SYBR Green-qPCR

Die quantitative RealTime-PCR dient wie die herkömmliche PCR zur Vervielfältigung von Nukleinsäuren und ermöglicht gleichzeitig die Quantifizierung der amplifizierten DNA. Die Quantifizierung der gewonnenen DNA wird durch Fluoreszenzmessungen ermöglicht. Bei der in dieser Arbeit verwendeten Methode wurde SYBR Green als Fluoreszenzfarbstoff eingesetzt. Der DNA-Farbstoff interkaliert mit der entstandenen DNA, wodurch seine Fluoreszenz ansteigt. Da die Fluoreszenzintensität mit der Zunahme der gefärbten Target-DNA korreliert, kann man anhand der gemessenen Fluoreszenz auf die amplifizierte DNA-Menge schließen. Die bei der reversen Transkription entstandene cDNA wurde mit 20µl sterilen Wassers verdünnt, um in der RealTime-PCR eingesetzt zu werden. Es wurden jeweils 2µl für die Proben (2x), die Negativkontrollen und die Verdünnungsreihe eingesetzt. Diese wurden mit je 18µl des entsprechenden Mastermixes (Zusammensetzung siehe Tabelle 9) in 96-Well-Platten (optical clear, Applied Biosystems) pipettiert. Für die Wasserkontrolle wurden statt cDNA 2µl steriles Wasser eingesetzt. Für die Verdünnungsreihen wurde gepoolte cDNA verwendet, die nach der reversen Transkription mit 30µl sterilen Wassers

Tabelle 9: Zusammensetzung eines RealTime-PCR-Reaktionsansatzes

Die vorbereiteten 96-Well-Platten wurden anschließend mit Folie (optical clear, Applied Biosystems) verschlossen. Die Zielgene wurden mit dem ABI 7500 Fast Real-Time System (Version 1.5.1, Applied Biosystems) amplifiziert.

Beim qPCR-Programm wurde zuerst die Taq-Polymerase 10min bei 95°C aktiviert.

Anschließend folgten 40 Zyklen mit jeweils 15s mit 95°C und 1min mit 60°C. Bei 95°C fand die Denaturierung der cDNA statt und bei 60°C die Anlagerung der Primer, die Elongation der Zielsequenzen und die Fluoreszenzmessungen jeweils am Ende jedes Zyklus. Direkt im Anschluss an die qPCR wurde eine Schmelzkurvenanalyse durchgeführt, um die Spezifität der entstandenen Fragmente zu überprüfen. Die Temperatur wurde kontinuierlich von 60°C auf 95°C erhöht und dabei die Fluoreszenz gemessen. Die PCR-Fragmente denaturierten bei einer für sie spezifischen Temperatur in zwei Einzelstränge. Das SYBR Green wurde dabei freigesetzt und es folgte eine Fluoreszenzänderung.

Zur Überprüfung der richtigen Produktgröße wurden die entstandenen PCR-Fragmente mit Hilfe der Gelelektrophorese in einem 3,0%igen Agarose-Gel (Carl Roth) aufgetrennt und mit Hilfe von Ethidiumbromid (Carl Roth) sichtbar gemacht.

Tabelle 10 und Tabelle 11 zeigen die verwendeten Primersequenzen. Die Primer wurden mit dem Programm Primer Express 3.0 (Applied Biosystems) erstellt.

Gen Primersequenz (5´-3´) Produktgröße

Tabelle 10: Zusammenfassung der in der qPCR verwendeten Primer für die Gene im Schwein

Gen Primersequenz (5´-3´) Produktgröße

VASA F: TTT CCA AGA GAG GCG GTT ATC A

2.5.3.5 Auswertung der qPCR-Ergebnisse

Nach Beenden der Amplifikation wurden die Ergebnisse der qPCR mit der Software 7500 Fast System (Version 1.5.1, Applied Biosystems) ausgewertet.

Mit Hilfe der Verdünnungsreihen wurden für jedes Gen Standardkurven erstellt, um die Amplifikationsrate bei den unterschiedlich eingesetzten cDNA-Konzentrationen zu vergleichen. Den ct-Werten (cycle treshhold, Schwellenwert-Zyklus) der zu untersuchenden Proben wurden mit Hilfe der Standardkurven relative Werte zugeordnet. Die Effizienz der einzelnen Reaktionen konnte aus der Steigung der jeweiligen Standardkurve berechnet werden. Für weitere Berechnungen wurden die qPCR-Daten in Microsoft Excel übertragen (Version 15.12.3).

Für eine relative Quantifizierung wurden die Referenzgene GAPDH und EEF1A1 als interne Kontrollen verwendet. Für einen relativen Mengenvergleich wurde die Expression der Zielgene gegen die Expression der beiden Referenzgene normalisiert.

In diesem Fall wurden die Werte der Zielgene gegen den geometrischen Mittelwert von GAPDH und EEF1A1 normalisiert. Von den normalisierten Werten der Zielgene wurden anschließend die Mittelwerte und die Standardabweichungen berechnet und graphisch dargestellt.

2.6 Statistische Auswertung der Daten

Zuerst wurden alle Daten mit Hilfe von Microsoft Excel (Version 15.12.3) bearbeitet und ausgewertet. Die Werte der Vitalitätsmessungen wurden in prozentuale Werte umgerechnet. Die ermittelten Werte der Gesamtzellzahlbestimmungen, Vitalitätsmessungen und die qPCR-Daten wurden als Mittelwerte mit Standardabweichung dargestellt. Die statistische Auswertung der Ergebnisse erfolgte mit den Softwarepaketen JMP 11 und SAS 9.4 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA).

Den Messwerten der Vitalitätsbestimmung (Trypanblau-Färbung) wurde eine Binomialverteilung zugrunde gelegt, deswegen wurden diese mit der Prozedur Glimmix für gemischte Modelle mit einer Logit Link Funktion ausgewertet.

Bei den Messwerten der Gesamtzellzahlen wurde eine Normalverteilung der Daten angenommen und die Daten mit Hilfe von JMP als gemischtes Modell ausgewertet.

Die Unterschiede zwischen den Behandlungsgruppen wurden mit Hilfe des F-Tests miteinander verglichen.

Die PCR-Daten wurden mit Hilfe von JMP verteilungsfrei ausgewertet. Die Unterschiede zwischen den selektierten Fraktionen innerhalb eines Gens wurden mit Oneway-ANOVA und mit Hilfe des Wilcoxon-Rangsummentests getestet.

Als signifikant wurden bei allen Auswertungen Unterschiede bei einem Signifikanzniveau von 5% (P ≤ 0,05) bewertet.

III. Ergebnisse

Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit lassen sich in mehrere Teile gliedern. Zuerst wurden zwei Vereinzelungsmethoden für porzines und bovines Ovargewebe miteinander verglichen. Es wurden zwei Vereinzelungsmethoden und zwei verschiedene Kollagenasetypen getestet. Um die Effizienz der Methoden und der eingesetzten Enzyme vergleichen zu können, wurde im Anschluss die Vitalität der gewonnenen Zellen mit Hilfe der Trypanblau-Färbung bestimmt. Zusätzlich wurden die Vasa- und Fragilis-Antikörper zunächst auf ihre Funktionalität im Rind (Eizellen, Blastozysten) und anschließend in porzinen und bovinen ovariellen Einzelzellsuspensionen getestet. Dies wurde mittels Konfokalmikroskopie und Durchflusszytometrie beurteilt. Murine Zellen dienten hierbei als Positivkontrolle.

Anschließend folgte die Anreicherung porziner und boviner VASA- und FRAGILIS-positiver Zellen mittels Magnetic-activated cell sorting (MACS). Die angereicherten Zellen wurden zum einen unmittelbar nach der Anreicherung mittels RT-qPCR auf die Expression von Keimzellmarkern analysiert (Schwein, Rind). Zum anderen wurden die vier Zellfraktionen aller drei Spezies (Schwein, Rind, Maus als Positivkontrolle) in verschiedenen Zellkulturmedien in vitro kultiviert. Die in vitro kultivierten Zellen wurden im Hinblick auf ihre Morphologie und Proliferationsverhalten näher charakterisiert. Die sichtbaren Zellkolonien wurden dann zusätzlich auf die Expression von Vasa und Fragilis auf Proteinebene untersucht.

3.1 Vereinzelung des Ovargewebes

Um ovarielle Stammzellen aus der komplexen Zellpopulation des Ovars isolieren zu können, musste das Ovargewebe mittels mechanischer/enzymatischer Dissoziation vereinzelt werden, um eine Einzelzellsuspension herzustellen. Um möglichst viele lebende Zellen aus dem Gewebe zu gewinnen, wurden zur Dissoziation von porzinen und bovinen Ovarien zwei Vereinzelungsmethoden und zwei Kollagenasetypen getestet (siehe Abb. 9), um die optimalen Bedingungen zu bestimmen.

3.1.1 Prüfung von Vereinzelungsmethoden

Für die Gewebedissoziation von Schweine- und Rinderovarien, wurden zwei Vereinzelungsmethoden miteinander verglichen. Die modifizierte Methode nach HONARAMOOZ et al. (2002), die im Marienseer Labor für die Vereinzelung von Hodengewebe verwendet wird, und die modifizierte Methode nach WOODS und TILLY (2013), die für die Vereinzelung von murinen und humanen Ovarien verwendet wurde.

Nach der Gewebevereinzelung wurden die Gesamtzellzahl und die Vitalität der Proben bestimmt und miteinander verglichen.

Abbildung 13 ist zu entnehmen, dass die durchschnittlichen Gesamtzellzahlen beim Schwein nach der Methode nach WOODS und TILLY (2013) bei etwa 8,6 Millionen lagen und damit signifikant (P ≤ 0,05) höher waren, als nach der Methode von HONARAMOOZ et al. (2002) mit etwa 6,6 Millionen Zellen.

Abbildung 13: Durchschnittliche Gesamtzellzahlen der vereinzelten Proben nach den Methoden von HONARAMOOZ et al. (2002) und WOODS und TILLY (2013) beim Schwein, N=9, Anzahl der Wiederholungen: 3, (Mittelwert ± Standardabweichung;

a:b P ≤ 0,05)

modifiziert nach WOODS & TiILLY

(2013) modiffiziert nach HONARAMOOZ et al. (2002)

Gesamtzellzahl

Porzine ovarielle Zellen

a b

Die durchschnittliche Vitalität der Zellen nach der Vereinzelungsmethode von WOODS und TILLY (2013) lag bei etwa 96% und war damit signifikant (P ≤ 0,05) höher, als die Vitalität der Zellen nach der Methode von HONARAMOOZ et al. (2002), die bei etwa 90% lag (Abb. 14).

Abbildung 14: Durchschnittliche Vitalität der vereinzelten Proben nach den Methoden von HONARAMOOZ et al. (2002) und WOODS und TILLY (2013) beim Schwein, N=9, Anzahl der Wiederholungen: 3, (Mittelwert ± Standardabweichung; a:b P ≤ 0,05)

60 65 70 75 80 85 90 95 100

modifiziert nach WOODS & TILLY (2013) modifiziert nach HONARAMOOZ et al.

(2002)

Vitalität in %

Porzine ovarielle Zellen

a

b

Die Gesamtzellzahlen der nach der Gewebedissoziation gewonnenen Rinderzellen ist zwar bei der Methode nach HONARAMOOZ et al. (2002) höher als nach der Methode von WOODS und TILLY (2013); es bestand jedoch kein signifikanter Unterschied. Bei der Methode nach HONARAMOOZ et al. (2002) wurden im Durchschnitt etwa 7,5 Millionen Zellen und bei der Methode nach WOODS und TILLY (2013) im Durchschnitt etwa 5,5 Millionen Zellen gewonnen (Abb. 15).

Abbildung 15: Durchschnittliche Gesamtzellzahlen der vereinzelten Proben nach den Methoden von HONARAMOOZ et al. (2002) und WOODS und TILLY (2013) beim Rind, N=9, Anzahl der Wiederholungen: 3, (Mittelwert ± Standardabweichung)

0 2000000 4000000 6000000 8000000 10000000 12000000 14000000

modifiziert nach WOODS und TILLY

(2013) modifiziert nach HONARAMOOZ et al. (2002)

Gesamtzellzahl

Bovine ovarielle Zellen

Die Vitalität der bei der Gewebedissoziation gewonnenen Rinderzellen war bei der Methode nach WOODS und TILLY (2013) signifikant (P ≤ 0,05) höher als nach der Methode von HONARAMOOZ et al. (2002). Bei der Methode nach WOODS und TILLY (2013) lag die durchschnittliche Vitalität der Zellen bei etwa 94%. Bei der Methode nach HONARAMOOZ et al. (2002) lag die durchschnittliche Vitalität der Zellen bei etwa 48% (Abb.16).

Abbildung 16: Durchschnittliche Vitalität der vereinzelten Proben nach den Methoden von HONARAMOOZ et al. (2002) und WOODS und TILLY (2013) beim Rind, N=9, Anzahl der Wiederholungen: 3, (Mittelwert ± Standardabweichung; a:b P ≤ 0,05)

0 20 40 60 80 100 120

modifiziert nach WOODS und TILLY (2013)

modifiziert nach HONARAMOOZ et al.

(2002)

Vitalität in %

Bovine ovarielle Zellen

a

b

3.1.2 Prüfung von zwei Kollagenasetypen

Da sich die Methode von WOODS und TILLY (2013) als geeigneter herausstellte, sollte diese für weitere Versuche verwendet werden. Es wurden noch zwei verschiedene Kollagenasetypen getestet. Im Verdau von WOODS und TILLY (2013) wird Kollagenase Typ IV verwendet, im Marienseer Labor wird Kollagenase Typ II benutzt. Außerdem wurden die Kollagenasen in zwei verschiedenen Konzentrationen eingesetzt, da für die Vereinzelung von murinen und humanen Ovarien verschiedene Enzymkonzentrationen eingesetzt worden sind (WOODS und TILLY 2013). Diese beiden Kollagenasetypen sollten in ihrer Wirksamkeit miteinander verglichen werden.

Nach dem Verdau wurden die Gesamtzellzahl und Vitalität der gewonnenen Zellen bestimmt und verglichen.

Bei der Vereinzelung von porzinen Ovarien mit den verschiedenen Kollagenasen konnten keine Unterschiede in den Gesamtzellzahlen nachgewiesen werden. Weder Kollagenasetyp, noch die Enzymkonzentration hatten einen signifikanten Einfluss auf die Anzahl der gewonnenen Zellen (Abb. 17).

Abbildung 17: Durchschnittliche Gesamtzellzahlen nach Vereinzelung mit verschiedenen Kollagenasetypen und verschiedenen Kollagenasekonzentrationen beim Schwein, N=9, Anzahl der Wiederholungen: 3, (Mittelwert ± Standardabweichung)

0 2000000 4000000 6000000 8000000 10000000 12000000

Koll II 400U Koll II 800U Koll IV 400U Koll IV 800U

Gesamtzellzahl

Kollagenasetest bei porzinen Zellen

Abbildung 18 zeigt, dass, weder der Kollagenasetyp, noch die Enzymkonzentration, sich auf die Vitalität der gewonnenen porzinen Ovarzellen auswirkten. Die durchschnittliche Vitalität lag bei allen vier Behandlungsgruppen zwischen 94% und 96%.

Abbildung 18: Durchschnittliche Vitalität der Proben nach Vereinzelung mit verschiedenen Kollagenasen und verschiedenen Kollagenasekonzentrationen beim Schwein, N=9, Anzahl der Wiederholungen: 3, (Mittelwert ± Standardabweichung)

60 65 70 75 80 85 90 95 100

Koll II 400U Koll II 800U Koll IV 400U Koll IV 800U

Vitalität in %

Kollagenasetest bei porzinen Zellen

Bei den Gesamtzellzahlen der gewonnenen Rinderzellen zeigten sich keine Unterschiede zwischen den verschiedenen Kollagenasetypen gleicher Konzentration.

Bei den Enzymkonzentrationen kann man sehen, dass bei Kollagenase Typ IV, die Gesamtzellzahlen bei 800U/ml signifikant (P ≤ 0,05) höher waren, als bei 400U/ml (Abb. 19). Bei Kollagenase Typ II war die Zahl der gewonnenen Zellen bei 800U/ml ebenfalls höher als bei 400U/ml. Dieser Unterschied konnte aber nicht statistisch abgesichert werden.

Abbildung 19: Durchschnittliche Gesamtzellzahlen nach Vereinzelung mit verschiedenen Kollagenasetypen und verschiedenen Kollagenasekonzentrationen beim Rind, N=9, Anzahl der Wiederholungen: 3, (Mittelwert ± Standardabweichung;

a:b P ≤ 0,05)

0 500000 1000000 1500000 2000000 2500000 3000000

Koll II 400U Koll II 800U Koll IV 400U Koll IV 800U

Gesamtzellzahl

Kollagenasetest bei bovinen Zellen

bc

ab

c

a

An Abbildung 20 kann man erkennen, dass, genauso wie beim Schwein, weder Kollagenasetyp, noch Enzymkonzentration, die Vitalität der verdauten Rinderzellen beeinflussten. Bei allen vier Behandlungsgruppen war die Vitalität der Zellen etwa gleich hoch und lag etwa zwischen 89% und 92%.

Abbildung 20: Durchschnittliche Vitalität der Proben nach Vereinzelung mit verschiedenen Kollagenasen und verschiedenen Kollagenasekonzentrationen beim Rind, N=9, Anzahl der Wiederholungen: 3, (Mittelwert ± Standardabweichung)

Da der Kollagenasetyp bei beiden Spezies keine Auswirkungen auf die Vitalität der gewonnenen Zellen zeigte und bei einer Enzymkonzentration von 800U/ml tendenziell mehr Zellen gewonnen werden konnten, wurde in weiteren Versuchen die Kollagenase Typ II in einer Konzentration von 800U/ml eingesetzt, da dieses Enzym auch für weitere Versuche im Marienseer Labor eingesetzt wird.

60 65 70 75 80 85 90 95 100

Koll II 400U Koll II 800U Koll IV 400U Koll IV 800U

Vitalität in %

Kollagenasetest bei bovinen Zellen

3.2 Analyse der VASA- und FRAGILIS-Proteinexpression in ovariellen Suspensionen von Schwein und Rind

Nach der Optimierung der enzymatischen Vereinzelung von ovariellem Gewebe von Schwein und Rind, wurde die Proteinexpression von VASA und FRAGILIS in ovariellen Einzelzellsuspensionen von Schwein und Rind analysiert. Ovarielle Zellen der Maus dienten hierbei als Positivkontrolle. Ovarielle Einzelzellsuspensionen wurden mittels Immunfluoreszenzfärbung auf die Proteinexpression von VASA und FRAGILIS analysiert. Die Ergebnisse wurden mittels Konfokalmikroskopie und Durchflusszytometrie beurteilt (Abb. 21). Als Negativkontrollen wurden der Isotyp, Proben mit dem Sekundärantikörper und Zellen ohne Färbung verwendet.

Abbildung 21: Schematische Darstellung zur Analyse der Vasa- und Fragilis-Proteinexpression mittels Konfokalmikroskopie und Durchflusszytometrie

Ovar

Verdau

Schwein, Rind Maus (Positivkontrolle)

Immunfluoreszenzfärbung Vasa/

Fragilis Konfokalmikroskopie

Durchflusszytometrie

3.2.1 Analyse der VASA- und FRAGILIS-Proteinexpression mittels Konfokal-mikroskopie

Es ist bekannt, dass die Antikörper gegen Vasa (ab13840) und Fragilis (ab109429) in Maus und Schwein funktionieren (BUI et al. 2014, WHITE et al. 2012). Da es nicht bekannt war, ob diese Antikörper auch im Rind funktionieren, wurden diese zuerst an bovinen Eizellen (ab13840) bzw. bovinen Blastozysten (ab109429) getestet.

Da VASA im Zytoplasma von Eizellen exprimiert wird, wurden diese als Positivkontrolle für den Test des ab13840-Antikörpers verwendet.

Abbildung 22 zeigt ein im Zytoplasma der Eizelle lokalisiertes Signal des VASA-Antikörpers.

Abbildung 22: VASA-Expression in bovinen Eizellen, Ansicht jeweils im Hellfeld-, VASA- und Hellfeld/VASA-Kanal, der Maßstab entspricht 20µm, Anzahl der untersuchten Eizellen: 22

Hellfeld + VASA

Hellfeld VASA

Der Antikörper gegen Fragilis (ab109429) wurde in bovinen Blastozysten getestet.

Abbildung 23 zeigt ein im Zytoplasma bzw. auf der Oberfläche der Zellen (ICM) lokalisiertes Signal.

Abbildung 23: FRAGILIS-Expression in bovinen Blastozysten, Ansicht jeweils im Hellfeld-, FRAGILIS- und SiR-DNA-Kanal, der Maßstab entspricht 20µm, Anzahl der untersuchten Blastozysten: 6

Um zu untersuchen, ob VASA oder FRAGILIS überhaupt in Zellen des Ovars exprimiert werden, wurden die Antikörper ab13840 (VASA) und ab109429 (FRAGILIS) an ovariellen Zellsuspensionen von Schwein und Rind getestet und mittels Konfokalmikroskopie analysiert. Ovarielle Zellen der Maus wurden als Positivkontrolle verwendet.

SiR-DNA

Hellfeld FRAGILIS

Bei allen drei Spezies kann man sehen, dass nur wenige vereinzelte Zellen Vasa auf der Oberfläche exprimieren. Die Vasa-positiven Zellen sind mit Pfeilen markiert (Abb.

24)

Maus Schwein Rind

Abbildung 24: Vasa-Antikörpertest an ovariellen Einzelzellsuspensionen von Maus, Schwein und Rind, Ansicht jeweils im Hellfeld-, Vasa- oder SiR-DNA-Kanal, Anzahl der Wiederholungen: 3

SiRHoechst

Bright Field

VASA VASA

SiRHoechst SiRHoechst

Bright Field Bright Field

Vasa

Auch bei der Fragilis-Färbung kann man bei allen drei Spezies sehen, dass wenige einzelne Zellen Fragilis-positiv sind. Die Fragilis-positiven Zellen sind durch Pfeile markiert (Abb. 25).

Maus Schwein Rind

Abbildung 25: Fragilis-Antikörpertest an ovariellen Einzelzellsuspensionen von Maus, Schwein und Rind, Ansicht jeweils im Hellfeld-, Fragilis- oder SiR-DNA-Kanal, Anzahl der Wiederholungen: 3

SiRHoechst

Bright Field

FRAGILIS FRAGILIS

SiRHoechst SiRHoechst

Bright Field Bright Field

Fragilis

3.2.2 Analyse der VASA- und FRAGILIS-Proteinexpression mittels Durchfluss-zytometrie

Nach der Analyse der Antikörpertests in ovariellen Gesamteinzelzellsuspensionen mittels Konfokalmikroskopie, wurde der Anteil der Vasa- bzw. Fragilis-positiven Zellen durchflusszytometrisch bestätigt. Dabei wurden die Einzelzellsuspensionen von Schwein und Rind untersucht, wobei ovarielle Zellen der Maus als Positivkontrolle verwendet wurden.

Um die Vasa- bzw. Fragilis-positiven Zellen detektieren zu können, wurden die Proben mit einem Laser der Wellenlänge 561nm angeregt. Zum Einstellen der Gates wurden Isotypkontrollen und Zellsuspensionen, die entweder nur mit dem Sekundärantikörper gefärbt wurden oder keine Färbung aufwiesen, verwendet.

Beim Schwein konnten mit der durchflusszytometrischen Analyse des VASA-Proteins 2,8% positive und beim Rind 3,1% positive Zellen in den Einzelzellsuspensionen detektiert werden (Abb. 26). Als Vergleich, konnten in den murinen Einzelzellsuspensionen nur 1,5% Vasa-positive Zellen nachgewiesen werden, was dem Literaturwert entspricht (WHITE et al. 2012).

Maus Schwein Rind

Abbildung 26: Dotplot aller detektierten Zellen in ovariellen Einzelzellsuspensionen von Maus, Schwein und Rind, Vasa-positive Zellen sind durch Gates eingegrenzt, Anzahl der Wiederholungen: Maus n=5, Schwein n=13, Rind n=6

Vasa (1,5%) VASA (2,8%) VASA (3,1%)

AlexaFluor555 AlexaFluor555 AlexaFluor555

Hoechst

Im Vergleich zum Anteil VASA-positiver Zellen, konnten bei Schwein und Rind etwa halb so viele FRAGILIS-positive Zellen nachgewiesen werden. In den porzinen Einzelzellsuspensionen konnten lediglich 1,4% und in den bovinen nur 1,5%

FRAGILIS-positive Zellen in den ovariellen Einzelzellsuspensionen detektiert werden (Abb. 27). In den murinen ovariellen Zellen konnten 1,7% Fragilis-positive Zellen detektiert werden. Dieser Wert stimmt auch in etwa mit dem Anteil Vasa-positiver Zellen (1,5%) überein.

Maus Schwein Rind

Abbildung 27: Dotplot aller detektierten Zellen in ovariellen Einzelzellsuspensionen von Maus, Schwein und Rind (Fragilis-positive Zellen sind durch Gates eingegrenzt), Anzahl der Wiederholungen: Maus n=4, Schwein n=13, Rind n=7 (Fra/FRA: Fragilis)

Hoechst

AlexaFluor555 AlexaFluor555 AlexaFluor555

Fra (1,7%) FRA (1,4%) FRA (1,5%)

3.3 Anreicherung und Charakterisierung der angereicherten ovariellen Zellen von Schwein und Rind

Nach dem enzymatischen Verdau wurden die gewonnenen ovariellen Zellen von Schwein und Rind mittels MACS mit VASA und FRAGILIS als Selektionsmarker angereichert. Die gewonnenen Zellfraktionen wurden auf die Expression von Keimzellmarkern mittels RT-qPCR untersucht.

3.3.1 Anreicherung ovarieller Stammzellen von Schwein und Rind mittels Magnetic-activated cell sorting (MACS)

Bei der In-vitro-Kultivierung von ovariellen Stammzellen ohne Anreicherung besteht das Problem des Überwachsens der Zellkulturplatten durch somatische Zellen. Durch Anreicherung sollte ein höherer Anteil an Stammzellen in der Zellsuspension erreicht werden, um dem Problem des Überwachsens entgegenzuwirken. In der vorliegenden Arbeit wurde das Verfahren des Magnetic-activated cell sortings, das erfolgreich bei der Spezies Maus angewendet wurde (ZOU et al. 2009, ZOU et al. 2011), zur Anreicherung von ovariellen Stammzellen von Schwein und Rind untersucht. Ovarielle Zellen der Maus dienten als Positivkontrolle. Vasa- und Fragilis-positive Zellen wurden aus ovariellen Gesamtzellsuspensionen mit Hilfe von magnetischen Beads separiert.

Die Proben wurden in die im Magnetseparator befestigten Säulen geladen. Zellen, die mit magnetischen Beads markiert waren, wurden durch die magnetischen Kräfte in der Säule festgehalten. Nicht markierte Zellen konnten durch die Säule durchfließen und im 15ml-Röhrchen aufgefangen werden. Nach der Anreicherung erhielt man jeweils zwei Zellfraktionen; sowohl Vasa-positive und Vasa-negative, als auch Fragilis-positive und Fragilis-negative Zellfraktionen.

Diese Zellfraktionen wurden zum einen unmittelbar nach der Sortierung eingefroren und mittels RT-qPCR auf die Expression von Keimzellmarkern untersucht; und zum anderen in verschiedenen Zellkulturmedien in vitro kultiviert.

Bei einer Probe von 10 Millionen Zellen, wurden ca. 50.000 Zellen als Vasa-positiv selektiert. Der Anteil der Fragilis-positiven Zellen belief sich auf etwa 30.000 Zellen.

Abbildung 28 zeigt den Magnetständer und die magnetischen Säulen, über die die Zellen angereichert wurden.

Abbildung 28: MACS-Separator mit den darin befestigten magnetischen Säulen zur Anreicherung ovarieller Stammzellen

Ovarielle Zellsuspension

mit Fragilis-AK Magnetständer

(MACS-Separator)

Magnetische Säulen mit den aufgeladenen Proben

Fragilis-negative Zellfraktion Vasa-negative

Zellfraktion Ovarielle Zellsuspension

mit Vasa-AK

3.3.2 Charakterisierung der selektierten Zellfraktionen von Schwein und Rind mittels RT-qPCR

Die durch MACS angereicherten Zellfraktionen wurden mittels RT-qPCR auf die Expression von Keimzellmarkern untersucht. Es wurde die Expression der Keimzellmarker VASA, PRDM1 und FRAGILIS analysiert. ZP3 ist ein Eizellmarker und diente als Kontrolle für eine Kontamination mit Eizellen. GAPDH und EEF1A1 sind Haushaltsgene, gegen die die Werte der Proben normalisiert wurden.

Genexpressionanalysen mittels RT-qPCR wurden in beiden Zellfraktionen von Schwein und Rind durchgeführt. Die Daten für die Maus sind in der aktuellen Literatur publiziert. Die selektierten Mauszellen wurden nur für weitere Zellkulturversuche eingesetzt, da nicht genug Material zur Verfügung stand.

3.3.2.1 Expression von Keimzellmarkern in selektierten Zellfraktionen vom Schwein

Um die Funktionalität der erstellten Primer zu untersuchen, wurden diese zuerst an Eizellen, sowie an ovariellen Zellen getestet. Schließlich wurden ovarielle Zellen als Positivkontrolle verwendet.

Abbildung 29 zeigt die amplifizierten Fragmente beim Primertest an ovariellen Zellen.

Alle Fragmente haben die richtige Größe. Die Spezifität der erzeugten Produkte wurde im Anschluss der PCR durch eine Schmelzkurvenanalyse nachgewiesen.

Abbildung 29: Primertest für die Gene VASA, PRDM1, FRAGILIS, ZP3, GAPDH und EEF1A1 an porzinen ovariellen Zellen (Abkürzungen: FRA=FRAGILIS)

200 150 100 75 50 25

VASA PRDM1 FRA GAPDH ZP3 EEF1A1

Schwein

bp

76

130

82 89

70 69

Die VASA-Expression war in der VASA-positiven Zellfraktion etwa fünfmal und somit signifikant (P ≤ 0,05) höher als in der VASA-negativen Zellfraktion. Die Expression von PRDM1 und FRAGILIS war in den VASA-positiven Zellfraktionen ebenfalls höher, konnte aber nur bei PRDM1 statistisch bestätigt werden (P ≤ 0,05). Die Expression von ZP3 war in beiden Zellfraktionen, der VASA-positiven und VASA-negativen, sehr niedrig (Abb. 30).

Abbildung 30: Relative Genexpression von VASA, PRDM1, FRAGILIS und ZP3 in VASA-positiven und VASA-negativen ovariellen Zellen beim Schwein, N=3, Anzahl der

Abbildung 30: Relative Genexpression von VASA, PRDM1, FRAGILIS und ZP3 in VASA-positiven und VASA-negativen ovariellen Zellen beim Schwein, N=3, Anzahl der

Im Dokument Isolierung, In-vitro-Kultivierung und Charakterisierung von porzinen und bovinen ovariellen Stammzellen (Seite 63-0)