von FRESHNEY (1987) durchgeführt. Nach Behandlung der Schleimhaut mit diesem Enzym wurden die Mukosastücke in Medium suspendiert und ebenfalls gut geschüttelt. Während bei beiden Methoden die Zellausbeute

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identisch war, zeigten die mit Trypsin behandelten Zellen eine bessere Lebensfähigkeit und ein besseres Wachstum in vitro.

Die Tatsache, daß die Chelation beim Kaninchen weniger geeignet war als der enzymatische Verdau, um in Zellkultur proliferierende Enterozyten zu erhalten, zeigte sich auch beim Vergleich des Zellverdaus mittels Kollagenase und der Chelation mit EDTA (BENYA et al.

1991). Zwar wurde bei der Chelation eine höhere Zahl an intakten Krypten freigesetzt (WHITEHEAD et al. 1987), jedoch korrelierte diese Zahl nicht mit dem in vitro beobachteten Wachstum der Zellen (SANTOS et al. 1992).

Der Thermolysinverdau menschlichen Darmes wurde verglichen mit einer mechanischen Methode, bei der die Mukosa abgeschabt, gewaschen und die Zellen durch wiederholtes Auf- und Abpipettieren suspendiert wurden, einer mechanisch-enzymatischen Methode, bei der Darmfragmente mit Kollagenase verdaut wurden (QUARONI et al. 1979) und unterschiedlichen enzymatischen Verdaumethoden, bei denen die Enzyme Kollagenase, Dispase und Pronase E verwendet wurden. Nach der mechanischen Isolierung starben sämtliche Epithelzellen ab und die mesenchymalen Zellen zeigten ein ausgeprägtes Wachstum. Bei der mechanisch-enzymatischen Methode wurden nach vier Wochen einige epitheloide Kolonien beobachtet, die von mesenchymalen Zellen getrennt weiter subkultiviert werden konnten. Bei den enzymatischen Zellisolierungsmethoden wurden mit Ausnahme des Thermolysinverdaus die Epithelzellen relativ schnell von Fibroblasten überwachsen. Mit Thermolysin konnte aufgrund seiner selektiven Wirkung auf spezifische Moleküle der Basalmembran die Zellausbeute an Epithelzellen ohne Kontamination mit den darunterliegenden Stromazellen gesteigert werden ( WALZER et al. 1989). Auch die Vitalität der Zellen war besser.

Eine neue Methode, ausdifferenzierte Darmepithelzellen fünfzehn bis zwanzig Wochen alter Feten zu isolieren, ist die nicht-enzymatische Dissoziation der Zellen in eiskalter Matrisperse nach PERREAULT u. BEAULIEU (1998). Darmstückchen wurden über einen längeren Zeitraum ohne jegliche mechanische Agitation in der Lösung bei 4°C belassen. Durch anschließendes Schütteln löste sich das Epithel insgesamt ab und wurde dann in Medium suspendiert. Nach einer Woche waren ausdifferenzierte Becher- und adsorptive Zellen zu beobachten. Die Zellen proliferierten nur schwach und überlebten in Kultur bis zu zwölf Tagen.

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2.3. Kultivierung von Darmepithelzellen 2.3.1. Medien und Supplemente

Kulturmedien:

Um die Proliferationsfähigkeit der Darmepithelzellen zu erhalten, wurden von den verschiedenen Untersuchern unterschiedliche Kulturmedien eingesetzt, sowie Kulturmedien optimiert und mit Zusätzen ergänzt. Die bei den einzelnen Spezies verwendeten Kulturmedien für Darmepithelzellen sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Tab. 1: Kulturmedien für Darmepithelzellen:

Spezies Benutztes Medium

Ratte - RPMI (KONDO et al. 1985)

- RPMI mit EDulb (1 : 1) (QUARONI 1985)

- EDulb (QUARONI u. ISSELBACH 1985; PAUL et al. 1993; BERNARD et al. 1989; PERREAULT u. BEAULIEU 1998)

- MEM und EDulb (EVANS et al. 1992)

- F 12 (FUKAMACHI 1992; FUKAMACHI et al. 1994) Maus - EDulb mit Ham´s F 12 (1 : 1) (BENS et al. 1996)

- EDulb (WHITEHEAD et al. 1993) Kaninchen - RPMI (NGUYEN et al. 1993)

Schwein - EDulb (KAEFFER et al. 1993)

Mensch - EDulb (SANDERSON et al. 1996; PERREAULT u. BEAULIEU 1996) - EDulb und OptiMEM (QUARONI u. BEAULIEU 1997)

Der Einfluß der Qualität des Kulturmediums auf die Anzucht von Epithelzellen zeigte sich auch in der Tatsache, daß bestes Wachstum bei der Verwendung von frisch angesetztem Medium erzielt wurde. Wurde das Medium aus Konzentraten hergestellt, die bereits über einen Monat gelagert worden waren, so ließen die Zellen deutlich in der Proliferation nach (EVANS et al. 1992).

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Supplemente:

Fetales Kälberserum (FKS):

Bei Organkulturen konnte festgestellt werden, daß nur ein mit 5% FKS angereichertes Medium (1 : 1-Mischung aus DMEM und RPMI) im Vergleich zu einer serumfreien Mediumzubereitung mit bovinem Serumalbumin die Epithelzellen über einen längeren Zeitraum erhalten konnte (QUARONI 1985). Auch bei Monolayerkulturen kam es zum Einstellen des Wachstums der Zellen nach ca. zehn Tagen, sofern dem Kulturmedium FKS in einer Konzentration unter 1 % beigegeben wurde. Hohe Konzentrationen von FKS (10 %) bewirkten wiederum, daß mesenchymale Zellen derart stark proliferierten, daß sie die Epithelzellen überwucherten. Bei Zugabe von 2,5 % FKS zum Kulturmedium hielt sich das unerwünschte Wachstum von Bindegewebszellen des Darmes in Grenzen (EVANS et al.

1992).

Darmepithelzellen des Schweines konnten an ein Medium mit niedrigem FKS-Gehalt adaptiert werden (KAEFFER et al. 1993). Zwar waren sie bei einer Konzentration von 0,1 % FKS noch lebensfähig, jedoch stellte ein Serumanteil von 1 % die minimale Menge dar, die für das Zellwachstum benötigt wurde .

Durch die Verwendung serumfreier, supplementierter Medien konnten Epithelzellen sowohl zu Proliferation als auch zu morphologischer Differenzierung angeregt werden, jedoch schien die Interaktion mit mesenchymalen Zellen notwendig für die funktionelle Differenzierung der Zellen zu sein. Auch ließen sich die in solchen Medien angezüchteten Zellen nicht passagieren (FUKAMACHI 1992). Darüber hinaus wurde bei Langzeitkulturen normaler Kolonepithelzellen des Menschen beobachtet, daß in serumfreien Medien mit identischer Supplementierung wie in serumhaltigen Vergleichsmedien die Zellen erhebliche Vitalitätsverluste erlitten (BATEN u. SHAMSUDDIN 1992).

Wurde serumfreien Medien, in denen durch Zugabe von verschiedenen Supplementen das Wachstum der Epithelzellen gefördert werden sollte, Serum zugesetzt, so kam es durch Serumkonzentrationen von 2 – 20 % zu einer deutlichen Reduktion der Epithelzellproliferation (FUKAMACHI 1992). Dies wurde auf die Tatsache zurückgeführt, daß Serumkonzentrationen über 0,1 % die wachstumsstimulierenden Eigenschaften von Supplementen, wie beispielsweise EGF und Insulin, behindern (WU u. SMITH 1982).

Außerdem enthält Serum eine Reihe von Faktoren, insbesondere TGF-ß die die Differenzierung von Epithelzellen in Kultur beeinflussen (MASUI et al. 1986).

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Epidermal Growth factor (EGF), Insulin, Choleratoxin, Transferrin, Hydrocortison:

Die Verwendung der oben aufgeführten Supplemente in serumfreien Medien zeigte, daß sie synergistisch die Proliferation von Enterozyten in Kultur stimulierten. Wenn sie jedoch nur einzeln dem Medium zugegeben wurden, war kein Anstieg des Zellwachstums zu registrieren (FUKAMACHI 1992). Für eine kontinuierliche Proliferation konditionell immortalisierter Darmepithelzellen des Menschen war ein spezielles Wachstumsmedium, welches sowohl Insulin als auch EGF enthielt, essentiell. Die alleinige funktionelle Expression des zur Immortalisation verwendeten SV40T-Ag war nicht ausreichend, um ein Wachstum über längere Zeiträume zu ermöglichen (QUARONI u. BEAULIEU 1997). Untersuchungen an intestinalen Kryptzellinien von Ratten zeigten, daß Insulin nur in supraphysiologischen Konzentrationen Zellproliferation induzieren konnte, wohingegen EGF auch in niedrigeren Konzentrationen, die den in vivo-Werten entsprechen, eine Steigerung der Epithelzellproliferation bewirkte (CONTEAS et al. 1989). EGF wird unter physiologischen Bedingungen im Sekret der Brunnerschen Drüsen der praepylorischen Region und des proximalen Duodenums gefunden (MEITZ et al. 1978). Bei Zugabe von Insulin in supraphysiologischer Dosis wurde eine erhöhte Bindungsaffinität der Zellen für EGF gemessen (CONTEAS et al. 1989). Dies könnte eine Erklärung für den Synergismus dieser beiden Supplemente bei der Zellkultivierung sein.

Heparin:

Heparin inhibierte ab Konzentrationen von 100 µg/ml die Proliferation von Zellen der glatten Muskulatur (smooth muscle like cells). Zugabe von Heparin zum Medium ließ einen deutlichen Anstieg des Wachstums epithelialer Zellen erkennen (EVANS et al. 1992).

Hepatocyte Growth Factor (HGF):

HGF konnte das Wachstum fetaler gastrointestinaler Zellen der Ratte dosisabhängig stimulieren (FUKAMACHI et al. 1994). HGF-mRNA wird nur in mesenchymalen Zellen exprimiert, während der HGF-Rezeptor c-met sowohl in epithelialem als auch in mesenchymalem Gewebe nachgewiesen wurde. Die Reaktion auf die mitogene Aktivität des HGF differierte je nach Gewebstyp, so war zum Beispiel das Epithel des Drüsenmagen etwas stärker stimulierbar als das des Darms. EGF wurde durch HGF in seiner Wirkung substituiert.

HGF verlor in Abwesenheit von Hydrocortison und Transferrin seine stimulierende Wirkung, was auf komplexe Interaktionen zwischen HGF und den anderen Wachstumsfaktoren hinweist.

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2.3.2. Extrazelluläre Matrix

Die Anheftung der Epithelzellpopulation an die Kulturgefäße wurde durch unterschiedliche Arten der Beschichtung mit extrazellulären Matrixkomponenten verstärkt.

Eine verbesserte Anheftung von Epithelzellen der Ratte an die Kulturgefäße wurde durch Verwendung von Kornealendothelien des Rindes und 3T3-Fibroblasten als biologische Matrix registriert (EVANS et al. 1992). Auch bei Verwendung von Kollagenen aus der Rinderhaut, bzw. aus den Sehnen von Rattenschwänzen, wurde ein gutes Anheften der Epithelzellen auf diesen Unterlagen beobachtet. Auf diesen Matrizes wurde jedoch nur die Anheftung der Zellen, nicht aber deren Proliferation begünstigt. Ein Vergleich von normalen Plastikzellkulturgefäßen mit Fibronectin oder Kollagen I und IV beschichteten Unterlagen ergab keine Unterschiede bezüglich einer verstärkten Anheftung. Als äußerst ungünstig erwiesen sich Beschichtungen mit 1 – 2 mm dicken hydrierten Kollagengelen und Matrigel.

Letzteres stellt einen Extrakt der Basalmembran des Engelbreth-Holm-Swarm Tumors der Maus dar, welcher 60 % Laminin, 30 % Kollagen IV und geringe Mengen anderer Proteine enthält (KLEINMANN et al. 1986).

Durch Trypsinverdau gewonnene Darmepithelzellen des Kaninchens zeigten ein zweifach stärkeres Anheften auf matrigelbeschichteten Zellkulturflaschen im Vergleich zu normalen Plastikzellkulturgefäßen. Auch die Wachstumskapazität der Zellen auf Matrigel war signifikant höher (NGUYEN et al. 1992).

Differenzierte Enterozyten des Menschen wiesen nach Aussaat auf kollagenbeschichteter Unterlage ein intensiveres Ausbreiten von Epithelzellkolonien auf. Diese waren auf Kollagen im Vergleich zu Plastik auch länger lebensfähig, expandierten stärker und konfluierten zu Monolayern ( PERREAULT u. BEAULIEU 1998).

Intestinale Epithelzellen der Maus bildeten bei Verwendung semipermeabler transparenter Filter, die mit Kollagen beschichtet waren, Monolayer und behielten ihre strukturelle Polarität bei (BENS et al. 1996).

Die Verwendung extrazellulärer Matrix war nicht nur für die Anhaftung der Epithelzellen von Bedeutung, sondern beeinflußt auch den Phänotyp der kultivierten Zellen. So zeigte sich beispielsweise, daß fetale Darmepithelzellen des Menschen, sofern sie auf normalen Plastikzellkulturgefäßen gezogen wurden, völlig undifferenziert waren. Wachstum auf Matrigel hingegen bewirkte, daß die Zellen ausdifferenzierten, eine polarisierte Struktur und Aktivität von alkalischer Phosphatase aufwiesen (SANDERSON et al. 1995).

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2.4. Methoden zur Anreicherung der Darmepithelzellen

Die aus dem Darm gewonnenen Epithelzellen waren häufig hochgradig mit anderen Zelltypen (Fibroblasten, Zellen der glatten Muskulatur, etc.) verunreinigt. Daher wurden Methoden entwickelt, um diese nicht erwünschten Zellen an der Anheftung und am Wachstum soweit zu hindern, daß sie nicht Überhand nahmen und dadurch die Kultivierung der Epithelzellen behinderten. Andererseits werden Epithelzellen durch mesenchymale Komponenten in Wachstum und Differenzierung unterstützt. So zeigte sich beispielsweise, daß sowohl in Organkulturen (FUKAMACHI u. TAKAYAMA 1980) als auch bei Monolayerkulturen undifferenzierter Epithelzellen der Ratte (KEDINGER et al. 1986, 1987a) durch mesenchymale Faktoren Morphogenese und Zelldifferenzierung induziert werden konnten.

Während Epithelzellen in Mischkulturen mit Fibroblasten proliferierten (QUARONI u. MAY 1980), hafteten reine Epithelzellpopulationen zwar auf Zellkulturunterlagen, degenerierten jedoch nach kurzer Zeit (QUARONI u. MAY 1980; VIDDRICH et al. 1988).

Eine Eliminierung unerwünschter Zelltypen in Epithelzellkulturen wurde sowohl über physikalische Methoden (differentielle Sedimentation) als auch über Zusätze im Medium, die das Wachstum der mesenchymalen Zellen behindern sollten, erreicht. Die Methode der differentiellen Sedimentation beruht auf der Beobachtung, daß sich nach Aussaat einer Zellsuspension, die aus mesenchymalen und epithelialen Zellen bestand, die mesenchymalen Zellen vor den Epithelzellen auf dem Boden der benutzten Kulturgefäße festsetzten. Somit war es möglich, diese unerwünschten Zellen zu verwerfen, wenn nur noch mit dem Kulturüberstand, in dem Epithelzellen angereichert waren, weitergearbeitet wurde (MOYER et al. 1990). Weiterhin war es möglich, unerwünschte Fibroblasten selektiv aus Epithelzellkulturen zu entfernen, da sie sich beim Passagieren mit Trypsin oder EDTA sehr viel früher als die Epithelzellen von ihrer Unterlage lösten (OWENS 1976).

Eine Anreicherung von Epithelzellen aus Mischkulturen gelang durch den Einsatz von Klonierzylindern. Von diesen eingekreist konnten reine Epithelzellkolonien, die keine Kontamination mit Fibroblasten aufwiesen, getrennt von den Zellen, welche sich außerhalb des Zylinders befanden, selektiv isoliert werden (QUARONI et al. 1979).

Eine neuere Methode zur Entfernung von Fibroblasten aus Epithelzellkulturen besteht in der mehrmaligen Zentrifugation des frisch isolierten Krypten-Fibroblasten-Gemisches vor der Kultivierung in einem 2%igen D-Sorbitolgradienten. Die als Einzelzellen im Zentrifugationsüberstand vorliegenden Fibroblasten wurden verworfen, wohingegen die

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ganzen Krypten, die sich im Pellet fanden, weiterverwendet wurden (FOELLMANN et al.

2000).

Ein Zusatz von Kollagenase (Typ I) zum Medium wurde genutzt, um in Mischkulturen, die aus epithelialen und mesenchymalen Zellen bestanden, das Wachstum von Fibroblasten zu behindern. Während ohne Zusatz von Kollagenase häufig Kolonien aus Fibroblasten auftraten, wurden in Anwesenheit von Kollagenase nur wenige und bedeutend kleinere dieser Fibroblastenkolonien beobachtet (QUARONI et al. 1979). Die Anzahl der Epithelzellkolonien variierte allerdings von Versuch zu Versuch stark.

Zugesetztes Heparin wirkte in vitro als starker Inhibitor der Proliferation von Zellen der glatten Muskulatur (WRIGHT et al. 1988; EVANS et al. 1992) und stimulierte das Wachstum von Epithelzellen signifikant (EVANS et al. 1992).

Die Zugabe von cis-4-hydroxy-L-Prolin, einem Prolinanalog, welches die Kollagenbiosynthese durch Verhinderung der Tripelhelixformation beeinflußt, beseitigte Fibroblastenkontaminationen in Mischkulturen effektiv, ohne das Wachstum der Epithelzellen zu beeinflussen (KAO u. PROCKOP 1977).

Die Kultivierung von Zellen in einem D-Valin-haltigen, und somit L-Valin-freien Medium ermöglichte die Selektion auf D-Aminosäureoxidasepositive Zellen. Da die meisten Fibroblasten aus Nager- oder Menschennieren D-Aminosäureoxidasenegativ sind, konnten sie durch mehrere Passagen in einem Medium mit D- anstelle von L-Valin entfernt werden (GILBERT u. MIGEON 1975). Diese Technik wurde bei der Etablierung von Kulturen porziner Darmepithelzellen versucht; jedoch wurde das Wachstum der Darmfibroblasten nicht wesentlich behindert (KAEFFER et al.1993).

2.5. Methoden zur Herstellung permanenter Darmepithelzellinien

Die meisten Darmepithelzellkulturen waren sehr kurzlebig und die Zellen verfügten in Kultur über keine besonders ausgeprägte Proliferation. Daher wurden verschiedene Methoden eingesetzt, um Zellinien zu entwickeln und hierdurch gut charakterisierte Darmepithelzellen über einen längeren Zeitraum zur Verfügung zu haben. Die Produktion permanenter Darmepithelzellinien wurde entweder durch Verwendung transgener Tiere versucht, die ein Onkogen beherbergen, welches die Darmepithelien zu laufender Proliferation anregt, oder durch die Transfektion etablierter Zellinien mit Onkogenen. Folgende Onkogene wurden häufig verwendet: das Simian Virus 40 große T-Antigen (SV40TAg), das Adenovirus E1A/E1B und das Papillomavirus E6/E7, welche alle DNA-Synthese induzieren. Das

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verlängerte Wachstum der Zellen war direkt gekoppelt an das Binden und Inaktivieren der Retinoblastoma (pRb)- und p53 Tumorsuppressorproteine (FANNING u. KNIPPERS 1992;

NEVINS 1994). Das SV40TAg verband beide inhibitorischen Aktivitäten im gleichen Protein (FANNING u. KNIPPERS 1992).

2.5.1. Verwendung transgener Tiere

Eine temperatursensitive Mutante (tsA58) des SV40TAg wurde zur Produktion eines transgenen Mäusestammes genutzt (JAT et al. 1991). Diese H-2Kb-tsA58-transgenen Mäuse exprimierten die thermolabile Mutante tsA58 unter der Kontrolle eines durch Interferon- gamma induzierbaren H-2Kb-Promotorelements in jeder Körperzelle. Das Genprodukt war bei normaler Körpertemperatur der Maus inaktiv, konnte aber durch die permissive Temperatur von 33°C in Kultur aktiviert werden und bewirkte eine Immortalisierung der Zellen. Die so unsterblich gemachten Zellen wiesen Charakteristika von unreifen Kryptzellen auf (WHITEHEAD et al. 1993). Sofern die Zellen bei nichtpermissiver Temperatur (39,5°C;

weniger stark ausgeprägte Reaktion bei 37°C) oder ohne Interferon-gamma kultiviert wurden, trat ein Proliferationsstop mit Ablösen der Epithelzellen von ihrer Unterlage ein.

Weiterhin gelang es, immortalisierte Zellen mit Kryptepithelzellmorphologie und –funktion aus der Basis der Dünndarmvilli von zwanzig Tage alten Feten L-Pyruvatkinase (L-PK)/TAg transgener Mäuse zu erhalten (BENS et al. 1996). Diese Mäuse exprimierten das SV40TAg1 unter der Kontrolle der 5´regulatorischen Sequenz des L-PK-Gens gewebsspezifisch in Leber, Dünndarm, Niere und Pankreas (CARTIER et al. 1992). Durch Zugabe von Glukose wurde die L-Pyruvatkinase aktiviert, was wiederum zur Aktivierung der TAg-Transkripte führte (CARTIER et al. 1992). Zellen, die das kernassoziierte SV40TAg exprimierten, waren durch Langlebigkeit, Expression von Epithelzellmarkern, Polarisation und Expression von Aminopeptidase, Dipeptidyl-Peptidase IV, Glukoamylase und Sucrase-Isomaltase gekennzeichnet (BENS et al. 1996).

2.5.2. Transfektion primärer Zellinien

Erste Versuche, Epithelzellen durch zelluläre oder virale Onkogene zu immortalisieren, resultierten in Zellpopulationen, die zwar fortlaufend proliferierten, jedoch kaum intestinale Differenzierungsmarker exprimierten (EMAMI et al. 1989; PORIES et al. 1992).

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Durch Transfektion von Epithelzellen mit Plasmiden, die das thermolabile SV40TAg unter der Kontrolle des SV40 early promoters (pZipSVtsa58) enthielten, war es möglich, konditionell immortalisierte Enterozyten zu erhalten (QUARONI et al. 1993). Diese Zellen proliferierten bei einer permissiven Temperatur von 32°C, wohingegen die Proliferation durch Kultivierung der Zellen bei 39°C gestoppt werden konnte. Das Einstellen der Zellteilung resultierte in einer Induktion der Zelldifferenzierung. Somit war die Zellproliferation zu Gunsten der Zelldifferenzierung „abschaltbar“. Versuche, Epithelzellen mit Plasmiden, die das SV40TAg unter der Kontrolle des schwermetallinduzierbaren Metallothioneinpromotors (pMTWt) enthielten, zu transfizieren, erbrachten generell proliferierende Zellen. Das SV40TAg wurde in diesem Fall immer produziert, unabhängig davon, ob der Promotor durch Zugabe oder Weglassen von Zink im Kulturmedium induziert oder nicht induziert war (QUARONI et al. 1993).

Intestinale epitheloide und fibroblastoide Zellen aus Organkulturen aus dem Ileum des Schweines wurden ebenfalls erfolgreich mit einem SV40-Plasmid transfiziert (KAEFFER et al. 1993). Diese Zellen wiesen einen undifferenzierten Status auf. Die Konversion von einem transformierten zu einem nicht-transformierten Phänotyp durch Zugabe von 2 % Dimethysulfoxid zum Kulturmedium gelang nicht. Letzteres sollte die TAg-Expression verhindern, jedoch wurde das LT-Protein weiterhin im Zellkern der Epithelzellen nachgewiesen.

Auch bei Darmepithelzellen menschlicher Feten wurde eine konditionelle Immortalisation mit einer temperatursensitiven Mutante des SV40TAg durchgeführt (QUARONI u. BEAULIEU 1997). Die Etablierung der temperatursensitiven fetalen humanen intestinalen (tsFHI) Zellen war allerdings stark abhängig von deren Anzucht in einem speziellen Wachstumsmedium. Die alleinige Expression des funktionellen TAg reichte nicht aus, den Zellen verlängerte Proliferationskapazität zu verleihen. Wurden tsFHI-Zellen in diesem Medium bei 32°C kultiviert, so proliferierten sie stark und exprimierten Kryptzellmarker. Fand die Kultivierung der Zellen bei einer Temperatur unter 39° C statt, war ein irreversibler Wachstumsstop und der Erwerb eines differenzierten Enterozytenphänotyps zu beobachten. Diese Feststellung entsprach früheren Erkenntnissen, daß die Induktion von Differenzierung mit einem Verlust der Zellproliferation einhergeht (GORDON u. HERMISTON 1994).

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2.6. Charakterisierung von Darmepithelzellkulturen

Um zu erkennen, ob reine Epithelzellkulturen oder Mischkulturen, die mit mesenchymalen Zellen verunreinigt waren, vorlagen, wurden immunhistochemische Reaktionen zur Darstellung der Intermediärfilamente der Zellen durchgeführt. Nur in Epithelzellen ließ sich das Intermediärfilament Cytokeratin darstellen. In Zellen der glatten Muskulatur war smooth muscle alpha actin, in den perikryptalen Fibroblasten Desmin und im Bindegewebe Vimentin nachweisbar (EVANS et al. 1992; MOLL et al. 1982). Da Darmepithelzellen je nach Herkunft und Differenzierungsgrad sehr unterschiedliche Eigenschaften aufwiesen, war es notwendig, den nach diversen Isolierungs- und Kulturverfahren vorherrschenden Zelltypen genauer zu charakterisieren. Hierbei orientierte man sich vor allem an den Charakteristika der Darmepithelzellen in den verschiedenen Darmabschnitten und in den Bereichen der Zotten und Krypten.

Das Dünndarmepithel zählt zu den sich besonders aktiv erneuernden Geweben des Körpers.

Undifferenzierte Kryptepithelzellen proliferieren im mittleren Abschnitt der Krypten. Ein Teil der Zellen bleibt als Stammzellen in den Krypten, die anderen wandern zur Zottenspitze hoch.

Sie differenzieren überwiegend zu enteroadsorptiven Zellen und Becherzellen aus, einige jedoch auch zu enteroendokrinen, Panethschen oder selteneren Zelltypen (TRIER u.

MADARA1981). Im Laufe ihrer Differenzierung kommt es bei den enteroadsorptiven Zellen zur Expression verschiedener Enzyme, die für digestive und adsorptive Funktionen wichtig sind. Außerdem treten Änderungen in Bezug auf die Morphologie und Transportfunktionen der Zelle ein. Die reifen, ausdifferenzierten Zellen sind mitotisch inaktiv. Die Zellerneuerung beträgt in der Regel zwei bis drei Tage (CAIRNIE et al. 1965; LESHER et al. 1961; CHENG u. LEBLOND 1974). Durch den kontinuierlichen Verlust ausdifferenzierter Zellen ins Darmlumen entsteht ein Gleichgewicht mit der Zellteilung in den Krypten (CHENG u.

LEBLOND 1974; QUASTLER u. SHERMAN 1959; ALDEWACHI et al. 1975). Die Regulation der Zellproliferation erfolgt im Wesentlichen über epithelial-mesenchymale Interaktionen. Mesenchymale Zellen der Maus beeinflussen die Reifung von Darmepithel in der Organkultur (FUKAMACHI u. TAKAYAMA 1980). Sie spielen auch eine wesentliche Rolle in der Morphogenese und Differenzierung endodermaler Zellen in Kultur (KEDINGER et al. 1986, 1987a).

Je nachdem, ob es sich bei den kultivierten Enterozyten um unreife, proliferierende oder aber um funktionell ausdifferenzierte Zellen handelte, ließen sich Unterschiede in Bezug auf

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Morphologie, Proliferationsverhalten, Enzymausstattung und Expression bestimmter Zellmarker feststellen.

2.6.1. Morphologie des Epithelzellverbandes und der einzelnen Darmepithelzelle

2.6.1.1. Undifferenzierte Darmepithelzellen

Undifferenzierte Kryptzellinien der Ratte (IEC´s) bestanden aus einer homogenen Population epitheloid-polygonaler Zellen mit großen, ovalen Zellkernen, die in Kolonien wuchsen (QUARONI et al. 1979). Rasterelektronenmikroskopisch waren dünne, kurze Mikrovilli sichtbar, die sich hauptsächlich im perinukleären Bereich befanden. In supranukleären Arealen waren keine Mikrovilli nachweisbar, und in der Zellperipherie waren sie relativ schwach vorhanden, was für eine wenig deutliche Polarisierung der Zellen spricht (QUARONI et al. 1979). Bei der transmissionselektronenmikroskopischen Untersuchung stellten sich in den IEC´s gut entwickelte Golgi-Apparate dar. Stränge von Mikrofilamenten durchzogen die Zellen, mit stärkerer Ausprägung an der Zelloberfläche und an den Zellgrenzen. Ein hohes Aufkommen sowohl an freien als auch an das endoplasmatische Reticulum gebundenen Ribosomen wurde ebenfalls beobachtet. Mitochondrien zeigten klar abgegrenzte Cristae. Die Zellkerne wiesen zahlreiche Poren und gestreutes Chromation auf.

Auch zellverbindende tight junctions wurden registriert (QUARONI et al. 1979). Desweiteren waren elektronendichte zytoplasmatische Körperchen zu beobachten, ähnlich denen, die als charakteristisch für die intestinalen Stammzellen in den Krypten beschrieben wurden (TRIER 1968). Nicht nachgewiesen werden konnten spezialisierte Zellen wie Becher- und Panethsche Zellen. Auch Weibel-Paladesche Körperchen traten nicht auf (QUARONI et al. 1979).

2.6.1.2. Differenzierte Darmepithelzellen

Darmepithelzellen der Ratte, die nach Kultivierung auf Kollagengelen ausdifferenzierten, stellten sich bei der transmissionselektronenmikroskopischen Untersuchung als ein Epithelverband aus kuboidalen Zellen mit basal angeordneten Zellkernen und einer großen Anzahl an Mikrovilli dar. Auf der apikalen Zelloberfläche war ein organisierter Bürstensaum vorhanden (FUKAMACHI et al. 1992). Auf der basalen Seite der Zellen war die Oberfläche relativ glatt und mit wenigen zytoplasmatischen Ausläufern versehen. Die morphologisch recht einheitlichen Zellen waren untereinander mit tight junctions auf Höhe der Mikrovilli

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und Desmosomen an den lateralen Seiten verbunden (FUKAMACHI et al. 1992;

HARTMANN et al. 1982). Zellen mit serösen oder muzinhaltigen Granula wurden nicht beobachtet. Aufgrund dieser Charakteristik entsprach der Zelltyp in Primärkultur demnach den adsorptiven Epithelzellen.

In Organkulturen wiesen die Epithelzellen nach einer Woche ebenfalls Charakteristika differenzierter Enterozyten auf mit ausgeprägtem Bürstensaum, interdigitierenden Zellausläufern an den lateralen Zellgrenzen, tight junctions, Desmosomen, endozytischen Komplexen und großen lysosomalen Vakuolen. Gleichzeitig waren aber noch mesenchymale Zellen unterhalb der einfachen Lage von Epithelzellen zu beobachten. Die beiden Zelltypen waren durch eine Basallamina getrennt. Direkte Kontakte zwischen epithelialen und mesenchymalen Zellen über Ausläufer der Epithelzellen durch Lücken in der Basallamina konnten nicht beobachtet werden. Zusätzlich wurde das Auftreten zahlreicher Becher- und einiger enteroendokriner Zellen, nicht jedoch undifferenzierter Kryptepithelzellen registriert (QUARONI 1985; DeRITIS 1975).

Primärkulturen ausdifferenzierter Epithelzellen enthielten absorptive Epithel- und Becherzellen. Ultrastrukturell waren organisierte Bürstensäume und Schlußleisten, die aus tight junctions, Zonulae adhaerens und Desmosomen bestanden, zu erkennen. (PERREAULT u. BEAULIEU 1998).

Ein weiteres Charakteristikum eines polarisierten, differenzierten Epithelzellverbandes, der als konfluenter Monolayer wuchs, war der transepitheliale elektrische Widerstand. Dieser war zum Beispiel in konditionell immortalisierten Zellen, die oberhalb der permissiven Temperatur in einem speziellen Differenzierungsmedium gehalten wurden, meßbar (QUARONI u. BEAULIEU 1997).

2.6.2. Proliferationsverhalten

Kryptepithelzellinien der Ratte (IEC´s) zeigten eine schnelle Proliferation, wenn sie in geringer Dichte ausgesät wurden; bei höherer Dichte nahm die Teilungsgeschwindigkeit hingegen ab (QUARONI et al. 1979). Bei höherer Passagenzahl verringerte sich bei einzelnen IEC´s die Wachstumsrate ebenfalls. So konnte die IEC-6-Linie nur ca. 30 bis 40mal passagiert werden; IEC-14-Zellen jedoch über 100mal, ohne daß eine Veränderung der Proliferationsrate zu beobachten war. Bei sehr niedriger Zelldichte proliferierten IEC-6 im

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Gegensatz zu IEC-14 Zellen schlecht. IEC-14-Zellen wiesen keinen Wachstumsstop auf, wenn eine konstante Sättigungsdichte erreicht wurde.

Sequentiell isolierte Epithelzellen aus dem unteren Villus-Krypt-Bereich von Ratten wiesen eine hohe Inkorporation von radioaktiv markiertem Thymidin in die Zell-DNA auf, was auf eine hohe Proliferationsrate hinwies (HARTMANN et al. 1982). Auch konditionell immortalisierte humane Darmepithelzellen wiesen bei permissiver Temperatur in einem speziellen Wachstumsmedium eine hohe Proliferationsrate auf (QUARONI u. BEAULIEU 1997).

Epithelzellen, die unter ihren Kulturbedingungen ausdifferenzierten – beispielsweise durch gleichzeitige Anwesenheit und Stimulation von mesenchymalen Zellen – proliferierten nur in den ersten Tagen der Kultur. Danach kam es mit zunehmender Ausreifung der Zellen zum Proliferationsstop (KONDO et al. 1985; QUARONI 1985). Der differenzierungsinduzierte Verlust der proliferativen Aktivität war irreversibel (SCHMIDT et al. 1985; GORDON u.

HERMISTON 1994). Häufig zeigten die ihr Wachstum beendenden Epithelzellen gleichzeitig die Tendenz, sich von ihrer Unterlage zu lösen, was dem Verhalten der Zelle in vivo, sich nach der terminalen Differenzierung abzulösen und schließlich ins Darmlumen abgestoßen zu werden, entsprechen würde (PAUL et al. 1993; CHENG u. LEBLOND 1974).

2.6.3. Intermediärfilamente, Zytoskelett, Zellverbindungen

Sowohl in undifferenzierten als auch in ausgereiften Epithelzellen konnte Cytokeratin immer nachgewiesen werden (SUN et al. 1979; OSBORN et al. 1982; FRANKE et al. 1979; LANE u. KLYMKOWSKY 1982; SCHMID et al. 1983; WOODCOCK-MITCHELL et al. 1982).

Teilweise wiesen die unterschiedlichen Differenzierungsstadien der Darmepithelzellen eine unterschiedliche Expression einzelner Cytokeratine auf.

Das Vorkommen von Cytokeratin 18 ist bei der Ratte ausschließlich auf die proliferativ aktive Kryptregion begrenzt (FLINT et al. 1994). Auch Cytokeratin 19 wurde bei der Ratte hauptsächlich in den Darmkrypten nachgewiesen (QUARONI et al. 1991; CALNEK u.

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QUARONI 1992), wohingegen es im menschlichem Darm vorrangig mit den Becherzellen assoziiert zu sein schien (PERREAULT u. BEAULIEU 1996). Marker für desmosomale Komponenten oder tight junctions kamen auch in undifferenzierten Epithelzellen vor. Hier war ihr Auftreten allerdings nicht vorrangig an die Zellperipherie gebunden, wie es bei ausgereiften Zellen der Fall war (PERREAULT u. BEAULIEU 1996; GUMBINER 1990).

Für Villusepithelien der Ratte war das Vorkommen von Cytokeratin 8 und 21 charakteristisch (CALVERT u. QUARONI 1992).

Darüber hinaus ist für ausgereifte absorptive Enterozyten das Vorhandensein eines Bürstensaums kennzeichnend. Es handelt sich hierbei um eine spezialisierte Domaine der Plasmamembran, die sich aus Mikrovilli zusammensetzt, die während der terminalen Differenzierung der Zellen stark an Zahl zunehmen. Der axiale Strang an Mikrofilamenten eines Mikrovillus enthält ein kalziumreguliertes aktinbindendes Protein, das Villin (BRETSCHER u. WEBER 1979; 1980). Villin kam in differenzierten, polarisierten Zellen, die einen ausgeprägten Bürstensaum aufweisen, in etwa zehnfach höherer Menge vor als in undifferenzierten Zellen (ROBINE et al. 1985; PRINGEAULT et al. 1986; DUDOUET et al.

1987). In letzteren traten die Mikrovilli nämlich nur unregelmäßig auf und waren nicht zu einem Bürstensaum organisiert.

Das tight junction-Protein ZO-1 wurde bei differenzierten menschlichen Zellen mit einer Verteilung um die Zellkontakte herum nachgewiesen (QUARONI u. BEAULIEU 1997).

Auch das desmosomale Protein ließ sich in dieser Lokalisation immunzytochemisch nachweisen (PERREAULT u. BEAULIEU 1998). Filamentöses Aktin, welches einen perijunctionalen Ring um die Epithelzellen bildet, war sowohl bei differenzierten als auch bei proliferierenden Zellen vorhanden (PAUL et al. 1993).

2.6.4. Enzymausstattung

Kulturen undifferenzierter Kryptepithelzellen ließen sich nicht mit Antikörpern gegen aufgereinigte Bürstensaummembranen markieren (QUARONI et al. 1979). Von den undifferenzierten Darmepithelzellen werden nur wenige, von den differnzierten

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Darmepithelzellen zahlreiche Verdauungsenzyme exprimiert. Eine Ausnahme von der Regel, daß undifferenzierte Zellen nicht über die Enzyme alkalische Phosphatase, Dipeptidylpeptidase IV und Sucrase verfügen, stellen konditionell immortalisierte Zellen der Maus dar. Bei diesen konnten die genannten Enzyme nachgewiesen werden, obwohl die Zellen ultrastrukturell einen undifferenzierten Phämotyp aufwiesen (WHITEHEAD et al.

1993). Einzelne Verdauungsenzyme, wie beispielsweise die beiden Peptidasen Aminopeptidase N und Dipeptidylpeptidase IV, konnten auf der luminalen Seite von menschlichen Villus- und auch Kryptepithelzellen nachgewiesen werden (QUARONI et al.

1992; GOVEL et al. 1991). Sie eignen sich in Zellkultur nicht als Differenzierungsmarker, da ihr Auftreten auch bei nicht differenzierten Zellinien beobachtet werden konnte (PERREAULT u. BEAULIEU 1996).

Die Aktivität der Bürstensaumenzyme variiert entlang der Krypt-Villus-Achse je nach Differenzierungsgrad der Zellen (DAHLQVIST 1966; RAUL et al. 1977; SIMON et al. 1979;

WEISER 1973; NEGREL u. AILHAUD 1975). Dies spiegelt sich auch in den Befunden in der Zellkultur wieder. In nur teilweise ausdifferenzierten primären Epithelzellkulturen der Ratte, die unter serumfreien Bedingungen wuchsen, ließen sich in Zellhomogenaten eine schwache Aktivität für Aminopeptidase, allerdings nicht für alkalische Phosphatase oder alpha-Glukosidase feststellen (FUKAMACHI 1992). Im Gegensatz hierzu waren in der apikalen Membran von Darmepithelzellen fetaler Ratten, die in Anwesenheit differenzierungsfördernden Mesenchyms wuchsen, die Enzyme Laktase, alkalische Phosphatase, Aminopeptidase und Maltase bereits nach acht Tagen in Kultur nachweisbar (QUARONI 1985). Durch Hinzufügen von Hydrokortison zum Kulturmedium war es möglich, das Enzym Sucrase-Isomaltase zu induzieren, welches zuvor nicht nachweisbar gewesen war.

Bei durch sequentielle Isolierung gewonnenen Enterozyten der Ratte ließen sich bei Zellen aus dem mittleren Bereich der Villi hohe Sucraseaktivitäten nachweisen. Die Aktivität der alkalischen Phosphatase war am stärksten in Zellen der Zottenspitze ausgeprägt (HARTMANN et al. 1982). In mit dieser Methode gewonnenen Darmepithelzellen der Maus lag in den Zellen des oberen Drittels der Villi ein Aktivitätsmaximum für Glukoamylase, Trehalase, Laktase und Maltase vor (POTHIER u. HUGON 1980).

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Ein signifikanter Anstieg der Enzymaktivitäten von Aminopeptidase N und Dipeptidylpeptidase IV konnte nach Umstellung der Kulturbedingungen konditionell immortalisierter fetaler Rattenzellen auf nicht permissive Temperatur (gleichbedeutend mit einem Abbrechen der Proliferation und Einleitung der Zelldifferenzierung) beobachtet werden (PAUL et al. 1993). Dies entsprach in vivo-Studien (DARMOUL et al. 1991) für Dipeptidylpeptidase IV, bzw. für Aminopeptidase N (NOREN et al. 1989), bei denen eine deutlich höhere Aktivität dieser Enzyme im Villusbereich im Vergleich zur Kryptregion der Darmmukosa festgestellt werden konnte. Auch bei konditionell immortalisierten Zellen menschlicher Feten, bei denen die Differenzierung induziert wurde, konnte das Enzym Dipeptidylpeptidase nachgewiesen werden (QUARONI u. BEAULIEU 1997).

2.6.5. Sonstige Zellmarker

Polyklonale Seren, die gegen die Plasmamembran von Kryptzellen (anti-crypt cell plasma membrane antiserum) hergestellt wurden, reagierten spezifisch mit der luminalen Membran intestinaler Villus- und Kryptzellen (QUARONI et al. 1979). Ein weiterer Kryptzellmarker ist das Antigen MIM-1/39, ein 350-kDa Glykoprotein, das sowohl bei der Maus (BEAULIEU et al. 1992; CALVERT et al. 1993) als auch beim Menschen (PERREAULT u. BEAULIEU 1996) ausschließlich von Kryptepithelzellen im Dünndarm exprimiert wird. Bei der Maus läßt sich dieses Antigen sowohl bei jungen als auch bei adulten Tieren nachweisen. Bei immortalisierten Kryptepithelzellen konnten auf der basolateralen Zelloberfläche Polyimmunglobulinrezeptoren nachgewiesen werden. Mit Hilfe dieser Rezeptoren findet in der Darmschleimhaut eine Transzytose von dimerem Immunglobulin A ins Darmlumen statt (KRAEHENBUHL u. NEUTRA 1992; SOLARI et al. 1985).

Sofern es zur Ausdifferenzierung von funktionell spezialisierten Darmepithelzellen unter Kulturbedingungen kam, ließ sich dies mit verschiedenen morphologischen Methoden nachweisen. Zur Darstellung von Becherzellen wurden vor allem spezielle Färbetechniken wie die PAS-Reaktion oder Mayer´s Muzikarmin-Färbung verwendet (KONDO et al. 1985;

PUTT 1972). Im Phasenkontrastmikroskop ließ sich eine große Anzahl dunkler Granula im

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Zytoplasma der Becherzellen gut darstellen (KONDO et al. 1984). Bei enteroendokrinen Zellen konnten ultrastrukturell zahlreiche elektronendichte sekretorische Granula in den basalen Regionen des Zytoplasma nachgewiesen werden. Bei Panethschen Zellen waren große osmiophile Granula zu erkennen (POTHIER u. HUGON 1980).

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3. Material und Methoden

3.1. Material 3.1.1. Tiere

Zur Gewinnung der Darmepithelzellen wurden insgesamt 26 Rinderfeten beiderlei Geschlechts, die vom Schlachthof in Gleidingen zur Verfügung gestellt wurden, verwendet (Tab. 2).

Tab. 2: Liste der verwendeten Feten

Tier-Nr. Geschlecht NSL [Dünndarm- länge] in cm

Berechnet. Alter in Mon.

Probenentn. f. Histologie/

Immunhistologie

E 4169 M 60 7,5 F, K

E 4170 W 25 4,5 F, K

E 4171 M 25, [193] 4,5 F

E 4172 W 35, [440] 5,5 F

E 4173 W 45, [387] 6,0 -

E 4174 W 48, [548] 6,5 F

E 4175 W 35, [478] 5,5 F

E 4176 W 60, [987] 7,5 F

E 4177 W 39, [507] 6,0 F

E 4178 W 42, [519] 6,0 F

E 4179 W 33, [347] 5,5 F

E 4180 M 39 6,0 F

E 4181 M 29 5,0 F

E 4182 W 53 7,0 F

E 4183 M 27 4,5 F

E 4184 M 28 5,0 -

E 4185 W 24 4,5 F

E 4186 M 30 5,0 F, K

E 4187 W 39 6,0 F

E 4188 M 29 5,0 F

E 4189 M 39 6,0 F, K

E 933 W 33 5,5 F, K

E 934 W 39 6,0 F, K

E 935 M 49 6,5 F, K

E 936 W 36 5.5 F, K

E 937 W 35 5,5 F, K

F = Formalinfixierte Proben K = Tiefgefrorene Proben W= weiblich M= männlich

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Die Nackensteißlängen (NSL) der Tiere variierte von 24 bis 60 cm. Aufgrund der Formel Nackensteißlänge = X x ( X + 1 ), wobei X dem Trächtigkeitsmonat entspricht (AHLERS u.

ANDRESEN 1996), ließ sich das Alter der Feten auf viereinhalb bis sieben Monate schätzen.

Die Zeitspanne von der Schlachtung des Muttertieres bis zur endgültigen Verarbeitung des Darmes betrug zwischen einer und acht Stunden.

3.1.2. Sonstige Materialien

Rezepturen für Medien, Puffer, Lösungen, sowie sonstige Chemikalien werden, soweit hier nicht näher beschrieben, im Anhang unter 9. aufgeführt.

3.2. Methoden

3.2.1. Entnahme des Darmes

Die Feten wurden an den Hintergliedmaßen aufgehängt, das Abdomen mit Alkohol entfettet und jodiert und die Bauchhöhle eröffnet. Hierzu wurden Haut- und Muskelschichten mit einem Skalpell parallel zur Linea alba in einer Länge von 5 – 7 cm durchtrennt. Das Bauchfell wurde mit einer Pinzette angehoben und mit einer Schere eröffnet. Der Darm wurde nun vorgelagert und in Höhe des Duodenums und des Rektums durchtrennt. Nach dem Durchschneiden der Gekrösewurzel wurde der Darm in toto entnommen und sofort auf ein Stahltablett gelegt, welches sich wiederum auf einem zweiten mit Eiswasser bedeckten Stahltablett befand. Der hochgradig mit Mekonium gefüllte Dickdarm wurde abgetrennt und verworfen. Die Darmlänge wurde bei neun Feten nachgemessen und belief sich von ca. 2 m bei einem 4,5 Monate alten Tier bis zu ca. 10 m bei einem 7,5 Monate alten Fetus. Der Dünndarm wurde bis zur weiteren Bearbeitung mit eiskaltem Phosphatpuffer (PBS) befeuchtet.

3.2.2. Aufbereitung des Darmes

Vorab wurden zwei aus dem Bereich des Jejunums und des Ileums 3 – 5 cm lange Darmstücke herausgetrennt und zur Anfertigung von Gewebsschnitten in Formalin fixiert,

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bzw. in –70°C kaltem Isopentan¹ tiefgefroren und bis zur weiteren Bearbeitung bei – 80° C gelagert.

Der restliche Dünndarm wurde insgesamt zur Zellgewinnung verwendet. Hierzu wurde er nach dem Lösen von seiner mesenterialen Anheftung longitudinal eröffnet und in ca. 10 cm lange Segmente zerteilt. Die eröffneten Darmstücke wurden in Glaspetrischalen solange in eisgekühlter PBS gewaschen, bis die Spüllösung klar war.

Zur Gewinnung der Mukosa wurden die einzelnen Darmsegmente mit der Serosaseite nach unten in eine neue Glaspetrischale, die sich ebenfalls auf einem Stahltablett mit Eiswasser befand, verbracht und unter Zuhilfenahme eines Glasobjektträgers oder einer Pinzette an einem Ende festgehalten. Mit einem zweiten Glasobjektträger wurde die Schleimhaut abgestreift (Abb. 1 u. 2). Die Menge der gewonnenen Mukosamasse variierte in Abhängigkeit von der Länge des Dünndarmes der Tiere zwischen ca. 3 und 10 ml. Die auf diese Weise gewonnene Mukosamasse wurde bis zur weiteren Behandlung in abgedeckten Glaszentrifugenröhrchen in PBS mit Penicillin/Streptomycinzusatz auf Eis aufbewahrt.

3.2.3. Anfertigung von Gewebsschnitten

3.2.3.1. Paraplastschnitte

Nach Fixation der entnommenen Darmproben für mindestens 12 Stunden in 4%igem, neutral gepuffertem Formalin wurden 0,5 cm breite Querschnitte angefertigt, über Nacht dehydriert, mit Paraplast² infiltriert und anschließend in Paraplast ausgegossen. Die Einbettung erfolgte mit dem Hypercenter 2³. Anschließend wurden 2 µm dicke Paraplastschnitte mit einem Schlittenmikrotom⁴ angefertigt, im warmen Wasserbad gestreckt und auf Objektträger, die dünn mit Chromalaungelatine (s. Anhang) beschichtet waren, aufgezogen.

3.2.3.2. Gefrierschnitte

Die Proben wurden zunächst auf eine Temperatur von –20° C gebracht. An einem Kryostat⁵ wurden 4 µm dicke konsekutive Gefrierschnitte angefertigt und auf mit Chromalaungelatine

1 2-Methylbutan, Fa. Fluka, Art. 59080

2 Fa. Vogel, Art. VO-5-1002

3 Fa. Shandon, Life Science Int

4 Fa. Reichert Jung, Nussloch

5 HM 500, Fa. Microm, Heidelberg