Tierärztliche Hochschule Hannover
Institut für Nutztiergenetik, Friedrich-Loeffler-Institut
Isolierung, In-vitro-Kultivierung und
Charakterisierung von porzinen und bovinen ovariellen Stammzellen
INAUGURAL - DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Naturwissenschaften
- Doctor rerum naturalium - ( Dr. rer. nat. )
vorgelegt von Irene Röttinger Parabel/Russland
Hannover 2018
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Heiner Niemann Institut für Nutztiergenetik Friedrich-Loeffler-Institut Mariensee
Prof. Dr. Wilfried Kues Institut für Nutztiergenetik Friedrich-Loeffler-Institut Mariensee
1. Gutachterin / Gutachter: Prof. Dr. Heiner Niemann
2. Gutachterin / Gutachter: Prof. Dr. Tobias Cantz Rebirth Exellenzcluster Medizinische Hochschule Hannover
Tag der mündlichen Prüfung: 15.05.2018
Meiner Familie,
insbesondere meinen Eltern
Alexander Bauer (1957-2004)
und
Katarina Bauer
Inhaltsverzeichnis
I. Einleitung ... 1
1.1 Aufbau und Funktion des Ovars ... 3
1.2 Oogenese und Follikulogenese ... 5
1.3 Keimbahnspezifische Stammzellen im Ovar ... 8
1.3.1 Definition von ovariellen Stammzellen ... 8
1.3.2 Geschichtlicher Hintergrund – Ursprung der Debatte ... 9
1.3.3 Aktueller Stand der Forschung ... 12
1.3.3.1 Ovarielle Stammzellen bei Maus und Mensch ... 12
1.3.3.2 Ovarielle Stammzellen bei Nutztieren ... 17
1.4 Isolierung und Charakterisierung von ovariellen Stammzellen ... 20
1.4.1 Anreicherungsmethoden für ovarielle Stammzellen ... 20
1.4.1.1. Oberflächenmarker für ovarielle Stammzellen ... 21
1.4.1.2 Magnetic-activated cell sorting (MACS) und Fluorescence-activated cell sorting (FACS) ... 24
1.4.1.3 Differentielles Plattieren ... 26
1.4.1.4 In-vitro-Kultur von ovariellen Gewebestückchen ... 26
1.4.2 In-vitro-Kultivierung ... 28
1.5 Anwendungsbereiche ovarieller Stammzellen ... 31
1.6 Ziele der Arbeit ... 32
II. Material und Methoden ... 33
2.1 Versuchsdesign ... 33
2.2 Versuchstiere und Ovarentnahme ... 35
2.3 Herstellung einer Einzelzellsuspension aus Ovargewebe ... 36
2.3.1 Vereinzelungsmethode modifiziert nach HONARAMOOZ et al. (2002) .... 37
2.3.2 Vereinzelungsmethode modifiziert nach WOODS und TILLY (2013) ... 38
2.3.3 Bestimmung der Gesamtzellzahl und Vitalität mit Trypanblau ... 39
2.4 Anreicherung ovarieller Stammzellen mittels Magnetic-activated cell sorting (MACS) ... 41
2.5.1 Beschichtung von Zellkulturplatten ... 43
2.5.2 Vorbereiten von Feeder-Zellen ... 44
2.5.3 Medien für die In-vitro-Kultivierung ... 44
2.6 Charakterisierung der ovariellen Zellen ... 46
2.6.1 Immunfluoreszenzfärbung ... 46
2.6.1.1 Antikörpertest in Eizellen und Blastozysten ... 46
2.6.1.2 Antikörpertest in ovariellen Einzelzellsuspensionen ... 49
2.6.1.3 Immunfluoreszenzfärbung von in vitro kultivierten ovariellen Zellen .. 50
2.6.2 Durchflusszytometrische Analyse der ovariellen Zellen ... 50
2.6.3 Genexpressionsanalyse mittels RT-qPCR ... 51
2.6.3.1 Isolierung von poly(A)-RNA aus Eizellen ... 51
2.6.3.2 Isolierung von poly(A)-RNA aus Zellen ... 52
2.6.3.3 Reverse Transkription ... 53
2.6.3.4 SYBR Green-qPCR ... 55
2.6.3.5 Auswertung der qPCR-Ergebnisse ... 58
2.7 Statistische Auswertung der Daten ... 59
III. Ergebnisse ... 60
3.1 Vereinzelung des Ovargewebes ... 61
3.1.1 Prüfung von Vereinzelungsmethoden ... 62
3.1.2 Prüfung von zwei Kollagenasetypen ... 66
3.2 Analyse der VASA- und FRAGILIS-Proteinexpression in ovariellen Suspensionen von Schwein und Rind ... 71
3.2.1 Analyse der VASA-und FRAGILIS-Proteinexpression mittels Konfokalmikroskopie ... 72
3.2.2 Analyse der VASA-und FRAGILIS-Proteinexpression mittels Durchflusszytometrie ... 76
3.3 Anreicherung und Charakterisierung der angereicherten ovariellen Zellen von Schwein und Rind ... 79
3.3.1 Anreicherung ovarieller Stammzellen von Schwein und Rind mittels Magnetic-activated cell sorting (MACS) ... 79
3.3.2 Charakterisierung der selektierten Zellfraktionen von Schwein und Rind
mittels RT-qPCR ... 81
3.3.2.1 Expression von Keimzellmarkern in selektierten Zellfraktionen vom Schwein ... 82
3.3.2.2 Expression von Keimzellmarkern in selektierten Zellfraktionen vom Rind ... 85
3.4 In-vitro-Kultivierung und Charakterisierung der Vasa- und Fragilis- selektierten Zellfraktionen in verschiedenen Zellkulturmedien ... 88
3.4.1 In-vitro-Kultivierung der selektierten Mauszellen ... 89
3.4.2 In-vitro-Kultivierung der selektierten Schweinezellen ... 92
3.4.3 In-vitro-Kultivierung der selektierten Rinderzellen ... 96
IV. Diskussion ... 104
4.1 Isolierung und Anreicherung ovarieller Stammzellen von Schwein und Rind ... 105
4.2 In-vitro-Kultivierung ovarieller Stammzellen von Schwein und Rind ... 109
4.3 Fazit und Ausblick ... 114
V. Zusammenfassung ... 116
VI. Summary ... 120
VII. Literaturverzeichnis ... 123
VIII. Abkürzungsverzeichnis ... 140
IX. Abbildungsverzeichnis ... 143
X. Tabellenverzeichnis ... 150
XI. Anhang ... 151
11.1 Zusammensetzung der verwendeten Kulturmedien ... 151
11.2 Liste der verwendeten Chemikalien ... 154
11.3 Immunfluoreszenzfärbung der in vitro kultivierten ovariellen Zellen ... 156
Danksagung ... 164
I. Einleitung
Seit den 1950er Jahren wird in den Bio-Wissenschaften die Lehrmeinung vertreten, dass der Vorrat an Eizellen im weiblichen Ovar begrenzt ist (ZUCKERMAN 1951). Bei der Geburt besitzen weibliche Säugetiere eine feste Anzahl an Eizellen, von denen die meisten bis zur Pubertät atresieren. Danach reifen während der reproduktiven Phase jeden Monat einige Follikel heran, wobei nur einer davon ovuliert und eine befruchtungsfähige Eizelle abgibt. Ist der Eizellenvorrat aufgebraucht, so kommt es zur Menopause (ZUCKERMAN 1951). Seit die Arbeitsgruppe um Jonathan L. Tilly 2004 erstmals Stammzellen im murinen und humanen Ovar beschrieb, die sich in vitro in Eizellen differenzieren können (JOHNSON et al. 2004, WHITE et al. 2012), wird dieses zentrale Postulat der weiblichen Reproduktion diskutiert. Zur Unterstützung ihrer These wurde dies zunächst durch Zellkulturexperimente, Genexpressionsprofile und Kreuztransplantationen im Mäusemodell untermauert (JOHNSON et al. 2004).
Später folgten Untersuchungen an humanen Ovarien (WHITE et al. 2012). Auch im Schwein (BAI et al. 2013, BUI et al. 2014), Kaninchen (PARTE et al. 2011), Schaf (PARTE et al. 2011) und Affen (PARTE et al. 2011, FEREYDOUNI et al. 2014) gab es nachfolgende Untersuchungen zum Vorkommen von ovariellen Stammzellen. Beim Rind gibt es dazu bisher noch keine detaillierten Informationen zum Vorkommen von ovariellen Stammzellen, obwohl das Rind eine ökonomisch wichtige Spezies und ein bedeutendes Modell für die Reproduktionsforschung beim Menschen ist.
In diesem Projekt sollen porzine und bovine ovarielle Stammzellen (OSCs) aus Schlachthofovarien isoliert, in vitro kultiviert und charakterisiert werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit sollen dazu dienen, neue Erkenntnisse über das Vorhandensein ovarieller Stammzellen bei Schwein und Rind zu gewinnen und diese gegebenenfalls näher an die tierzüchterische Praxis zu bringen. Diese Stammzellen könnten bereits bei sehr jungen Tieren entnommen und in vitro zu Eizellen differenziert werden. Damit wäre eine sehr frühe genomische Selektion möglich. Die ovariellen Stammzellen könnten auch in der Grundlagenforschung Anwendung finden und ein Modell für die Entwicklung und Reifung der weiblichen Gameten darstellen. Ferner
könnten sie eine Rolle bei der Fertilitätserhaltung spielen, indem diese Zellen vor Behandlungen isoliert und gelagert werden könnten.
1.1 Aufbau und Funktion des Ovars
Die Eierstöcke (Ovarien) erfüllen beim Säugetier eine Doppelfunktion. Im Dienste der Fortpflanzung produzieren sie Sexualhormone und bilden befruchtungsfähige Keimzellen, die Eizellen (Oogenese). Diese Vorgänge unterliegen zyklischen Veränderungen, die über Rückkopplungsmechanismen durch Hormone des Hypothalamus bzw. der Adenohypophyse gesteuert werden. Zusammen mit der Gebärmutter und dem Gebärmutterhals sind die Ovarien in eine Gekröseplatte, die Plica urogenitalis oder Ligamentum latum uteri, eingeschlossen und werden von dieser getragen (NICKEL, SCHUMMER und SEIFERLE 2004). Im Gekröse des Ovars, dem Mesovarium, verlaufen die Gefäße Arteria ovarica und Vena ovarica.
Der Aufbau der Ovarien ist bei den Haussäugetieren sehr ähnlich (Abb. 1).
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Eierstocks mit verschiedenen zyklischen Funktionsgebilden (modifiziert nach SILVESTRIS et al. 2015)
Primäre Oozyte
Sekundär-
follikel Tertiärfollikel
Sekundäre Oozyte Primärfollikel
Ovulation
Ovarrinde Corpus
luteum
Corpus hemorrhagicum Peritoneum
Keimepithel
Die Ovarien haben eine elliptische, etwa mandelförmige Form. Beim Schwein sind sie grobhöckerig, ca. 50mm lang und wiegen bei einem Mutterschwein etwa 8-14g. Beim Rind hingegen sind die Ovarien im Vergleich zur Größe des Tieres mit etwa 30mm relativ klein und wiegen 15-19g (NICKEL, SCHUMMER und SEIFERLE 2004).
Von außen ist das Ovar mit einer einschichtigen Lage kuboider Zellen umgeben, dem Keimdrüsenepithel oder Epithelium superficiale (VAN BLERKOM und MOTTA 1979).
Darunter befindet sich eine derbe Bindegewebskapsel, die sogenannte Tunica albuginea. Sie ist eine dicke, fibröse Subepithelschicht aus lockeren Bindegewebszellen. Sie bildet sich nicht vor Ende der intrauterinen Phase oder einigen Monaten nach der Geburt aus (SIMKINS 1932). Das Gewebe des Ovars lässt sich in die äußere Rindensubstanz (Zona parenchymatosa oder Cortex ovarii) und das innen liegende gefäßreiche Mark (Zona vasculosa oder Medulla ovarii) gliedern. In der Rindensubstanz, die aus Stromafibrozyten besteht, befinden sich die in Follikeln liegenden Eizellen (JUNQUEIRA, CARNEIRO und KELLEY 2002, NICKEL, SCHUMMER und SEIFERLE 2004). Das Stromabindegewebe ist von feinen Kapillaren durchzogen, die für die Versorgung der Keimzellen sorgen. Die zentrale Marksubstanz ist sehr gefäß- und nervenreich. Die Arterien treten im Hilus ovarii ein und bilden am Übergang zur Rindensubstanz ein Kapillarnetz. Zyklusbedingt werden diese Kapillarnetzwerke ständig umgebaut und durch Sperrarterien und arteriovenöse Anastomosen zusätzlich gesteuert. Die glatte Muskulatur der Gefäßwände und die Follikel werden hauptsächlich von Fasern des vegetativen Nervensystems versorgt (LIEBICH 2004).
1.2 Oogenese und Follikulogenese
Als Oogenese bezeichnet man die Entwicklung einer befruchtungsfähigen Eizelle aus Primordialkeimzellen (Abb. 2). Diese Vorläuferzellen (primitive Oogonien) wandern noch während der Embryonalentwicklung aus dem Entoderm des Dottersackes in das Ovar ein und sind homolog zu den Vorläufern der Spermatogonien im Hoden (JUNQUEIRA, CARNEIRO und KELLEY 2002). Die Oogenese unterscheidet sich jedoch von der Spermatogenese in vielen Punkten. Während das bei der Spermatogenese entstandene Spermium im Wesentlichen ein motiler Nukleus ist, enthält die durch die Oogenese gebildete Eizelle die notwendigen Materialien, die für die Initialisierung und Aufrechterhaltung von Metabolismus und Embryonalentwicklung notwendig sind (GILBERT 2000).
Abbildung 2: Schematische Darstellung der Oogenese (modifiziert nach WANG und Mitotische Teilungen Meiose I Meiose II
Erstes Polkörperchen Zweites Polkörperchen
Sekundäre Oozyte
Ovum
Primordial- keimzelle
Oogonium
Primäre Oozyte
Oogenese
Aus den mitotischen Teilungen der Primordialkeimzellen gehen Oogonien hervor.
Dann beginnt die Vermehrungsphase. Im Laufe weniger Wochen führen diese Zellen viele mitotische Teilungen durch und bilden sogenannte Eiballen. Die aus einer Zelle stammenden Oogonien liegen in Gruppen zusammen; d.h. sie bilden Zellklone aus genetisch identischen Zellen (SCHNORR und KRESSIN 2011). Die Oogonienbildung beim Rind beginnt am 75. Tag der Embryonalentwicklung und endet am 160. Tag (ERICKSON 1966). Beim Schwein wurden die ersten Oogonien am Tag 18 post coitum beobachtet (BLACK und ERICKSON 1968). Die meisten Oogonien gehen zu Grunde, nur die übrig gebliebenen nehmen an Größe zu und beginnen mit der ersten Reifeteilung (Meiose I) (PINKERTON et al. 1961). Die Zellen arretieren jedoch in der Prophase und werden zu primären Oozyten. Beim Rind ist dieser Zeitpunkt zwischen dem 75. Tag und 80. Tag nach der Befruchtung erreicht (ERICKSON 1966), beim Schwein am 50. Tag (BLACK und ERICKSON 1968). In diesem Entwicklungsstadium werden die 30-50µm großen Oozyten von einem einschichtigen Epithel umgeben und bilden zusammen mit den somatischen Zellen den sogenannten Primordialfollikel. Ab diesem Zeitpunkt beginnt die Follikulogenese (GOSDEN und LEE 2010). Das Verharren in der ersten Reifeteilung wird von einem von den Follikelepithelzellen sezernierten Faktor bestimmt.
Das geschlechtsreife Schwein hat etwa 120.000, das Rind etwa 100.000 ausgebildete Primordialfollikel (SCHNORR und KRESSIN 2011). In diesem Stadium verharren die Oozyten bis zur Geschlechtsreife, ihre Anzahl wird jedoch durch Atresie reduziert (FADDY und GOSDEN 1995). Mit Beginn der Pubertät wird die Follikulogenese fortgeführt. Bei einem Teil der Primordialfollikel tritt die zweite Reifungsperiode ein. Die Eizelle erreicht ihre endgültige Größe und wächst von Primär- und Sekundärfollikel zum Tertiärfollikel heran (Abb. 3). Erst wenn die Oozyten eine bestimmte Größe erreicht haben, können sie die Meiose wiederaufnehmen und beenden (FAIR et al.
1995). Die Reifungsperiode der Eizellen geht mit dem Wachstum der Follikelzellen einher. Das Follikelepithel der Primärfollikel wird kubisch und um die Eizelle wird eine Glykoproteinschicht, die Zona pellucida, gebildet (VAN DEN HURK et al. 1997).
Sekundärfollikel sind durch eine zweite Granulosazellschicht (FAIR et al. 1997), dem Beginn der Bildung einer Thekazellschicht (BRAW-TAL und YOSSEFI 1997) und
mRNA-Synthese in der Eizelle (MCLAUGHLIN et al. 2010) charakterisiert. Beim Tertiärfollikel sind die Granulosazellen in mehreren Schichten organisiert und geben das Liquor follicularis ab, welches eine einheitliche Höhle bildet und als Antrum folliculare bezeichnet wird (FAIR et al. 1997). Der Übergang vom Sekundär- zum Tertiärfollikel be- inhaltet die Entwicklung der inneren und äußeren Thekazellschichten und die beginnende Bildung von Kumuluszellen (FAIR et al. 1997). Die Kumuluszellen dienen dem Signal- und Nährstofftransport der Eizellen, welcher durch die Ausbildung von Gap Junctions zwischen Kumuluszellen und Eizelle erfolgt (HYTTEL et al.
1997).
Abbildung 3: Schematische Darstellung der Follikelreifung (modifiziert nach GOSDEN und LEE 2010)
Primordial- follikel Primär- follikel
postnatal und postpuberal Granulosa-Zellschicht
primäre Oozyte
Zona pellucida
wachsende Granulosa-Zellen Nukleus der Oozyte
Theka-Zellschicht Follikelflüssigkeit im Antrum Granulosa-Zellschichten Oozyte
Ovulierte Oozyte
Zygote
Erstes Polkörperchen Zona pellucida Kumulus-Zellen Befruchtung
Erstes und zweites Polkörperchen Männlicher und weiblicher Vorkern Gonadotropinantieg in der Mitte des Menstrual- zyklus stimuliert den Wiedereinztritt der Oozyte in die Meiose bis zur Metaphase II
Sekundär- follikel Tertiär- follikel
Spindel
1.3 Keimbahnspezifische Stammzellen im Ovar
In der männlichen Keimbahn sind Keimbahnstammzellen für die lebenslange männliche Gametogenese verantwortlich (CLERMONT und LEBLOND 1953, DE ROOIJ und KRAMER 1968). Im Gegensatz dazu gibt es nur bei einigen weiblichen Invertebraten (z.B. Drosophila) und niederen Vertebraten (z.B. Teleostei) ebenfalls Keimbahnstammzellen, die die Oozytenreserve aufstocken können (XIE und SPRADLING 2000, NAKAMURA et al. 2010). Mehr als 50 Jahre galt es jedoch beim Säugetier als unumstritten, dass zu den bereits bei der Geburt vorhandenen Eizellen im Laufe des weiteren Lebens keine weiteren mehr hinzukommen. An der postnatalen Entstehung von Eizellen wurde daher kaum geforscht.
1.3.1 Definition von ovariellen Stammzellen
Neueste Studien haben gezeigt, dass homolog zu den spermatogonialen Stammzellen beim männlichen Geschlecht, oogoniale Stammzellen in Ovarien von weiblichen Mäusen und Menschen existieren sollen (JOHNSON et al. 2004, WHITE et al. 2012).
Diese Stammzellen sind mitotisch aktiv, können postnatal zu Eizellen differenzieren und somit den Follikelpool wiederaufstocken (WHITE et al. 2012). Außerdem zeigen diese Zellen ein Genexpressionsprofil, das mit dem von primitiven Keimzellen übereinstimmt (WHITE et al. 2012).
In der aktuellen Fachliteratur werden diese Zellen unter verschiedenen Namen aufgeführt. Unter anderem werden diese Zellen als Keimbahnstammzellen (germline stem cells) (BUKOVSKY et al. 2004, BUKOVSKY 2011, BYSKOV et al. 2005, GOSDEN 2004), ovarielle Stammzellen (ovarian stem cells) (DUNLOP et al. 2013, ESMAEILIAN et al. 2015, VIRANT-KLUN et al. 2008), putative Stammzellen (putative stem cells) vom Ovar (BUI et al. 2014), prämeiotische Keimzellen (premeiotic germ cells) (NIIKURA et al. 2009), ovarielle Keimstammzellen (ovarian germ stem cells) (PATEL et al. 2013) oder oogoniale Stammzellen (oogonial stem cells) (ANDERSON
2013, IMUDIDA et al. 2013, WHITE et al. 2012) bezeichnet. In dieser Arbeit werden diese Zellen als ovarielle Stammzellen bezeichnet (ovarian stem cells, OSCs).
1.3.2 Geschichtlicher Hintergrund – Ursprung der Debatte
Männliche Keimzellen werden nach der Pubertät kontinuierlich während der gesamten Lebensphase produziert (BRINSTER 2007), über die weibliche Oogenese ist hingegen weniger bekannt. Die Frage, ob weibliche Keimzellen auch nach der Geburt produziert werden können, beschäftigt die Wissenschaft bereits seit vielen Jahren.
Studien zu dieser Thematik sind nicht sehr zahlreich und basieren auf Untersuchungen unterschiedlicher Spezies. 1870 postulierte Waldeyer, dass die Eizellproduktion weiblicher Säugetiere kurz nach der Geburt endet. Sein Postulat basierte auf Studien von Ovarien verschiedener Säugetiere; unter anderem von Mensch, Hund und Katze (WALDEYER 1870). Diese Ansicht wurde 1921 von Pearl und Schoppe unterstützt.
Sie zählten über mehrere Jahre sichtbare Eizellen in Ovarien von reproduktionsfähigem Geflügel und schlossen daraus, dass der Vorrat an primären Oozyten während der adulten Lebensphase nicht ansteigt (PEARL und SCHOPPE 1921). 1923 überprüfte Allen die Eizellregeneration in adulten Ratten und untersuchte die Möglichkeit der Eizellproduktion in adulten Mäusen (ALLEN 1923). Diese Untersuchungen basierten auf Daten von 1920, in denen Ratten vor der Geschlechtsreife ein Ovar entfernt worden war (ARAI 1920). Ratten mit nur einem Ovar zeigten dieselbe Anzahl an reifen Eizellen wie die unbehandelte Kontrollgruppe.
Daraus schlossen Allen und Arai, dass es einen Kompensationsmechanismus geben müsse, sonst hätten die Ratten mit nur einem Ovar nur die Hälfte an reifen Eizellen im Vergleich zu den gesunden Tieren produziert. Außerdem untersuchte Allen histologisch definierte mitotische Zellen im ovariellen Oberflächenepithel von Mäusen, denen entweder vor oder nach der Geschlechtsreife ein Ovar entfernt wurde und verglich diese mit der unbehandelten Kontrollgruppe. Die Anzahl mitotisch aktiver Keimzellen in Mäusen mit nur einem Ovar korrelierte mit den verschiedenen Phasen
1923). Allen schloss daraus, dass diese mitotisch aktiven Zellen Marker für eine postnatale Oogenese waren. Unterstützung fand diese These 1942 in der Studie von Bullough, der die mitotische Aktivität im Oberflächenepithel von adulten Mäusen während des Östruszyklus untersuchte (BULLOUGH 1942).
Das 1951 erschienene Postulat von Zuckerman sollte für die nächsten 50 Jahre zum Dogma der weiblichen Reproduktion werden. Zuckermans Theorie besagte, dass eine feste Anzahl an Eizellen bereits vor der Geburt angelegt wird und demnach postnatal keine Neooogenese mehr stattfindet (ZUCKERMAN 1951). Zuckermans Postulat basierte auf Experimenten mit Bestrahlung von Ovarien von Affen und Ratten und der daraus resultierenden Degeneration des Oberflächenepithels. 1962 wurde Zuckermans These von Peters Untersuchungen unterstützt, in der die DNA-Synthese in murinen Eizellen mit Hilfe einer radioaktiven DNA-Vorstufe analysiert wurde (PETERS et al. 1962). Tritium-markiertes Thymidin wurde an verschiedenen Tagen der Trächtigkeit injiziert und die Ergebnisse zeigten, dass DNA-Synthese in Keimzellen am Tag 18 der Embryonalentwicklung zum Erliegen kam (PETERS et al. 1962).
1967 gab es neue Studien mit Halbaffen, die die Theorie einer postnatalen Oogenese unterstützten. Ovarien von Perodictus, Galagos und Loris wurden auf mitotisch oder meiotisch aktive Oogonien untersucht. Mitotisch aktive Oogonien und meiotisch aktive Eizellen konnten histologisch und autoradiographisch nachgewiesen werden (IOANNOU 1967). Eine weitere Gruppe, die ebenfalls die Identifizierung von mitotisch aktiven Keimzellen in Ovarien von Loris autoradiographisch untersuchte, unterstützte auch die These, dass Oogenese postnatal stattfindet (DAVID et al. 1974).
Tabelle 1 zeigt zusammenfassend die wichtigsten ersten Erkenntnisse, die für bzw.
gegen postnatale Oogenese sprechen.
Pro postnatale Oogenese
Autoren Feststellung
Arai 1920 Untersuchungen an Ratten mit nur einem Ovar, die dieselbe Anzahl an reifen Eizellen zeigten wie gesunde Tiere. Dies setzt einen Kompensationsmechanismus voraus.
Allen 1923 Untersuchung mitotisch aktiver Zellen in Mäusen mit nur einem Ovar. Anzahl mitotisch aktiver Keimzellen korrelierte mit Östruszyklus. Diese Zellen sollten Marker für postnatale Oogenese sein.
Bullough 1942 Untersuchung der mitotischen Aktivität von Zellen im Oberflächenepithel von adulten Mäusen. Korrelation mit Östruszyklus ließ auf postnatale Oogenese schließen.
Ioannou 1967 Histologische und autoradiographische Untersuchungen an Ovarien von Halbaffen ließen auf mitotisch aktive Oogonien und meiotisch aktive Eizellen schließen.
David et al.
1974
Autoradiographischer Nachweis mitotisch aktiver Zellen in Ovarien der Primatenspezies Loris.
Kontra postnatale Oogenese
Autor Feststellung
Waldeyer 1870 Studien an mehreren Spezies, die darauf schließen ließen, dass die Oogenese nach der Geburt endet.
Pearl und Schoppe 1921
Zählung sichtbarer Eizellen in Ovarien von Geflügel.
Schlussfolgerung daraus, dass der Vorrat an primären Oozyten während der adulten Lebensphase nicht ansteigt.
Zuckerman 1951
Bewertung vorangegangener Hinweise bei Ratten und Mäusen und Schlussfolgerung, dass postnatale Oogenese nicht stattfindet.
Peters et al.
1962
Studien über DNA-Synthese in Maus-Oozyten. Folgerung, dass diese ab Tag18 der Embryonalentwicklung zum Erliegen kommt.
1.3.3 Aktueller Stand der Forschung
1.3.3.1 Ovarielle Stammzellen bei Maus und Mensch
Die bisher gewonnenen Erkenntnisse über Keimbahnstammzellen wurden hauptsächlich in der Labormaus gemacht (IMUDIDA et al. 2013, JOHNSON et al.
2004, PACHIAROTTI et al. 2010, WHITE et al. 2012, ZOU et al. 2009, ZOU et al.
2011). Bei Untersuchungen zur Follikeldegeneration wurde die Anzahl der gesunden und degenerierenden Follikel in Mausovarien untersucht. Bei der gefundenen Degenerationsrate von bis zu 1200 Follikeln pro Ovar, würde die Fruchtbarkeit schon nach kurzer Zeit erloschen sein (JOHNSON et al. 2004). Da dies aber nicht der Fall war, postulierten die Wissenschaftler, dass es im Ovar Keimzellen geben müsse, die auch nach der Geburt neue Eizellen produzieren und den Follikelpool kontinuierlich wiederauffüllen (JOHNSON et al. 2004). In derselben Studie wurden Ovarfragmente adulter Wildtyp-Mäuse in die Bursa ovarica transgener Mäuse mit einer ubiquitären GFP (green fluorescent protein) - Expression transplantiert. In den Wildtyp- Ovarfragmenten konnten nach einigen Wochen grün fluoreszierende Eizellen nachgewiesen werden, die von den Wildtyp-Eizellen nicht zu unterscheiden waren (JOHNSON et al. 2004). In einer anschließenden Veröffentlichung zeigte dieselbe Arbeitsgruppe die Expression von Keimzellmarkern in vom Knochenmark abgeleiteten Stammzellen (JOHNSON et al. 2005). Die Wissenschaftler folgerten daraus, dass Knochenmark und peripheres Blut eine potentielle Quelle für weibliche Keimzellen sein könnten, da Knochenmark- und Bluttransplantationen zur Wiederherstellung der Eizellproduktion in durch Chemotherapie sterilisierten Mäusen führten (JOHNSON et al. 2005). Diese Annahme wurde von Parabiose-Experimenten widerlegt, bei denen die Gefäße von Wildtyp-Mäusen mit Gefäßen von transgenen Mäusen, die GFP unter der Kontrolle des β-Actin-Promotors exprimierten, chirurgisch verbunden wurden (EGGAN et al. 2006). Obwohl ein hoher Blutzell-Chimerismus beobachtet werden konnte, wurden keine GFP-positiven Eizellen in Wildtyp-Mäusen ovuliert (EGGAN et al. 2006).
Die Studie von JOHNSON et al. 2004 ist umstritten (TILLY et al. 2009); es konnten aber OSCs aus neonatalen und adulten Mausovarien isoliert werden (ZOU et al. 2009,
PACHIAROTTI et al. 2010). Diese Zellen exprimierten Vasa, Oct4 und Nanog, konnten über 12 Monate in vitro kultiviert werden und differenzierten spontan zu Zellen, die wie ungereifte Oozyten aussahen (PACHIAROTTI et al. 2010). Transplantationsstudien mit GFP-exprimierenden OSCs in Ovarien von Chemotherapie behandelten Mäusen zeigten eine Differenzierung dieser Zellen in reife Eizellen, die befruchtungsfähig waren und lebensfähige Nachkommen produzierten (ZOU et al. 2009).
Das ovarielle Oberflächenepithel wurde als Quelle von Keimbahnstammzellen vermutet, da hier doppelpositive Zellen für Vasa (Keimzellmarker) und 5- Bromodeoxyuridin (Proliferationsmarker), immunhistochemisch nachgewiesen wurden (JOHNSON et al. 2004, ZOU et al. 2009). PACHIAROTTI et al. (2010) verwendeten ein transgenes Mausmodell, dass GFP unter der Kontrolle des Oct4- Promotors exprimierte. GFP-positive Zellen konnten auf dem ovariellen Oberflächenepithel von postnatalen Mäusen lokalisiert werden (PACHIAROTTI et al.
2010). Darauffolgend wurde eine Studie veröffentlicht, in der Keimbahnstammzellen von neonatalen und adulten Mäusen mit ubiquitärer GFP-Expression in Chemotherapie behandelte Empfängermäuse übertragen wurden. Die Empfängertiere produzierten transgene F1- und F2-Nachkommen (ZHANG et al. 2011).
Die Studie von ZOU et al. (2009) wurde kritisiert; die Isolierung und die Reinheit der Zellen wurde angezweifelt (ABBAN und JOHNSON 2009). 2012 beschrieben WHITE et al. ein verbessertes Protokoll zur Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung (FACS) zur Isolierung und Anreicherung muriner Keimbahnstammzellen (WHITE et al. 2012) und bestätigten, dass die gewonnenen Zellen befruchtungsfähige Eizellen generieren und sich nach Befruchtung zu Blastozysten entwickeln können. Die angereicherten Zellen (1,5% der vitalen sortierten Zellen) exprimierten Keimzellmarker wie Vasa, Fragilis, Prdm1 und Dazl und konnten über 18 Monate in vitro kultiviert werden (WHITE et al.
2012). Damit gelang es auch humane ovarielle Stammzellen aus Ovarien von 22-33 Jahre alten Frauen zu isolieren und zu charakterisieren (WHITE et al. 2012). Auch die humanen Stammzellen exprimierten unter anderem VASA, FRAGILIS, PRDM1 und DAZL und konnten über 18 Monate in vitro kultiviert werden (WHITE et al. 2012). GFP- exprimierende humane OSCs, die in humane Ovarbiopsien injiziert wurden, führten
GFP-exprimierenden Eizellen (WHITE et al. 2012). Eine Vergleichsuntersuchung der Genexpressionsprofile von ovariellen Stammzellen, embryonalen Stammzellen, Primordialkeimzellen und spermatogonialen Stammzellen der Maus, bestätigte das Vorhandensein einer Zellpopulation im Ovar von Mäusen (IMUDIDA et al. 2013). Die in vitro kultivierten OSCs behielten die Expression von Keimzellmarkern (Vasa, Fragilis, Dazl, Stella) bei, entwickelten während der In-vitro-Kultur zusätzlich die Expression von Pluripotenzmarkern wie Oct4, Zfp9, Utf1, Nanog und Sox2 (IMUDIDA et al. 2013).
Abbildung 4 zeigt eine zusammenfassende Darstellung der bisherigen Versuche und Erkenntnisse über murine und humane ovarielle Stammzellen. Bei den humanen OSCs sind die Ergebnisse nicht ganz so eindeutig wie bei den murinen, da aus ethischen und rechtlichen Gründen keine In-vitro-Befruchtung unternommen werden konnte. Diese Erkenntnisse eröffnen die Möglichkeit, OSCs für Transplantationen und Therapien einzusetzen, um die ovarielle Funktion und Fertilität zu beeinflussen (TILLY et al. 2009, TILLY und TELFER 2009).
Abbildung 4: Übersicht über die bereits erfolgten Versuche zur Charakterisierung und Expansion von murinen und humanen OSCs (nach WOODS und TILLY 2013)
Die Behauptung, es gäbe eine postnatale Oogenese, polarisierte die wissenschaftliche Gemeinschaft. Viele Studien unterstützten die Präsenz der neu entdeckten Stammzellen (BUKOVSKY et al. 2005, IMUDIDA et al. 2013, NIIKURA 2009, PACHIAROTTI et al. 2010, PARTE et al. 2011, VIRANT-KLUN et al. 2008, WHITE et al. 2012, ZHANG et al. 2011, ZHOU et al. 2014, ZOU et al. 2009), während andere Studien besagten, dass die Befunde zu diesen Stammzellen missinterpretiert worden waren (BEGUM et al. 2008, BRISTOL-GOULD et al. 2006, BYSKOV et al. 2011, KERR et al. 2012, LEI und SPRADLING 2013, LIU et al. 2007, YUAN et al. 2013, ZARATE- GARCIA et al. 2016, ZHANG et al. 2012).
Die Hypothese der Neooogenese wurde von BEGUM et al. (2008) durch
Transduktion mit GFP-Vektor
• Injektion in Ovarien von Wildtyp-Mäusen in vivo
• Bildung GFP-positiver Oozyten
• Reifung GFP-positiver Oozyten (Follikelbildung und Entwicklung)
• Superovulation und In-vitro-Fertilisation von GFP-positiven Oozyten
• Paarungsversuche mit Wildtyp- Männchen um GFP-positive Nachkommen zu verfolgen
• Injektion in adulte humane Ovarrinde
• Transplantation der injizierten Fragmente unter die Haut von immundefizienten Mäusen
• Bildung GFP-positiver humaner Oozyten
• Reifung GFP-positiver humaner Oozyten
(Follikelbildung und Entwicklung)
• Genexpression mittels RT-PCR
• Proteinexpression zur Überprüfung der Uniformität nach Expansion
• PCR-Analyse von Meiose- und Oozytenmarkern (Expression beider in Oozyten, in OSCs nur Meiosemarker)
• Immunfluoreszenzanalyse von Meiose- und Oozytenmarkern
In-vitro-Kultur muriner und humaner OSCs
murine OSCs humane OSCs
intraovarielle Transplantation GFP- exprimierender OSCs
Charakterisierung der OSC-Linien und der in vitro abgeleiteten Oozyten
Transplantation durch Röntgenstrahlung sterilisiert. Acht Wochen nach Transplantation konnten keine GFP-positiven Eizellen in den Transplantaten beobachtet werden (BEGUM et al. 2008). Eine andere Studie zeigte, dass mit Hilfe von Vasa und FACS (Fluorescence activated cell sorting) aus Mausovarien isolierte Zellen kein Vasa exprimierten, auch keine Keimzelleigenschaften besaßen und die Expression von prämeiotischen Markern durch die In-vitro-Kultur induziert worden war (ZARATE-GARCIA et al. 2016).
Zusätzlich gibt es noch andere Berichte über Keimbahnstammzellen, die sich jedoch von den oben genannten unterscheiden. Es existieren Veröffentlichungen über 2-4µm kleine runde Zellen, die aus dem ovariellen Oberflächenepithel von postmenopausalen und Frauen mit vorzeitiger Ovarialinsuffizienz isoliert wurden. Diese Zellen differenzierten in Gegenwart von Follikelflüssigkeit und Östrogenstimuli in oozytenähnliche Zellen (VIRANT-KLUN et al. 2008, VIRANT-KLUN et al. 2009, VIRANT-KLUN et al. 2011, VIRANT-KLUN et al. 2013a, VIRANT-KLUN et al. 2013b) und exprimierten Pluripotenzmarker (OCT4, SOX2, NANOG, NANOS) und Keimzellmarker (c-KIT, VASA, STELLA, SCP1-3). Die Autoren verglichen diese kleinen Zellen aus dem Oberflächenepithel mit den very small embryonic like (VSEL)- Stammzellen (VIRANT-KLUN et al. 2011). Die Präsenz der VSEL-Zellen wurde im Oberflächenepithel von Mensch, Maus, Schaf, Kaninchen, Affen und Seidenaffen berichtet (BHARTIYA et al. 2012, PARTE et al. 2011, PARTE et al. 2013, PATEL et al. 2013). Diese Zellen exprimierten c-KIT, OCT4, SOX2, NANOG und SSEA4. Es wurde vermutet, dass Keimbahnstammzellen Abkömmlinge von VSEL-Zellen sind und in Kultur zu oozytenähnlichen Zellen differenzieren. Im Gegensatz zu anderen Theorien, postulierte die Gruppe um BUKOVSKY et al. (2007), dass putative Keimbahnstammzellen durch Differenzierung der Zellen des Oberflächenepithels in Nagern (BUKOVSKY et al. 2007), Affen (BUKOVSKY et al. 2008) und Menschen (BUKOVSKY et al. 2004, BUKOVSKY et al. 2008, BUKOVSKY et al. 2005) entstehen.
Die Mechanismen, durch welche die Epithelzellen differenzieren, beinhalten eine Reihe von Zellverlagerungen innerhalb des Ovars und Veränderungen der Zellphänotypen. In diesen Studien wurden jedoch weder Ovarschnitte, noch die isolierten Zellen auf die Expression von Keimzellmarkern untersucht.
1.3.3.2 Ovarielle Stammzellen bei Nutztieren
Bei Nutztieren gibt es im Vergleich zu Maus und Mensch noch relativ wenige Erkenntnisse im Bereich der ovariellen Stammzellen.
PARTE et al. (2011) detektierten und charakterisierten in ihrer Studie Stammzellen im ovariellen Oberflächenepithel, unter anderem bei Schafen (PARTE et al. 2011). Zwei unterschiedliche Populationen putativer Stammzellen unterschiedlicher Größe wurden in Ausschabungen des Oberflächenepithels detektiert. Die kleineren, 1-3µm großen putativen Stammzellen (very small embryonic-like putative stem cells), exprimierten OCT4 im Zellkern und SSEA-4 auf der Oberfläche, während die größeren, 4-7µm großen Zellen OCT4 zytoplasmatisch und SSEA-4 nur minimal exprimierten. Mit RT- PCR wurden Gentranskripte von OCT4, OCT4A, NANOG, SOX2, TERT und STAT3 nachgewiesen. Diese putativen Stammzellen differenzierten spontan unter anderem in oozytenähnliche Strukturen. In den Zellen konnten Keimzellmarker wie c-KIT, DAZL, GDF9, VASA und ZP4 immunhistochemisch nachgewiesen werden (PARTE et al.
2011). Beide Zelltypen exprimierten FSH-Rezeptoren. FSH-Zugabe in vitro stimulierte die VSELs zur asymmetrischen Zellteilung und Bildung von OSCs. Diese Zellen zeigten ihrerseits eine schnelle Proliferation durch symmetrische Zellteilungen und formten Keimzellnester in vitro (PATEL et al. 2018).
Etwas mehr Informationen stehen über das Vorkommen von ovariellen Stammzellen im Schwein zur Verfügung. SONG et al. (2011) untersuchten unter anderem Stammzellen mit multipotenten Eigenschaften aus dem Ovar und ihre Differenzierung in oozytenähnliche Zellen in vitro (SONG et al. 2011). OSCs wurden aus dem Ovar eines neugeborenen Ferkels isoliert. Diese Zellen zeigten eine fibroblastenähnliche Morphologie, das Potential zur Selbsterneuerung und formten Kolonien. Sie zeigten AP (alkalische Phosphatase)-Aktivität und exprimierten OCT3/4, NANOG und SOX2.
Außerdem konnten diese Zellen in vitro in oozytenähnliche Zellen differenziert werden, welche die Marker OCT4, GDF9B, c-MOS, VASA, DAZL, ZPC und FSHR exprimierten (SONG et al. 2011). Eine weitere Studie beschäftigte sich mit den zellulären Eigenschaften und dem Differenzierungspotential von porzinen multipotenten
hatten eine fibroblastenähnliche Form und zeigten AP-Aktivität. Zellzyklusanalysen deuteten auf ein hohes Proliferationspotential hin. Durchflusszytometrische Analysen zeigten die Expression von mesenchymalen Oberflächenmarkern (CD29, CD44 und CD90) und die Expression von SOX2 wurde sowohl auf Protein- als auch auf mRNA- Ebene detektiert. Durch Induktion im Oogenese-Medium veränderten die Zellen ihre Morphologie zu oozytenähnlichen Zellen und exprimierten Trankriptionsfaktoren (OCT4, NANOG, SOX2), oozytenspezifische Marker (GDF9B, c-MOS, DAZL, VASA, ZPC, SCP3, STELLA) und den Follikulogenesemarker FSHR (LEE et al. 2013).
Untersuchungen von BAI et al. (2013) an juvenilen Schweineovarien haben Hinweise ergeben, dass es auch hier weibliche Keimbahnstammzellen gibt, die in der Theka- Region lokalisiert sind. Diese Zellen zeigten ähnliche Eigenschaften wie murine ovarielle Stammzellen in über 4 Monaten In-Vitro-Kultur (BAI et al. 2013). Sie exprimierten Pluripotenz- und Keimzellmarker (OCT4, SSEA4, c-KIT, c-MYC, KLF4, SOX2, NANOS2, CD49f, VASA und SSEA3) (BAI et al. 2013) und zeigten Differenzierungspotential in vitro und in vivo. Sie formten Embryonic bodies, die nach 7-15 Tagen spontan in verschiedene Zelltypen aller drei Keimblätter differenzierten.
Außerdem wurden leere, intakte Follikel zum Einbetten der zu untersuchenden Zellen verwendet. Diese wurden unterhalb der linken Nierenkapsel von busulphanbehandelten weiblichen Mäusen transplantiert. Nach zwei Monaten bildeten vier Transplantate Teratomas in den Empfängernieren, die Strukturen aller Keimblätter enthielten und Keimzellmarker (CD133, VASA, DAZL) exprimierten (BAI et al. 2013).
2014 wurden putative Stammzellen aus Ovarien adulter Schweine isoliert (BUI et al.
2014). Diese stellten eine heterogene Population dar, basierend auf Zellgröße und Expression von c-KIT und exprimierten Stamm- und Keimzellmarker wie OCT4, VASA, FRAGILIS und STELLA. Die isolierten Zellen machten eine Translokation von OCT4 vom Zytoplasma zum Kern durch, der an Primordialkeimzellen erinnert. Die In-Vitro- Etablierung dieser Zellen erforderte ovarielle extrazelluläre Regulatoren, welche wahrscheinlich auch Interaktionen der Stammzellnische in vivo steuern. Die Zellen konnten sechs Monate und über 30 Passagen in vitro kultiviert und zu oozytenähnlichen Zellen differenziert werden (BUI et al. 2014). WARTALSKI et al.
(2016) berichteten über die Isolierung von ovariellen Stammzellen aus präpuberalen
Schweinen mittels MACS (Magnetic-activated cell sorting) und SSEA-4 als Selektionsmarker. Die Zellen bildeten spontan Embryonic bodies und exprimierten OCT3/4, SOX2, cKIT und GDF9. Insgesamt wurden diese Zellen sieben Tage in vitro kultiviert.
Zum Vorkommen von ovariellen Stammzellen beim Rind gibt es bisher nur eine Veröffentlichung. In dieser Studie wurden ovarielle Stammzellen aus Rinderovarien isoliert und die Effekte von BMPs (bone morphogenetic proteins) und Follikelflüssigkeit auf ihre Differenzierung in oozytenähnliche Strukturen untersucht (DE SOUZA et al.
2017). Nach der Isolierung wurden die Zellen in α-MEM+ Medium kultiviert, dem BMP2, BMP4 oder Follikelflüssigkeit beigesetzt waren. Die frisch isolierten Zellen exprimierten die Pluripotenzmarker OCT4 und SOX2 und alkaline Phophatase. Nach 14 Tagen Differenzierung zeigten die Zellen eine veränderte Morphologie, ähnlich der der Primordialkeimzellen und oozytenähnlichen Zellen. Zellen, die mit BMPs und Follikelflüssigkeit kultiviert wurden, zeigten eine 5- bis 14-fache VASA-Expression und 4- bis 6-fache DAZL-Expression im Vergleich zur Kontrollgruppe. Zusätzlich zeigten die oozytenähnlichen Zellen einen Anstieg von GDF9-, ZPA- und SCP3-Expressionen auf mRNA-Ebene (DE SOUZA et al. 2017). In der Studie von DE SOUZA et al. (2017) wurde hauptsächlich die Differenzierung bzw. der Einfluss auf die Differenzierung der ovariellen Stammzellen untersucht. Die Isolierung oder die genaue Charakterisierung der ovariellen Stammzellen wurden in der Studie nicht betrachtet.
1.4 Isolierung und Charakterisierung von ovariellen Stammzellen
Für die Isolierung von ovariellen Stammzellen aus dem Zellverband des Ovargewebes wird am häufigsten die Herstellung einer Einzelzellsuspension mit Hilfe einer mechanischen und/oder enzymatischen Dissoziation verwendet. Die gewonnenen Zellen werden dann entweder sofort in In-vitro-Kultur gebracht oder mit Hilfe von spezifischen Antikörpern angereichert und erst danach weiter in vitro kultiviert.
1.4.1 Anreicherungsmethoden für ovarielle Stammzellen
Im Vergleich zu anderen Zelltypen ist der Anteil ovarieller Stammzellen im Ovar sehr gering. WHITE et al. (2012) schätzten die Inzidenz dieser Zellen bei der Maus auf ca.
0,014%±0,002% pro Ovar. Aus diesem Grund ist es von Vorteil, die ovariellen Zellen anzureichern.
Für diesen Zweck wurden bei den verschiedenen Spezies bisher verschiedene Methoden verwendet. Dazu gehören MACS (Magnetic-activated cell sorting) bei der Maus (WHITE et al. 2012, ZOU et al. 2009, ZOU et al. 2011) und beim Schwein (BUI et al. 2014, WARTALSKI et al. 2016), FACS (Fluorescence-activated cell sorting) bei der Maus und beim Menschen (IMUDIDA et al. 2013, WHITE et al. 2012), differentielles Plattieren beim Schwein (BUI et al. 2014) und In-vitro-Kultur von ovariellen Gewebestückchen beim Rind (DE SOUZA et al. 2017).
1.4.1.1 Oberflächenmarker für ovarielle Stammzellen
Um ovarielle Stammzellen isolieren zu können, ist ein geeigneter Oberflächenmarker hilfreich. Die größte Herausforderung dabei ist, einen Marker zu finden, der nur für die Stammzellen im Ovar spezifisch ist. Auch die speziesspezifischen Unterschiede müssen beachtet werden, denn Eigenschaften von einer Spezies können nicht automatisch auf eine andere übertragen werden.
In der aktuellen Literatur ist Vasa als Oberflächenmarker für ovarielle Stammzellen beschrieben. Vasa gehört zu der Familie der DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) -Box-Proteine und ist eine ATP-abhängige RNA-Helikase (HAY et al. 1990, LASKO und ASHBURNER 1988). Das für die Keimzellentwicklung essentielle Vasa-Gen wurde zuerst in Drosophila entdeckt (SCHUPBACH und WIESCHAUS 1986). Basierend auf der hohen strukturellen Konservierung des Vasa-Gens, wurden homologe Gene danach auch in anderen Invertebraten und Vertebraten identifiziert: C. elegans (ROUSSEL und BENNETT 1993), Xenopus (KOMIYA et al. 1994), Zebrafisch (OLSEN et al. 1997), Maus (FUJIWARA et al. 1994), Ratte (KOMIYA und TANIGAWA 1995) und Mensch (CASTRILLON et al. 2000). Vasa ist an zellulären Prozessen der RNA- Modifizierung beteiligt und wird in Keimzellen beider Geschlechter exprimiert (CASTRILLON et al. 2000). Die molekulare Funktion von Vasa besteht in der Bindung von Ziel-mRNAs wie Oskar und Nanos, die in die Keimzelletablierung involviert sind oder Gurken, das an der Oogenese beteiligt ist (DAHANUKAR und WHARTON 1996, GAVIS et al. 1996, STYHLER et al. 1998, TOMANCAK et al. 1998).
Das murine Vasa zeigt eine 90%ige Homologie zum humanen VASA (CASTRILLON et al. 2000) (Abb. 5) und wird in Keimzellen der embryonalen Gonaden exprimiert, nicht aber in embryonalen Stammzellen (FUJIWARA et al. 1994). Im adulten Gewebe wurden Vasa-Transkripte ausschließlich in testikulären Keimzellen, Spermatozyten und Spermatiden nachgewiesen (FUJIWARA et al. 1994). Bei der Untersuchung der Vasa-Expression während der Keimzellentwicklung, wurde das Vasa-Protein in Primordialkeimzellen und in Keimzellen bis zum post-meiotischen Stadium in beiden Geschlechtern detektiert (TOYOOKA et al. 2000).
Das VASA-Protein im Schwein ist zu 85% homolog mit dem Vasa-Protein der Maus und zu 91% mit dem des Menschen (LEE et al. 2005). Sowohl die VASA-mRNA als auch das VASA-Protein werden beim Schwein in Oozyten und Spermatozyten von fetalen und adulten Gonaden exprimiert. Außerdem wurde das VASA-Protein in proliferierenden und frisch isolierten Primordialkeimzellen, aber nicht in embryonalen Keimzellen detektiert (LEE et al. 2005).
Auch beim Rind wird VASA im Hoden- und Ovargewebe exprimiert, und ist auch in antralen Follikeln detektierbar (PENNETIER et al. 2004). VASA wurde in fetalen Gonaden beider Geschlechter nachgewiesen, nicht jedoch im somatischen Gewebe (BARTHOLOMEW und PARKS 2007). Das bovine VASA-Protein weist eine Homologie zum humanen VASA-Protein von 91,08% auf (LUO et al. 2013).
Vasa wurde weitgehend als ein im Zytoplasma exprimiertes Protein betrachtet (FUJIWARA et al. 1994, NOCE et al. 2001, TOYOOKA et al. 2000). Mit Hilfe bioinformatorischer Analysen konnten zwei vorher nicht bekannte Transmembran- domänen des Vasa-Proteins identifiziert werden (ZOU et al. 2009). WHITE et al.
(2012) konnten an murinen und humanen Zellen zeigen, dass das Protein eine extrazelluläre Domäne besitzt, die nur mit einem Antikörper detektiert werden kann, der gegen den C-Terminus des Proteins gerichtet ist. Nur mit diesem Antikörper konnte Vasa als Selektionsmarker für ovariellen Stammzellen verwendet werden (WHITE et al. 2012).
Abbildung 5: Homologie der Vasa-Proteine von Drosophila, Maus, Schwein und Rind im Vergleich zum Menschen
56% (CASTRILLON et al. 2000)
90% (CASTRILLON et al. 2000)
91% (LEE et al. 2005)
91,08% (LUO et al. 2013)
Ein weiterer Oberflächenmarker, der ebenfalls zur Isolierung von ovariellen Stammzellen verwendet wurde, ist Fragilis, auch als Ifitm3 (Interferone-induced transmembrane protein 3) bekannt.
In der Maus wird Fragilis in Primordialkeimzellen, ihren Vorläufern und in Keimzellen fetaler Gonaden exprimiert (SAITOU et al. 2002). Fragilis wird auf der Oberfläche von Vorläuferkeimzellen exprimiert (SAITOU et al. 2002, TANAKA et al. 2004) und wurde bereits als Selektionsmarker für ovarielle Stammzellen in der Maus verwendet (ZOU et al. 2011). Murine und humane ovarielle Stammzellen exprimierten ebenfalls Fragilis (WHITE et al. 2012). Auch angereicherte ovarielle Stammzellen vom Schwein zeigten eine FRAGILIS-Expression sowohl auf mRNA-, als auch auf Proteinebene (BUI et al.
2014). Laut weiteren Studien ist FRAGILIS aber auch in Prozesse der Zelladhäsion, Apoptose und Immunaktivität involviert (LI et al. 2017). Auch im Rind wurden zwei FRAGILIS-ähnliche Gene identifiziert (LANGE et al. 2003), die den humanen FRAGILIS-Genen ähneln und eine Antwort auf Interferonsignale darstellen sollen (HAYZER et al. 1992, PRU et al. 2001). Bei Transkriptomanalysen von bovinen Blastozysten zeigte sich, dass FRAGILIS in der inneren Zellmasse exprimiert wird (ZHAO et al. 2016).
SSEA-4 (Stage-specific embryonic antigen 4) ist ein weiterer Marker, der bisher zur Selektion von ovariellen Stammzellen beim Schwein verwendet wurde (BUI et al.
2014). Es gibt jedoch auch Studien, dass VSELs (Very small embryonic-like stem cells), die in verschiedenen Geweben lokalisiert sind, SSEA-4 exprimieren (KUCIA et al. 2006, KUCIA et al. 2007, RATAJCZAK et al. 2008, VIRANT-KLUN et al. 2008). Es wird vermutet, dass es sich bei diesen Zellen um Stammzellen handelt, die während der Embryogenese in den Organen gebildet werden und dass es sich um direkte Abkömmlinge von Primordialkeimzellen handelt. Die Keimzelllinie erzeugt Soma, um Gene an die nächste Generation weiterzugeben und wird deswegen zur Mutterzelllinie für alle Zellen im adulten Organismus (RATAJCZAK et al. 2008).
1.4.1.2 Magnetic-activated cell sorting (MACS) und Fluorescence-activated cell sorting (FACS)
Für die Isolierung von ovariellen Stammzellen mit MACS oder FACS werden spezifische Oberflächenmarker verwendet.
Murine ovarielle Stammzellen wurden mittels MACS und Vasa (WHITE et al. 2012, ZOU et al. 2009) und Fragilis (ZOU et al. 2011) als Selektionsmarker isoliert. Für die Isolierung ovarieller Stammzellen beim Schwein wurde SSEA-4 als Oberflächenmarker verwendet (BUI et al. 2014, WARTALSKI et al. 2016).
Bei MACS werden die Zielzellen mit magnetischen Beads markiert und über spezielle magnetische Säulen aufgereinigt (Abb.6).
Abbildung 6: Schematische Darstellung der Anreicherung von markierten Zellen mit dem MACS-Verfahren
S N
S N
1. Magnetische Markierung
Zielzellen werden mit magnetischen MACS MicroBeads markiert.
2. Magnetische Auftrennung
Zellen werden durch eine MACS- Säule in einem MACS-Separator aufgetrennt.
Die Durchflussfraktion kann als Negativfraktion ohne markierte Zellen aufgefangen werden.
3. Eluierung der markierten Zellen
Die Säule wird aus dem Separator entfernt.
Die sich in der Säule befindenden Zellen werden als angereicherte, positiv selektierte Fraktion eluiert.
Die magnetische Auftrennung erfolgt über spezielle magnetische Säulen, die in einen magnetischen Separator eingespannt werden. Die aufzutrennenden Proben werden auf die Säulen geladen. Die Durchflussfraktion kann als Negativfraktion aufgefangen werden, während die Zielzellen durch ihre magnetische Markierung in der Säule festgehalten werden. Die markierten Zellen können nach Entfernen der Säule aus dem Separator als angereicherte, positiv selektierte Zellfraktion eluiert werden.
Beim FACS werden die Zielzellen mit fluoreszierenden Antikörpern markiert. Es konnten bisher murine und humane ovarielle Stammzellen mittels FACS isoliert werden (IMUDIDA et al. 2013, WHITE et al. 2012, WOODS und TILLY 2013). Die Isolierung basierte auf der Oberflächenexpression des Vasa-Proteins (IMUDIDA et al.
2013, WHITE et al. 2012, WOODS und TILLY 2013). Eine andere Möglichkeit, ovarielle Stammzellen mit FACS zu isolieren, ist die Verwendung transgener Tiere.
PACHIAROTTI et al. (2010) isolierten ovarielle Stammzellen aus OG2- Mäusen (Oct4- EGFP-transgen). Die Isolierung der Zellen beruhte in diesem Fall auf der Detektion von GFP-positiven Zellen.
Das Prinzip dieser Methode beruht auf der Emission von optischen Signalen der analysierten Zellen. Die zu analysierenden Zellen passieren in hoher Geschwindigkeit einzeln einen Laserstrahl. Die dabei entstehenden Fluoreszenzsignale werden von einem Detektor erfasst und ausgewertet. Auf dieser Auswertung beruht die Sortierung der Zellen. Zellen, die mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert sind, werden von nicht fluoreszierenden Zellen in getrennte Gefäße sortiert.
1.4.1.3 Differentielles Plattieren
Ein technisch einfacheres Verfahren ist das differentielle Plattieren. Diese Methode wurde zur Anreicherung von ovariellen Stammzellen beim Schwein verwendet (BUI et al. 2014).
Dieses Verfahren beruht darauf, dass sich somatische Zellen nach dem Aussäen schneller auf dem Boden der Kulturplatten absetzen als Stammzellen. Demnach kann nach bestimmten Zeitpunkten der Überstand von einer Kulturplatte abgenommen und weiterkultiviert werden. Auf diese Weise wird der Anteil somatischer Zellen in der Zellsuspension verringert. Testikuläre Keimbahnstammzellen konnten mit dieser Methode beim Schwein bis zu 80% angereichert werden (KIM et al. 2010, PARK et al.
2014).
1.4.1.4 In-vitro-Kultur von ovariellen Gewebestückchen
Es gibt bisher eine Studie, in der ovarielle Stammzellen vom Rind durch In-vitro-Kultur von ovariellen Gewebestückchen isoliert bzw. angereichert wurden (DE SOUZA et al.
2017).
Beim Ausplattieren von Gewebestückchen geht man davon aus, dass die sich im Gewebe befindenden ovariellen Stammzellen, nach einigen Tagen der In-vitro-Kultur an den Rand des Gewebestücks wandern und sich am Boden der Zellkulturschale anheften. In der Studie beim Rind wurden die Gewebestücke nach einigen Tagen entfernt und nur die sich angehefteten Zellen weiterkultiviert (DE SOUZA et al. 2017).
Tabelle 2 zeigt eine Übersicht zu den verwendeten Anreicherungsmethoden und Markern zur Isolierung ovarieller Stammzellen bei Maus, Mensch, Schwein und Rind.
Spezies Methode Marker Zelleigenschaften Quelle
Maus
MACS
Vasa Expression von Keimzellmarkern wie Vasa, Fragilis, Stella und Nanog. In-
vitro-Kultur über 6 Monate.
Differenzierung zu Oozyten in vitro und in vivo.
ZOU et al.
2009
Fragilis ZOU et al.
2011
FACS
Vasa Expression von Keimzellmarkern wie Vasa, Fragilis, Dazl und Dppa3. In- vitro-Kultur über 18 Monate.
Differenzierung zu Oozyten in vitro und in vivo.
IMUDIDA et al.
2013 WHITE et al.
2012
GFP Expression von Vasa, Oct4 und Nanog. In-vitro-Kultur
über 12 Monate.
PACHIAROTTI et al. 2010
Mensch FACS VASA Expression von Keimzellmarkern wie VASA, FRAGILIS, DAZL und DPPA3.
In-vitro-Kultur über 18 Monate
WHITE et al.
2012
Schwein
MACS SSEA-
4
Expression von OCT4, VASA, FRAGILIS und STELLA und 6
Monate In-vitro-Kultur.
WARTALSKI et al. 2016 BUI et al. 2014 Differetielles
Plattieren
-
Vereinzelung von Ovarcortex
- Expression von CD29, CD44, CD90 und positiv auf AP- Aktivität. In-vitro-Kultur 3-5
Passagen.
SONG et al.
2011
Rind In-vitro-Kultur von ovariellen
Gewebe- stückchen
- Zellen exprimierten Pluripotenzmarker wie OCT4
und SOX2, Keimzellmarker VASA und DAZL und wurden
14 Tage in vitro kultiviert.
DE SOUZA et al. 2017
Tabelle 2: Übersicht zu Anreicherungsmethoden und verwendeten Marker zur Isolierung ovarieller Stammzellen bei Maus, Mensch, Schwein und Rind
1.4.2 In-vitro-Kultivierung
Für die In-vitro-Kultivierung von ovariellen Stammzellen werden in der Literatur verschiedene Kulturbedingungen beschrieben. Da die Entdeckung dieser Zellen in der Forschung noch relativ neu ist (JOHNSON et al. 2004), fehlt das grundlegende Wissen bezüglich wichtiger Nährstoffe und Wachstumsfaktoren, die für eine erfolgreiche In-vitro-Kultivierung notwendig sind. Die Nische, in der ovarielle Stammzellen natürlicherweise vorkommen, ist ein komplexes System. Deswegen müssen die In-vitro-Kulturbedingungen bezüglich Kulturmedium, Wachstumsfaktoren, Zusatz von Hormonen, Feederzellen und Beschichtung der Zellkulturplatten so optimiert werden, dass die natürliche Umgebung dieser Zellen so gut wie möglich nachgeahmt wird.
Hinzu kommen noch speziesspezifische Unterschiede.
Die Zellkulturplatten wurden in den meisten Fällen mit extrazellulären Matrices wie Gelatine (BAI et al. 20013, ZHOU et al. 2014, ZOU et al. 2009), Poly-D-Lysin (DYCE et al. 2011) und Laminin (BUI et al. 2014, DYCE et al. 2011) beschichtet, um die Haftung der Zellen an der Zellkulturplatte zu verbessern.
Oft werden sogenannte Feederzellen für die In-vitro-Kultivierung von ovariellen Stammzellen verwendet, um eine gute Nährstoffversorgung der Stammzellen zu gewährleisten. In den meisten Studien wurden inaktivierte MEFs (murine embryonale Fibroblasten) (BUI et al. 2014, WHITE et al. 2012) oder inaktivierte STO (SIM Thioguanine/Ouabain-resistant) -Zellen (ZHOU et al. 2014, ZOU et al. 2009) als Feederzellen benutzt. Die ovariellen Stammzellen wurden aber auch ohne Feederzellen direkt auf mit Gelatine oder Laminin beschichteten Zellkulturplatten kultiviert (BAI et al. 2013, BUI et al. 2014, LEE et al. 2013, PARTE et al. 2011, DE SOUZA et al. 2017).
Bis heute gibt es ovarielle Stammzellen von Maus (WHITE et al. 2012, ZOU et al.
2009), Mensch (WHITE et al. 2012), Ratte (ZHOU et al. 2014), Schwein (BAI et al.
2013, BUI et al. 2014) und Rind (DE SOUZA et al. 2017), die längere Zeit über mehrere Passagen in vitro kultiviert werden konnten (Abb. 7).
Abbildung 7: Morphologie ovarieller Stammzellen bei verschiedenen Spezies (a) Maus (WHITE et al. 2012), (b) Mensch (WHITE et al. 2012), (c) Ratte (ZHOU et al.
2014), (d) Schwein (BUI et al. 2014) und (e) Rind (DE SOUZA et al. 2017)
Für die In-vitro-Kultivierung von murinen ovariellen Stammzellen wurde MEM-α (Minimum Essential Medium α) als Grundmedium verwendet. Außer 10% FBS (fetal bovine serum), wurden diesem Medium LIF (leukemia inhibitory factor), EGF (epidermal growth factor), bFGF (basic fibroblast growth factor) und GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor) zugesetzt (WOODS und TILLY 2013). Damit konnten murine und humane Stammzellen über 18 Monate in vitro kultiviert werden (WHITE et al. 2012). In einer Studie zu murinen ovariellen Stammzellen wurden dem Kulturmedium noch zusätzlich Transferrin, Putrescin und Insulin beigesetzt (ZOU et al.
2009), um die Zellen erfolgreich zu kultivieren. Etablierte Zelllinien von neonatalen Mäusen konnten damit 15 Monate und von adulten Mäusen sechs Monate in vitro kultiviert werden (ZOU et al. 2009). HU et al. (2012) kultivierten murine ovarielle Stammzellen in H-DMEM mit 15% FBS. Diese Zellen konnten drei Wochen über vier Passagen kultiviert werden.
Ovarielle Stammzellen vom Schwein wurden in verschiedenen Zellkulturmedien
a b c
d
eZellen konnten in diesem Medium über vier Monate erhalten werden (BAI et al. 2013).
SONG et al. (2011) nutzen A-DMEM mit 10% FBS als Grundmedium für die Kultur von ovariellen Stammzellen. Die Zellen wiesen eine fibroblastenähnliche Morphologie auf und konnten mindestens bis Passage 5 kultiviert werden (SONG et al. 2011). BUI et al. (2014) verwendeten MEM-α, Stem-Pro34 und DMEM/F12, um die Kulturbedingungen von ovariellen Stammzellen beim Schwein zu optimieren. Obwohl sie Zusätze wie bFGF, GDNF, EGF und LIF nutzten, die für die In-vitro-Kultivierung von spermatogonialen Stammzellen (KUBOTA et al. 2004) und ovariellen Stammzellen (ZOU et al. 2009) essentiell sind, reichten diese Bedingungen nicht, um porzine ovarielle Stammzellen in vitro zu etablieren (BUI et al. 2014).
Deswegen wurde DMEM/F12 mit 10% FBS oder KSR, mit Zusatz des Zellkultursupplements B27 und verschiedenen Konzentration von SCF (stem cell factor) für die In-vitro-Kultivierung von ovariellen Stammzellen vom Schwein getestet.
Die Ergänzung mit SCF verbesserte die Proliferation ovarieller Stammzellen konzentrationsabhängig. Der Zusatz von FBS förderte das Wachstum von flachen, somatischen Zellen und behinderte somit das Wachstum von ovariellen Stammzellen.
Deswegen war DMEM/F12 mit B27 und 40ng/ml SCF das effektivste Kulturmedium für Wachstum von ovariellen Stammzellen beim Schwein. Die Zellen konnten in diesem Medium über sechs Monate und 30 Passagen kultiviert werden (BUI et al. 2014).
Ovarielle Stammzellen vom Rind wurden in MEM-α kultiviert, dem Insulin, Transferrin, Selenium und BSA zugesetzt waren (DE SOUZA et al. 2017). In dieser Studie wurden die Zellen jedoch nur 14 Tage in vitro kultiviert und danach direkt für weitere Analysen verwendet.
1.5 Anwendungsbereiche ovarieller Stammzellen
Da es viele potentielle Einsatzmöglichkeiten für ovarielle Stammzellen gibt, hat ihre Erforschung in letzter Zeit großes wissenschaftliches Interesse erlangt.
Die Erforschung von ovariellen Stammzellen könnte der Humanmedizin von großem Nutzen sein. Denn diese Zellen würden die Möglichkeit eröffnen, OSCs für Transplantationen und Therapien einzusetzen, um die ovarielle Funktion und Fertilität zu beeinflussen (TILLY et al. 2009, TILLY und TELFER 2009). OSCs könnten Frauen helfen, die verfrüht in die Menopause eintreten und deswegen keine Follikelproduktion mehr aufweisen, bzw. Frauen, die erst spät einen Kinderwunsch entwickeln. Auch präpuberale Frauen ohne reife Oozyten könnten von ovariellen Stammzellen profitieren. Einen großen Anwendungsbereich der OSCs könnte die Fertilitätserhaltung nach einer Chemotherapiebehandlung bei einer Krebserkrankung darstellen. Die zurzeit verfügbaren Methoden (Kryokonservierung von Oozyten/Embryonen/Ovargewebe) sind in ihren Möglichkeiten begrenzt. Da die Anzahl der Langzeitüberlebenden nach einer Krebserkrankung stetig ansteigt, wünschen sich viele Patientinnen die Erhaltung ihrer ovariellen Funktion und Fertilität mit kostengünstigeren, dauerhaften und zuverlässigen Methoden (TORRE et al.
2015).
Ovarielle Stammzellen könnten auch bei Nutztieren neue Möglichkeiten eröffnen, Eizellen und Embryonen von genetisch wertvollen Tieren zu produzieren und diese näher an die tierzüchterische Praxis zu bringen. OSCs könnten aus Ovarbiopsien wertvoller Tiere isoliert und in vitro in Oozyten differenziert werden. Damit wäre eine frühe genomische Selektion mit für die Zucht geeigneten Tieren möglich. Da die OSCs in vitro vermehrt und differenziert werden könnten, würde diese Methode den Vorteil bieten, dass man den Tieren nur einmal eine Biopsie entnehmen müsste, anstatt die Tiere mehrmals punktieren zu müssen. Da es in der Kälberaufzucht häufig zu Verlusten durch Lungenerkrankungen oder Diarrhoe kommt, könnte man auch in diesen Fällen bei wertvollen Tieren die Ovarien entnehmen, um daraus OSCs zu
kryokonservieren. Auch in der Grundlagenforschung könnten diese Zellen Anwendung finden und ein Modell für die Entwicklung und Reifung von Eizellen darstellen.
1.6 Ziele der Arbeit
Das Hauptziel dieser Forschungsarbeit ist, das Vorhandensein ovarieller Stammzellen in Schwein und Rind zu untersuchen. Ovarielle Stammzellen sollten aus porzinen und bovinen Ovarien isoliert werden, ferner in vitro kultiviert und charakterisiert werden.
Die daraus gewonnenen Erkenntnisse können in Zukunft der Tierzucht von erheblichem Nutzen sein.
Die Stammzellen sollen mit Hilfe von enzymatischer Gewebevereinzelung und Magnetic-activated cell sorting aus der komplexen Zellpopulation des Ovargewebes isoliert, angereichert, in vitro kultiviert und charakterisiert werden.
II. MATERIAL UND METHODEN 2.1 Versuchsdesign
In der vorliegenden Arbeit sollten putative ovarielle Stammzellen aus porzinen und bovinen Ovarien isoliert, in vitro kultiviert und charakterisiert werden. Als Positivkontrolle wurden ovarielle Zellen der Maus verwendet. Ausgehend von bisherigen Untersuchungen an murinen und humanen Ovarien wird vermutet, dass es im Ovar Vasa- und Fragilis-positive Stammzellen gibt, die auch postnatal Eizellen produzieren und somit den Follikelpool aufstocken können. Solche Zellen konnten aufgrund ihrer Vasa-Expression bereits in ersten Ansätzen isoliert und in vitro kultiviert werden.
Um solche Zellen aus porzinen bzw. bovinen Ovarien isolieren zu können, wurde das Ovargewebe zuerst enzymatisch und mechanisch vereinzelt, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. Diese Zellsuspension wurde mit Antikörpern gegen VASA oder FRAGILIS auf Proteinexpression untersucht und das Ergebnis mittels Konfokalmikroskopie und Durchflusszytometrie analysiert. Zum anderen wurden die VASA- bzw. FRAGILIS-positiven Zellen mit Hilfe des Magnetic-activated cell sortings angereichert. Die dabei entstandenen Zellfraktionen wurden zum einen direkt nach der Anreicherung mittels RealTime-PCR auf die Expression verschiedener Keimzellmarker untersucht. Zum anderen wurden die Zellfraktionen in verschiedenen Zellkulturmedien (MEM-α, konditioniertes MEM-α, DMEM, mTeSR1 ohne Zusätze und mTeSR1 mit Zusätzen) in vitro kultiviert. Abbildung 8 stellt die Versuche und das Projektziel dieser Arbeit schematisch dar.
Abbildung 8: Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus
(Abkürzungen der Gene: FRA=FRAGILIS, PRDM1= PR domain zinc finger protein 1, ZP3=Zona pellucida sperm-binding protein 3)
In-vitro-Zellkultur in versch. Medien
Vasa+
Fragilis+
Zellen Ovar
Durchfluss zytometrie
Magnetic- activated cell sorting
Laser Konfokal- mikroskopie
S N S N
Verdau
Rind, Schwein Maus (Positivkontrolle)
DMEM, MEM-Alpha, mTeSR1 DMEM and MEM-Alpha mit:
• 1x concentrated N2-supplement
• 10^3 units ml-1LIF
• 10ng ml-1EGF
• 1ng ml-1bFGF
• 40ng ml-1GDNF Immunfluoreszenz-
färbung Vasa Fragilis
RT-qPCR (VASA, FRA, PRDM1, ZP3) Vasa+, Vasa-, Fragilis+ und
Fragilis- Zellfraktionen
Immunfluoreszenzfärbung Vasa und Fragilis
