Isolierung und Anreicherung ovarieller Stammzellen von Schwein und

des Ovargewebes entstandene Einzelzellsuspension hauptsächlich somatische Zellen. WHITE et al. (2012) schätzten den Anteil ovarieller Stammzellen bei der Maus auf etwa 0,014%. Da dies nur einen sehr geringen Anteil einer Gesamtzellpopulation ausmacht, ist eine effektive Anreicherungsmethode von Vorteil.

Verschiedene Methoden, unter anderem MACS und FACS, wurden bereits erfolgreich zur Anreicherung ovarieller Stammzellen bei Maus (WHITE et al. 2012, ZOU et al.

2009, ZOU et al. 2011), Mensch (IMUDIDA et al. 2013, WHITE et al. 2012) und Schwein (BUI et al. 2014) verwendet. In dieser Arbeit wurde das MACS zum Anreichern ovarieller Stammzellen von Schwein und Rind ausgewählt, da diese Methode bereits bei Maus und Schwein unter Verwendung verschiedener Oberflächenmarker Anwendung fand (BUI et al. 2014, WHITE et al. 2012, ZOU et al.

2009, ZOU et al. 2011). Die Keimzellmarker VASA und FRAGILIS wurden als Selektionsmarker für ovarielle Stammzellen ausgewählt, weil diese erfolgreich bei Maus (WHITE et al. 2012, ZOU et al. 2009, ZOU et al. 2011) und Mensch (IMUDIDA et al. 2013, WHITE et al. 2012) angewendet wurden. Die angereicherten Zellfraktionen wurden nach der Selektion auf die Expression von Keimzellmarkern (VASA, FRAGILIS, PRDM1 und ZP3) untersucht, um die Effizienz der Anreicherung mittels MACS zu beurteilen.

Für eine erfolgreiche Anreicherung der ovariellen Stammzellen, müssen diese zuerst aus der Gesamtpopulation der ovariellen Zellen isoliert werden. Eine gängige Methode dafür ist die enzymatische Gewebevereinzelung. In der vorliegenden Arbeit wurden die modifizierten Methoden nach HONARAMOOZ et al. (2002) und nach WOODS und TILLY (2013) für die enzymatische Vereinzelung von porzinen und bovinen Ovarien getestet, sowie zwei Kollagenasetypen.

Bei der Vereinzelung porziner und boviner Ovargewebe zeigte sich ein signifikanter Unterschied zwischen den beiden oben genannten Methoden. Da die Vitalität der

(2013) signifikant höher war als nach HONARAMOOZ et al. (2002), wurde diese in den weiteren Versuchen eingesetzt. Die Ergebnisse der Vitalitätstests zeigten, dass die Methode nach WOODS und TILLY (2013) nicht nur zur Vereinzelung von murinem und humanem Ovargewebe (WHITE et al. 2012), sondern auch bei porzinem und bovinem Ovargewebe erfolgreich eingesetzt werden kann.

Beim Test der beiden Kollagenasen, zeigten sich bei den porzinen und bovinen Zellen keine Vitalitätsunterschiede zwischen den Behandlungsgruppen. Da Kollagenasetyp und Enzymkonzentration keinen Einfluss auf die Vitalität der gewonnenen Zellen hatten, wurde für weitere Versuche die Kollagenase Typ II mit einer Konzentration von 800U/ml verwendet. Dieselbe Kollagenasekonzentration wurde auch zur Vereinzelung muriner Ovarien eingesetzt (WHITE et al. 2012, WOODS und TILLY 2013).

ZOU et al. (2009) berichteten als Erste über die Isolierung von murinen ovariellen Stammzellen mittels MACS und Vasa als Selektionsmarker. Zwei Jahre später berichteten ZOU et al. (2011) über eine höhere Effizienz bei der Anreicherung mit Fragilis als Selektionsmarker im Vergleich zu Vasa. Auch beim Schwein wurde über die Anreicherung von ovariellen Stammzellen mittels MACS unter Verwendung des Oberflächenmarkers SSEA-4 berichtet (BUI et al. 2014, WARTALSKI et al. 2016). Da SSEA-4 auch in sogenannten VSEL-Zellen (Very small embryonic-like stem cells) exprimiert wird (VIRANT-KLUN et al. 2008), wurden in dieser Arbeit Vasa und Fragilis als Selektionsmarker verwendet.

Bei der Analyse der Expression der VASA- und FRAGILIS-Proteine mittels Konfokalmikroskopie, konnten einzelne positive Zellen in porzinen und bovinen Ovarsuspensionen beobachtet werden. Mittels Durchflusszytometrie sollte der Anteil VASA- und FRAGILIS-positiver Zellen in porzinen und bovinen ovariellen Zellsuspensionen bestimmt werden. Bei den als Kontrolle dienenden Mauszellen wurden 1,5% Vasa-positive und 1,7% Fragilis-positive Zellen detektiert. Dieses Ergebnis bestätigt die FACS-Messungen von WHITE et al. (2012), in denen ebenfalls 1,5% Vasa-positive Zellen in murinen Ovarien detektiert wurden. Beim Schwein wurden in dieser Arbeit 2,8% und beim Rind 3,1% VASA-positive Zellen detektiert. Die höheren Werte im Vergleich zur Maus könnten daran liegen, dass für die Vereinzelung

von porzinen und bovinen Ovarien nur die Ovarrinde verwendet wurde, in der die Lokalisation der ovariellen Stammzellen vermutet wurde (JOHNSON et al. 2004, WHITE et al. 2012). Bei den murinen Ovarien wurden aufgrund ihrer Größe die kompletten Organe vereinzelt. Bei der Analyse der FRAGILIS-Expression wurden 1,4% FRAGILIS-positive Zellen beim Schwein und 1,5% FRAGILIS-positive Zellen beim Rind detektiert, was etwas niedriger als die Expression des VASA-Proteins war.

Eine mögliche Erklärung dafür wäre, dass nicht alle VASA-positiven Zellen auch FRAGILIS exprimieren oder die beiden Antikörper unterschiedliche Zelltypen detektieren. BUI et al. (2014) konnten zeigen, dass 4,65% porzine ovarielle Zellen VASA und 4,71% FRAGILIS nach In-vitro-Kultur exprimieren. Dies deutet wiederum auf einen gleichen Anteil VASA- und FRAGILIS-exprimierender Zellen hin und unterscheidet sich vom Ergebnis der vorliegenden Arbeit.

Die mittels Durchflusszytometrie gemessenen porzinen und bovinen VASA- und FRAGILIS-positiven Zellen sollten mit Hilfe von MACS angereichert werden. Bei einer Gesamtzellzahl von 10 Millionen Zellen wurden bei allen Spezies ca. 50.000 Zellen als VASA-positiv und ca. 30.000 Zellen als FRAGILIS-positiv selektiert. Dies würde 0,5%

VASA-positiven Zellen und 0,3% FRAGILIS-positiven Zellen entsprechen. Diese Werte stimmen nicht mit den durchflusszytometrischen Messungen überein. Es muss jedoch beachtet werden, dass mit dem Durchflusszytometer ein Pool von lebenden vereinzelten Zellen betrachtet wird, der nur eine Fraktion der Gesamtzellpopulation darstellt, die das ovarielle Gewebe vor Vereinzelung ausmacht. Bei der Durchflusszytometrie werden, im Vergleich zum MACS, tote oder nicht vereinzelte Zellen nicht in Betracht gezogen. Die Effizienz der Anreicherung wurde durch Genexpressionsanalysen von Keimzellmarkern auf mRNA-Ebene überprüft.

Bei den mit VASA angereicherten Zellen konnte eine fünffache signifikante Anreicherung bei porzinen und eine 1,5fache Anreicherung bei bovinen Zellen nachgewiesen werden. Die Expression von PRDM1 war jedoch auch nur in den porzinen Zellen signifikant unterschiedlich zwischen den Zellfraktionen. Diese Ergebnisse zeigen, dass VASA als Selektionsmarker nicht gleichermaßen für Schwein

Interessant ist ferner, dass, im Gegensatz zu den porzinen Zellen, die Expression von ZP3 in beiden bovinen Zellfraktionen relativ hoch war. Da ZP3 ein obligatorischer Eizellmarker ist, deutet dies auf eine Verfälschung der Ergebnisse durch Eizellen hin.

Mit FRAGILIS als Selektionsmarker konnte nur bei den porzinen, nicht bei den bovinen Zellen eine Anreicherung erzielt werden. Es wurde zwar gezeigt, dass die Anreicherung muriner ovarieller Stammzellen mittels MACS mit Fragilis als Selektionsmarker effizienter war als mit Vasa (ZOU et al. 2011), dies kann jedoch speziespezifisch unterschiedlich sein. Damit werden die bereits oben beschriebenen durchflusszytometrischen Messungen bestätigt, dass nicht die gleiche Anzahl an Zellen in porzinen und bovinen Ovarien VASA und FRAGILIS exprimieren.

Trotz der fünffachen Anreicherung VASA-positiver porziner Zellen, wurde auch in der Negativfraktion eine VASA-Expression detektiert. WHITE et al. (2012) verwendeten sowohl MACS als auch FACS für die erfolgreiche Anreicherung von murinen ovariellen Stammzellen. Sie bevorzugten das FACS, da beim MACS tote oder beschädigte Eizellen die Anreicherung verfälschten und die mit FACS isolierten Populationen eine höhere Reinheit hatten. Beim Vergleich von FACS und MACS konnte zwar gezeigt werden, dass die Reinheit der isolierten Zellpopulationen beim FACS höher war, die Vitalität und Amplifikationsrate der gewonnenen Zellen jedoch signifikant niedriger waren als beim MACS (LI et al. 2013). Außerdem hat das FACS mit ca. 30 x 10⁶ Zellen pro Tag einen begrenzten Durchsatz und benötigt einen erfahrenen Operator, während das MACS eine schnellere Methode mit einem höheren Durchsatz darstellt, die unter der Laborbank ohne weiteres spezifisches Equipment ausgeführt werden kann (VALLI et al. 2014).