In-vitro-Kultivierung der selektierten Rinderzellen

Die mittels MACS angereicherten bovinen ovariellen Zellen wurden nach der Anreicherung mit VASA oder FRAGILIS in fünf verschiedenen Zellkulturmedien in vitro kultiviert. Abbildung 40 zeigt die VASA- und FRAGILIS-selektierten Zellen direkt nach dem MACS. Und auch bei den bovinen Positiv- und Negativfraktionen konnten, ebenfalls wie schon vorher bei den murinen und porzinen Zellen, Zellen unterschiedlicher Größe beobachtet werden. Während die Zellen in den Positivfraktionen einen Durchmesser von ca. 20-25µm aufwiesen, waren die Zellen in den Negativfraktionen mit ca. 8-10µm Durchmesser wesentlich kleiner.

Abbildung 40: Bovine VASA- und FRAGILIS-selektierte Zellen direkt nach der MACS-Sortierung MEM-α; a) VASA-positiv selektierte Zellen, b) VASA-negativ selektierte Zellen, c) FRAGILIS-positiv selektierte Zellen, d) FRAGILIS-negativ selektierte Zellen;

der Maßstab entspricht 100µm

Auch bei den VASA- und FRAGILIS-selektierten ovariellen Rinderzellen waren die Zellzahlen in den VASA- bzw. FRAGILIS-positiv selektierten Zellfraktionen viel geringer als in den VASA- bzw. FRAGILIS-negativ selektierten Zellen. Die Anreicherung von ovariellen Zellen mit VASA bzw. FRAGILIS wurde, ebenfalls wie beim Schwein, jeweils dreizehnmal durchgeführt.

Wie die selektierten murinen und porzinen ovariellen Zellen, wurden auch die selektierten bovinen Zellen in MEM-α als Standardmedium in vitro kultiviert. In allen dreizehn Versuchen konnten in diesem Medium, sowohl in den VASA-positiv als auch in den FRAGILIS-positiv selektierten Zellen, nur somatische Zellen beobachtet werden (Abb. 41). Die Zellen aller Zellfraktionen zeigten eine fibroblastenähnliche Morphologie, eine schnelle Proliferation und überwuchsen die Zellkulturplatten bereits nach einigen Tagen In-vitro-Kultur.

Abbildung 41: Morphologie von VASA- und FRAGILIS-positiv und VASA- und FRAGILIS-negativ selektierten bovinen ovariellen Zellen in MEM-α; a) VASA-positiv, Passage 1, b) FRAGILIS-positiv, Passage 0, c) VASA-negativ, Passage 0, d)

Zusätzlich zum MEM-α wurden die selektierten bovinen Zellen in konditioniertem MEM-α kultiviert. Das Medium wurde mit inaktivierten ovariellen Zellen 24h konditioniert, um die notwendigen Faktoren aus der ovariellen Nische für die In-vitro-Kultur der selektierten Zellen verwenden zu können. Wie bei MEM-α, konnten auch beim konditionierten MEM-α, nur somatische Zellen mit fibroblastenähnlicher Morphologie beobachtet werden (Abb. 42). Sowohl bei den VASA-positiv als auch bei den FRAGILIS-positiv selektierten Zellen konnten weder vereinzelte runde Zellen, noch Zellkolonien beobachtet werden. Die Morphologie der in diesem Medium kultivierten Zellen unterschied sich bei den dreizehn Versuchswiederholungen nicht.

Abbildung 42: Morphologie von VASA- und FRAGILIS-positiv und VASA- und FRAGILIS-negativ selektierten bovinen ovariellen Zellen in konditioniertem MEM-α; a) VASA-positiv, Passage 1, b) FRAGILIS-positiv, Passage 0, c) VASA-negativ, Passage 0, d) FRAGILIS-negativ, Passage 0, der Maßstab entspricht 100µm

Wie auch die selektierten porzinen Zellen, wurden die selektierten bovinen Zellen in DMEM in vitro kultiviert. Im Gegensatz zu den Beobachtungen im Schwein, konnten beim Rind bei den VASA-positiv und FRAGILIS-positiv selektierten Zellen, weder vereinzelte runde Zellen, noch Zellkolonien beobachtet werden. Auch in diesem Medium konnten nur fibroblastenähnliche Zellen mit einer schnellen Proliferation beobachtet werden (Abb. 43).

Abbildung 43: Morphologie von VASA- und FRAGILIS-positiv und VASA- und FRAGILIS-negativ selektierten bovinen ovariellen Zellen in konditioniertem DMEM; a) VASA-positiv, Passage 1, b) FRAGILIS-positiv, Passage 0, c) VASA-negativ, Passage 0, d) FRAGILIS-negativ, Passage 0, der Maßstab entspricht 100µm

Die bovinen ovariellen Zellen wurden außerdem in mTeSR1 kultiviert, da in diesem Medium bovine embryonale Stammzellen bereits erfolgreich kultiviert werden konnten (BOGLIOTTI et al. 2017). Im mTeSR1 ohne Zusätze konnten in allen dreizehn Versuchsansätzen nur fibroblastenähnliche somatische Zellen in den VASA-positiv und FRAGILIS-positiv selektierten Zellen beobachtet werden (Abb. 44). Nach einiger Zeit In-vitro-Kultur wiesen die kultivierten Zellen und auch die MEFs eine veränderte Morphologie auf. Sie zogen sich zusammen und lösten sich vom Boden der Zellkulturschale ab (Abb. 44c und d).

Abbildung 44: Morphologie von VASA- und FRAGILIS-positiv und VASA- und FRAGILIS-negativ selektierten bovinen ovariellen Zellen in mTeSR1 ohne Zusätze; a) VASA-positiv, Passage 1, b) FRAGILIS-positiv, Passage 0, c) VASA-negativ, Passage 0, d) FRAGILIS-negativ, Passage 0, der Maßstab entspricht 100µm

Im mTeSR1 mit Zusätzen konnten ca. zwei bis drei Wochen nach Aussäen der VASA-positiv und FRAGILIS-VASA-positiv selektierten Zellfraktionen runde, etwa 20µm große Zellen beobachtet werden (Abb. 45). In den VASA-positiv selektierten Zellfraktionen waren mehr runde Zellen zu sehen als in den FRAGILIS-positiv selektierten Fraktionen (Abb. 45a und b). Bei den FRAGILIS-positiv selektierten Zellen konnten eher einzelne runde Zellen beobachtet werden, während die VASA-positiv selektierten Zellen Kolonien bildeten. Die in Abbildung 45a sichtbaren Zellen konnten in den VASA-positiv selektierten Fraktionen in zehn von dreizehn Versuchen beobachtet werden. In den FRAGILIS-positiv selektierten Fraktionen konnten die Zellen in sieben von dreizehn Versuchen beobachtet werden. Die Zellen beider Fraktionen zeigten ein langsames Proliferationsverhalten und lösten sich nach einigen Wochen von den MEFs ab. Nach Versuchen die Zellen zu passagieren, konnten diese nicht mehr beobachtet werden.

Im Gegensatz zu den anderen Zellkulturmedien, wiesen die in mTeSR1-kultivierten Negativfraktionen keine fibroblastenähnliche Morphologie auf. Nach einigen Tagen In-vitro-Kultur formten die Zellen große Zellklumpen (Abb. 45c und d). Diese lösten sich nach einiger Zeit von der Kulturschale ab.

Abbildung 45: Morphologie von VASA- und FRAGILIS-positiv und VASA- und FRAGILIS-negativ selektierten bovinen ovariellen Zellen in mTeSR1 mit Zusätzen; a) VASA-positiv, Passage 0, b) FRAGILIS-positiv, Passage 0, c) VASA-negativ, Passage 0, d) FRAGILIS-negativ, Passage 0, der Maßstab entspricht 100µm

Da die in vitro kultivierten bovinen Zellen, wie auch die murinen und porzinen Zellen, ein sehr langsames Proliferationsverhalten aufwiesen und nicht passagierbar waren, wurden diese 2-3 Wochen nach Aussäen auf die Expression von VASA und FRAGILIS auf Proteinebene analysiert. VASA und FRAGILIS konnten bei den als VASA-positiv und FRAGILIS-positiv selektierten Zellen, wie vorher schon bei den murinen und porzinen Zellen, auf Proteinebene nicht nachgewiesen werden. Die entsprechenden Aufnahmen der Immunfluoreszenzfärbungen, samt Kontrollen, finden sich im Anhang.

Tabelle 13 zeigt eine Übersicht zu den Ergebnissen der In-vitro-Kultur-Versuche.

SelektionsmarkerMediumMorphologieAuftreten von runden Zellen (Versuchsanzahl)Passagen- nummer Maus

VasaMEM-αRunde, Kolonien bildende Zellen4 (4)P3 FragilisEinzelne runde Zellen3 (3)P0 hwein

VASAMEM-α DMEM

MEM-α: helle, runde, Kolonien bildende Zellen DMEM: helle runde, Kolonien bildende Zellen und dunkle vereinzelte Zellen

MEM-α: 1 (13) DMEM: 1 (13) (hell) bzw. 10 (13) (dunkel)

MEM-α: P3 DMEM: P7 (hell) bzw. P3 (dunkel) FRAGILISMEM-α, DMEMEinzelne runde ZellenMEM-α: 7 (13) DMEM: 1 (13)

P0 RindVASAmTeSR1+ ZusätzeRunde, Kolonien bildende Zellen10 (13)P0 FRAGILISEinzelne runde Zellen7 (13)P0 belle 13: Übersicht zu den Ergebnissen derIn-vitro-Kultur-Versuche