Bestimmung der Gesamtzellzahl und Vitalität mit Trypanblau

Bei den verschiedenen Vereinzelungsmethoden wurde unmittelbar danach die Vitalität

Trypanblau (Sigma-Aldrich) wird in der Mikrobiologie und in der Zellkultur verwendet, um die Vitalität von Zellen zu bestimmen. Dieser Farbstoff wird von abgestorbenen und perforierten Zellen aufgenommen, die dann dunkelblau erscheinen. Lebende Zellen mit einer intakten Zellmembran nehmen den Farbstoff hingegen nicht auf. Aus dem Verhältnis von blau angefärbten und nicht gefärbten Zellen lässt sich der prozentuale Anteil lebender Zellen berechnen.

Die Färbung mit Trypanblau erfolgte sofort nach dem enzymatischen Vereinzeln des Ovargewebes. Zuerst wurde von jeder Einzelzellsuspension die Gesamtzellzahl mit Hilfe einer Neubauer-Zählkammer bestimmt. Dafür wurden vier Großquadrate ausgezählt und die Gesamtzellzahl folgendermaßen bestimmt:

Zur Bestimmung der Vitalität wurden jeder Einzelzellsuspension 2x10⁶ Zellen entnommen, zentrifugiert (188g, 4min) und in 1ml PBS aufgenommen. Dieser Suspension wurden dann 20µl entnommen und in einem 0,6ml Cup mit 20µl Trypanblau gemischt. Nach Inkubation (5min, RT) wurden die blauen und nicht blauen Zellen mit Hilfe einer Neubauer-Zählkammer gezählt und der Anteil der lebenden Zellen folgendermaßen bestimmt:

Gesamtzellzahl = Zellzahl (∅ der vier Großquadrate) x 10.000 (konstanter Kammerfaktor) x Verdünnungsfaktor

!"#$%"#ät % = +,-$ℎ% /01 ,"2ℎ# 304ä15#0, 60%%0, ( ∅ /01 9"01 :1;ß=>$/1$#0?

:0@$A#-0%%-$ℎ% (5%$>0 >,/ ,"2ℎ# 5%$>0 60%%0, /01 9"01 :1;ß=>$/1$#0? B 100

2.4 Anreicherung ovarieller Stammzellen mittel Magnetic-activated cell sorting (MACS)

Das Magnetic-activated cell sorting (MACS) ist eine Methode zur Selektierung von bestimmten Zelltypen. Diese Methode dient der Anreicherung von bestimmten Zellen aus Zellsuspensionen und macht sich dabei die Expression bestimmter Oberflächenstrukturen zunutze (Abb. 10). Bei dieser Methode wurde die MACS-Technologie von Miltenyi Biotec verwendet, bei der superparamagnetische Beads und Säulen zur Anreicherung von Zellen verwendet werden. Die Beads sind etwa 50nm groß und dienen dazu, die Zielzellen in der Säule festzuhalten.

In den Versuchen dieser Arbeit sollten Vasa-positive bzw. Fragilis-positive Zellen aus ovariellen Zellsuspensionen isoliert und angereichert werden. Dazu wurden die Einzelzellsuspensionen zuerst 20min auf Eis mit einer Blocking-Lösung (PBS mit 5%

Ziegenserum und 2% BSA) inkubiert, um unspezifische Bindungen der Antikörper zu verhindern. Nach dem Blocken wurden die Proben 20min auf Eis mit den Primärantikörpern gegen Vasa oder Fragilis (siehe Tabelle 6) inkubiert. Nach Inkubation mit dem Primärantikörper wurden die Proben 2x mit Waschpuffer (PBS mit 0,5% Ziegenserum (Sigma-Aldrich)) gewaschen und 4min bei 300g zentrifugiert.

Anschließend folgte die Inkubation mit Goat Anti-rabbit IgG Beads (Miltenyi Biotec, 15min, 8°C). Danach wurden die Proben nochmals mit Waschpuffer gewaschen, 10min bei 300g zentrifugiert und in 500µl MACS-Puffer (PBS mit 0,5% BSA und 20mM EDTA) resuspendiert. Vor der Sortierung wurden die Säulen im Magnetständer befestigt und mit jeweils 500µl MACS-Puffer äquilibriert. Danach wurden die Proben auf die Säulen aufgetragen und der Durchfluss (negative Zellfraktion) in 15ml Falcon-Röhrchen aufgefangen. Die Säulen wurden dann 3x mit jeweils 500µl MACS-Puffer gespült und der Durchfluss wurde ebenfalls in 15ml Falcon-Röhrchen aufgefangen.

Dann wurden die Säulen aus dem Magnetständer genommen und in 15ml Falcon-Röhrchen gesetzt. Die sich in der Säule befindenden Zellen wurden mit 1ml MACS-Puffer und einem Stempel herausgespült. Da es sich bei den markierten Zellen um die Zielzellen handelt, beruht die Anreicherung in diesem Fall auf dem Prinzip der

wurden 4min bei 300g zentrifugiert. Die Zellen wurden entweder für PCR-Analysen auf Trockeneis eingefroren oder für In-Vitro-Kultivierungsversuche in verschiedenen Zellkulturmedien ausgesät. Der Ablauf ist schematisch in Abbildung 10 dargestellt.

Abbildung 10: Schematische Darstellung der Anreicherung von markierten Zellen mit Hilfe des MACS-Verfahrens

2.5 In-Vitro-Kultivierung ovarieller Stammzellen

2.5.1 Beschichtung von Zellkulturplatten

Alle Zellkulturplatten, die für die In-Vitro-Kultur eingesetzt wurden, sind vorher mit Gelatine (Gelatin from bovine skin, Sigma-Aldrich) beschichtet worden. Diese Gelatineschicht diente der besseren Adhäsion der Feeder-Zellen (MEFs, murine embryonale Fibroblasten), auf denen die ovariellen Zellen kultiviert wurden. Aus Gelatinepulver und destilliertem Wasser wurde eine 1%ige Lösung hergestellt und anschließend autoklaviert. Mit einer weiteren Verdünnung mit PBS wurde eine 0,2%ige Gebrauchslösung hergestellt und steril filtriert. Die 0,2%ige Lösung wurde auf die Kulturplatten gegeben (Tab. 5) und gleichmäßig verteilt. Anschließend wurden die Platten 10min bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wurde der Überstand von den Platten abgesaugt und die Platten unter der Lamina offen getrocknet. Die trockenen Platten wurden direkt im Anschluss für Zellkulturversuche verwendet.

Platte Gelatinemenge (pro Well)

6 Well 500µl

12 Well 250µl

24 Well 125µl

Tabelle 5: Verwendete Gelatinemenge zur Beschichtung von Zellkulturplatten

2.5.2 Vorbereiten von Feeder-Zellen

Für die Kultivierung von ovariellen Zellen wurden murine inaktivierte Fibroblasten verwendet, die aus Maus-Feten Tag 13,5 isoliert wurden. Diese Zellen wurden im T3-Medium kultiviert und spätestens bei Passage 3 inaktiviert.

Für die Inaktivierung wurden die Zellen in T150-Flaschen kultiviert, bis zum Erreichen einer ca. 90%igen Konfluenz. Zum Inaktivieren wurde direkt zum T3-Medium die entsprechende Menge an Mitomycin C (Sigma-Aldrich) dazugegeben, sodass die Endkonzentration 10µg/ml betrug. Die Flaschen wurden anschließend 2h im Brutschrank (37°C, 5% CO2) inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen 3x mit jeweils 20ml PBS gewaschen. Danach wurden die Zellen direkt mit EDTA/Trypsin (GE Healthcare) abgelöst und die Wirkung von EDTA/Trypsin mit T3-Medium abgestoppt.

Nach einem Zentrifugationsschritt (188g, 4min) wurden die Zellen im Einfriermedium resuspendiert und bei -80°C eingefroren.

2.5.3 Medien für die In-vitro-Kultivierung

Nach dem enzymatischen Verdau und dem Magnetic-activated cell sorting der ovariellen Zellen, wurden die positiven und negativen Zellfraktionen in verschiedenen Zellkulturmedien auf MEFs kultiviert. Die selektierten Zellen aller drei Spezies wurden im MEM-α +WF (Wachstumsfaktoren) als Standard-Medium kultiviert. Die genaue Zusammensetzung der verschiedenen Zellkulturmedien ist im Anhang zu finden.

Abbildung 11 zeigt schematisch den Aufbau der In-vitro-Kultivierungsversuche.

Abbildung 11: Schematische Darstellung des Ablaufs der In-vitro-Kultur-Versuche (Abkürzungen: WF= Wachstumsfaktoren), Schwein n=13, Rind n=13, Maus n=4 Murine Zellen, die als Positivkontrolle dienten, wurden in MEM-α +WF (Wachstumsfaktoren) bei 37°C und 5% CO2 kultiviert. Dieses Medium wurde bereits erfolgreich in In-vitro-Kultivierungsversuchen von murinen ovariellen Stammzellen eingesetzt (WHITE et al. 2012). Deswegen wurde das MEM-α +WF in den Versuchen dieser Arbeit als Standardmedium für Schwein und Rind verwendet.

Die porzinen Zellen wurden zusätzlich zum MEM-α +WF auch in DMEM +WF kultiviert.

Sowohl MEM-α als auch DMEM wurden in bereits publizierten Versuchen zur Kultur ovarieller Stammzellen verwendet (BAI et al. 2013, BUI et al. 2014).

Die bovinen Zellen wurden zusätzlich in konditioniertem MEM-α +WF kultiviert, um die Nische der Stammzellen im Ovar so gut wie möglich nachahmen zu können.

eingesetzt. Dieses Medium wurde bereits erfolgreich für die In-vitro-Kultur von embryonalen Stammzellen vom Rind verwendet (BOGLIOTTI et al. 2017). Porzine und bovine Zellen wurden gleichermaßen bei 38,5°C und 5% CO2 kultiviert.

2.6 Charakterisierung der ovariellen Zellen 2.6.1 Immunfluoreszenzfärbung

Der Proteinnachweis von Vasa und Fragilis basiert auf einer immunhistochemischen Färbemethode. Der Nachweis beruht auf der Affinität

von Antikörpern zu einer bestimmten Gewebeeigenschaft als Antigen-Antikörper-Reaktion.

Die Vasa- bzw. Fragilis-Färbung ist eine indirekte Nachweismethode (Abb. 12). Im ersten Schritt wird ein spezifischer Primärantikörper verwendet, der auf die Zellen aufgebracht wird. Der Sekundärantikörper, der im zweiten Schritt aufgetragen wird, richtet sich gegen den ersten Antikörper. Der Sekundärantikörper ist mit einem Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt. Diese Reaktion wird unter dem Fluoreszenzmikroskop sichtbar.

2.6.1.1 Antikörpertest in Eizellen und Blastozysten

Da es keine Vasa- bzw. Fragilis-Antikörper gibt, die spezifisch für die Spezies Rind sind, wurden in dieser Arbeit Antikörper ausgewählt, die bei anderen Spezies bereits erfolgreich eingesetzt worden sind. Diese wurden dann an Rindereizellen bzw.

Abbildung 12: Indirekter Nach-weis durch Primär- und

Rinderblastozysten auf ihre Funktionalität im Rind überprüft. Erst danach wurden die Antikörper in ovariellen Zellsuspensionen weitergetestet. Als Negativkontrollen wurden die Isotypkontrolle und nur der Sekundärantikörper verwendet, um unspezifische Bindungen der Primär- und Sekundärantikörper auszuschließen. Außerdem wurden ungefärbte Eizellen/Blastozysten ebenfalls analysiert, um eine Autofluoreszenz auszuschließen.

Die Eigenschaften der Primärantikörper sind in Tabelle 6 und die der Isotypen und Sekundärantikörper in Tabelle 7 kurz zusammengefasst.

Antikörper Vasa

Tabelle 6: Übersicht zu den verwendeten Primärantikörpern

Antikörper Hersteller

Tabelle 7: Übersicht zu den verwendeten Isotypen und Sekundärantikörpern. Die Konzentration des Isotypen wurde den Konzentrationen der entsprechenden Primärantikörper angepasst.

Die Eizellen und Blastozysten wurden für diese Arbeit zur Verfügung gestellt. Es handelte sich um gereifte Eizellen bzw. Blastozysten Tag 7-8, die im Marienseer Labor für IVF-Versuche beim Rind verwendet wurden.

Die Eizellen/Blastozysten wurden aus dem TCM199-Medium (Sigma-Aldrich) bzw.

SOFaa (Synthetic Oviductal Fluid) -Kulturmedium herausgenommen und zügig 3x in 150µl großen Tropfen von Waschpuffer I (PBS + 0,5% FCS (Life Technologies)) gewaschen und danach 15 min in 4%igem Formaldehyd (Carl Roth) fixiert. Nach der Fixierung wurden die Eizellen/Blastozysten entweder in Waschpuffer I bei 4°C gelagert oder sofort für die Färbung eingesetzt und 3x15 min im Waschpuffer II (0,02M PBS + 0,5% Pferdeserum (Sigma-Aldrich)) gewaschen und anschließend 1h bei RT in 0,02M PBS + 0,2% TritonX 100 (Merck) permeabilisiert. Danach wurden die Eizellen/Blastozysten erneut 3x15 min im Waschpuffer II gewaschen und anschließend geblockt. Zum Blocken wurden die Eizellen/Blastozysten für 1h bei RT in 0,02M PBS + 0,2% TritonX 100 (Merck) + 5% Serum überführt. Nach dem Blocking erfolgte die Färbung mit dem primären Antikörper über Nacht bei 4°C. Am nächsten Tag wurden die Eizellen/Blastozysten zuerst 3x15 min in Waschpuffer II gewaschen

und dann 2h bei RT mit dem sekundären Antikörper inkubiert (im Dunkeln). Nach wiederholtem Waschen im Waschpuffer II (3x15 min) erfolgte die Kernfärbung mit dem SiR-DNA Kit (Spirochrome) für 30 min bei RT. Die Eizellen/Blastozysten wurden nach der Färbung auf vorher vorbereitete Objektträger übertragen. Die Eizellen/Blastozysten wurden in 4,8µl in die Mitte von 2 aufeinander geklebten Verstärkungsringen pipettiert, mit einem Deckgläschen bedeckt, mit Nagellack versiegelt und im Dunkeln bei 4°C in einer Objektträgermappe aufbewahrt. Die Aufnahmen am Konfokalmikroskop LSM 510 (ZEISS) erfolgten in den darauffolgenden 2 bis 3 Stunden.

2.6.1.2 Antikörpertest in ovariellen Einzelzellsuspensionen

Die Antikörper gegen Vasa und Fragilis wurden nach der enzymatischen Vereinzelung des Ovargewebes in den entstandenen Zellsuspensionen getestet. Die Zellen wurden nach der Dissoziation sofort auf Eis gelagert.

Zuerst wurden die Zellen 20min mit einer Blocking-Lösung (PBS + 5%Pferdeserum + 2%BSA (AppliChem)) behandelt, um unspezifische Bindungen der Antikörper zu vermeiden. Nach dem Blocking wurden die Zellen 4min bei 300g zentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt und das Pellet 20min mit dem Primärantikörper (siehe Tabelle 6) inkubiert. Anschließend wurden die Proben zweimal mit PBS + 0,5%

Pferdeserum gewaschen und danach 20min mit dem Sekundärantikörper (siehe Tabelle 7) inkubiert. Danach wurden die Proben wieder zweimal gewaschen und mit einem Kernfarbstoff inkubiert. Je nach weiterer Verwendung der Zellen wurde für 3min mit Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich) (für Duchflusszytometrie) oder für 25min mit SiR-DNA (Spirochrome) (für Konfokalmikroskopie) inkubiert. Nach der Kernfärbung wurden die Zellen entweder am Konfokalmikroskop (LSM 510, ZEISS) oder am Durchflusszytometer (MACS Quant VYB, Miltenyi Biotec) analysiert.

2.6.1.3 Immunfluoreszenzfärbung von in vitro kultivierten ovariellen Zellen Für die Immunfluoreszenzfärbungen wurden die Zellen in 24-Well-Platten kultiviert. Als Positivkontrolle dienten HeLa-Zellen (humane Karzinom-Zelllinie). Zuerst wurden die Zellen 3x mit Waschpuffer I (PBS + 0,5% FCS) gewaschen und anschließend 15 min in 4%igem Formaldehyd fixiert. Danach wurden die Zellen 3x5 min im Waschpuffer II (0,02M PBS + 0,5% Pferdeserum) gewaschen. Anschließend wurden die Zellen 1h bei RT in 0,02M PBS + 5% Pferdeserum und 2% BSA geblockt und die Zellen danach über Nacht bei 4°C in der Lösung mit dem ersten Antikörper inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Zellen nach dreimaligem Waschen im Waschpuffer II 1h bei RT und im Dunkeln in der Lösung mit dem zweiten Antikörper inkubiert. Nach wiederholtem dreimaligem Waschen im Waschpuffer II erfolgte die Kernfärbung mit Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich) (1:2000) für 3 min bei RT. Als letztes wurden die Zellen wieder 3x im Waschpuffer II gewaschen, in 500µl Waschpuffer II aufgenommen und sofort unter dem Fluoreszenzmikroskop DM IL LED (LEICA) beurteilt.

2.6.2 Durchflusszytometrische Analyse der ovariellen Zellen

Nach der Immunfluoreszenzfärbung wurden die ovariellen Zellsuspensionen von Maus, Schwein und Rind mit dem Durchflusszytometer untersucht, um den Anteil der positiv gefärbten Zellen zu bestimmen. Die Durchflusszytometrie ist ein Messverfahren, dass eine schnelle Analyse von Zellen erlaubt, die einzeln einen Laserstrahl passieren. Dabei wird die Fluoreszenz jeder einzelnen Zelle gemessen und ausgewertet. Die Messungen wurden mit dem MACS Quant VYB (Miltenyi Biotec) gemacht. Die Analysen mit dem Sekundärantikörper, mit dem Isotypen und ohne Färbung wurden als Negativkontrollen für die Einstellungen am Gerät benutzt und die gemessenen Werte wurden von den Werten der Proben abgezogen. Mit Hilfe des Forward Scatters wurde die zu untersuchende Region auf nur vereinzelte Zellen eingestellt, damit die Anteile der positiven und negativen Zellen nicht durch Dupletten verfälscht werden. Im Anschluss wurde mit dem Forward und Side Scatter die

gewünschte Zellpopulation eingegrenzt, tote Zellen und Zellreste wurden ausgeschlossen. Mit Hilfe des Kernfarbstoffs Hoechst 33342 wurden zusätzlich nochmals vitale Zellen mit intakter Zellmembran eingegrenzt und der Anteil an positiv gefärbten Zellen bestimmt.

2.6.3 Genexpressionsanalyse mittels RT-qPCR

Die mittels MACS angereicherten porzinen und bovinen Zellfraktionen wurden mittels RT-qPCR analysiert. Es wurde die Expression der Keimzellmarker VASA (DDX4, DEAD Box Polypeptid 4), FRAGILIS (IFITM3, Interferon-induced transmembrane protein 3), PRDM1 (PR domain zinc finger protein 1) und ZP3 (Zona pellucida sperm-binding preotein 3) untersucht. ZP3 diente als Kontrolle für eine Kontamination von ovariellen Zellen mit Eizellen. GAPDH (Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase) und EEF1A1 (Eukaryotic translation Elongation Factor 1 Alpha 1) dienten als Referenzgene für eine spätere Normalisierung der Zielgene.

Die Primer aller Gene wurden am Anfang in Eizellen und vereinzelten Ovarzellen getestet.

Selektierte Mauszellen wurden nur in In-vitro-Kultur-Versuchen eingesetzt, da nicht genug Tiere zur Verfügung standen.

2.6.3.1 Isolierung von poly(A)-RNA aus Eizellen

Für die RNA-Isolierung aus Eizellen wurde der Dynabeads® mRNA Direct Kit (Life technologies) verwendet. Zu den gefrorenen (-80°C) Eizellen (im 0,5ml Cup) wurden pro Cup direkt 40µl Lysispuffer hinzugegeben und 10 min bei RT inkubiert. Danach wurden 5µl Dynabeads dazupipettiert und die Cups im Thermoshaker 10 min bei 24°C geschüttelt. Dann wurden die Dynabeads im Magnetständer separiert und die Flüssigkeit mit einer langen Pipettenspitze abgenommen. Die Dynabeads mit

Die gewaschenen Dynabeads wurden in 23µl H2O aufgenommen und ohne Magnetständer auf Eis gestellt. Der Magnetständer wurde ebenfalls auf Eis gestellt.

Die Dynabeads wurden im PCR-Cycler für mindestens 2,5 min bei 68°C inkubiert und dann in den Magnetständer auf Eis gestellt. Der Magnetständer wurde aus dem Eis genommen und der Überstand aus den Cups (RNA) direkt in die Cups für die Reverse Transkription, mit bereits enthaltenem Reaktionsgemisch, überführt.

2.6.3.2 Isolierung von poly(A)-RNA aus Zellen

Vorversuche haben gezeigt, dass qPCR mit Gesamt-RNA nicht funktioniert hat bzw.

inhibiert wurde. Deswegen wurde nach den Vorversuchen aus den Proben direkt nur die poly(A)-RNA isoliert und in der Reversen Transkription eingesetzt. Für die direkte Isolierung von poly(A)-RNA aus Zellen wurde das NucleoTrap® mRNA Kit (MACHEREY-NAGEL) verwendet. Die Kit-Komponenten sind im Anhang zu finden.

Zuerst wurden 600µl RM0-Puffer zum Zellpellet gegeben, um die Zellen zu lysieren.

Das Zellpellet wurde gut resuspendiert und gevortext. Das entstandene Lysat wurde in einen NucleoSpin® Filter gegeben und 1min bei 11.000g zentrifugiert. Zum Filtrat wurden 600µl RNase-freies Wasser pipettiert und gut gemischt. Um die poly(A)-RNA zu binden, wurde zum Lysat die Oligo(dt) Latex Beads Suspension (15µl/100µg Gesamt-RNA) hinzugegeben, gut gemischt und für 5min bei 68°C inkubiert. Danach wurde die Suspension für 10min bei RT inkubiert und alle 2min gekippt. Während der Inkubation bei 68°C wird die Sekundärstruktur der RNA denaturiert; die anschließende Inkubation bei RT ist für eine effiziente Bindung der poly(A)-RNA an die Beads wichtig.

Nach der Inkubation wurden die Proben zuerst 15s bei 2.000g und dann 5min bei 11.000g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Oligo(dt) Latex Beads Pellet in 600µl RM2-Puffer aufgenommen und gut gemischt. Die entstandene Suspension wurde in einen NucleoTrap® Microfilter pipettiert und zuerst 2min bei 2.000g und anschließend 2min bei 11.000g zentrifugiert. Das Filtrat wurde verworfen.

Die Oligo(dt) Latex Beads verbleiben bei diesem Schritt im Filter. Die Beads wurden anschließend 2x mit jeweils 500µl RM3-Puffer gewaschen, indem die Beads direkt im

Filter vorsichtig resuspendiert und dann 15s bei 2.000g und 2min bei 11.000g zentrifugiert wurden. Das Filtrat wurde verworfen. Zum Trocknen der Beads folgte eine weitere Zentrifugation für 1min bei 11.000g. Der NucleoTrap® Microfilter wurde in ein sauberes RNase-freies 1,5ml Cup gesetzt und die Beads wurden mit auf 68°C vorgewärmten RNase-freiem Wasser resuspendiert (20µl/10µl Oligo(dt) Latex Beads).

Der Filter wurde für 7min bei 68°C inkubiert. Zum Eluieren der poly(A)-RNA wurde anschließend 1min bei 11.000g zentrifugiert. Das Eluat wurde sofort auf Eis gestellt und es folgte die Konzentrationsbestimmung der gewonnenen poly(A)-RNA, die anschließend direkt für die Reverse Transkription verwendet wurde.

2.6.3.3 Reverse Transkription

Nach der Isolierung der poly(A)-RNA wurde die Reverse Transkriptase-PCR durchgeführt. Um die Expression eines bestimmten Gens in Zellen und Eizellen nachweisen zu können, wird hierbei aus der RNA cDNA synthetisiert. Die cDNA dient anschließend als Template für die Vervielfältigung eines bestimmten Fragments in der PCR.

Pro Ansatz betrug das Reaktionsvolumen 20µl (Tab. 8). Der Mastermix wurde für die Proben sowie die Negativkontrollen angesetzt. Dieser wurde auf die Anzahl der notwendigen Ansätze in einzelne Cups verteilt; dann wurden 15ng der poly(A)-RNA-Lösung aus der RNA-Präparation dazupipettiert. Als Kontrolle für DNA-Kontaminationen dienten die Ansätze mit RNA, jedoch ohne Reverse Transkriptase und ohne RNaseinhibitor.

Reagentien: Endkonz. Vol. pro Probe

Vol. für Neg.kontrolle

RNA 15 ng 15 ng

MgCl2: (25 mM) 5 mM 4 µl 4 µl

10x PCR-Puffer:

(20mM Tris-HCl pH 8,4, 50 mM KCl)

1x 2 µl 2 µl

dNTP’s: (je 10 mM) 1 mM 2 µl 2 µl

Hexamers/Primer: 2,5 µM 1 µl 1 µl

RNaseinh. : (20 U/µl) 20 U 1 µl -

MuLV Rev.

Transkriptase.:

(50 U/µl)

50 U 1 µl -

H2O: ad 20 µl ad 20 µl ad 20 µl

Tabelle 8: Mastermix pro RT-Ansatz zur Erstellung und Vervielfältigung von cDNA

Das Programm am PTC-200, Peltier Thermal Cycler (MJ-Research) wurde folgendermaßen programmiert:

Priming mit Hexamers: 25°C: 10min Reverse Transkription: 42°C: 60min

Denaturierung: 99°C: 5min Inkubation: 4°C

2.6.3.4 SYBR Green-qPCR

Die quantitative RealTime-PCR dient wie die herkömmliche PCR zur Vervielfältigung von Nukleinsäuren und ermöglicht gleichzeitig die Quantifizierung der amplifizierten DNA. Die Quantifizierung der gewonnenen DNA wird durch Fluoreszenzmessungen ermöglicht. Bei der in dieser Arbeit verwendeten Methode wurde SYBR Green als Fluoreszenzfarbstoff eingesetzt. Der DNA-Farbstoff interkaliert mit der entstandenen DNA, wodurch seine Fluoreszenz ansteigt. Da die Fluoreszenzintensität mit der Zunahme der gefärbten Target-DNA korreliert, kann man anhand der gemessenen Fluoreszenz auf die amplifizierte DNA-Menge schließen. Die bei der reversen Transkription entstandene cDNA wurde mit 20µl sterilen Wassers verdünnt, um in der RealTime-PCR eingesetzt zu werden. Es wurden jeweils 2µl für die Proben (2x), die Negativkontrollen und die Verdünnungsreihe eingesetzt. Diese wurden mit je 18µl des entsprechenden Mastermixes (Zusammensetzung siehe Tabelle 9) in 96-Well-Platten (optical clear, Applied Biosystems) pipettiert. Für die Wasserkontrolle wurden statt cDNA 2µl steriles Wasser eingesetzt. Für die Verdünnungsreihen wurde gepoolte cDNA verwendet, die nach der reversen Transkription mit 30µl sterilen Wassers

Tabelle 9: Zusammensetzung eines RealTime-PCR-Reaktionsansatzes

Die vorbereiteten 96-Well-Platten wurden anschließend mit Folie (optical clear, Applied Biosystems) verschlossen. Die Zielgene wurden mit dem ABI 7500 Fast Real-Time System (Version 1.5.1, Applied Biosystems) amplifiziert.

Beim qPCR-Programm wurde zuerst die Taq-Polymerase 10min bei 95°C aktiviert.

Anschließend folgten 40 Zyklen mit jeweils 15s mit 95°C und 1min mit 60°C. Bei 95°C fand die Denaturierung der cDNA statt und bei 60°C die Anlagerung der Primer, die Elongation der Zielsequenzen und die Fluoreszenzmessungen jeweils am Ende jedes Zyklus. Direkt im Anschluss an die qPCR wurde eine Schmelzkurvenanalyse durchgeführt, um die Spezifität der entstandenen Fragmente zu überprüfen. Die Temperatur wurde kontinuierlich von 60°C auf 95°C erhöht und dabei die Fluoreszenz gemessen. Die PCR-Fragmente denaturierten bei einer für sie spezifischen Temperatur in zwei Einzelstränge. Das SYBR Green wurde dabei freigesetzt und es folgte eine Fluoreszenzänderung.

Zur Überprüfung der richtigen Produktgröße wurden die entstandenen PCR-Fragmente mit Hilfe der Gelelektrophorese in einem 3,0%igen Agarose-Gel (Carl Roth) aufgetrennt und mit Hilfe von Ethidiumbromid (Carl Roth) sichtbar gemacht.

Tabelle 10 und Tabelle 11 zeigen die verwendeten Primersequenzen. Die Primer

Tabelle 10 und Tabelle 11 zeigen die verwendeten Primersequenzen. Die Primer

Im Dokument Isolierung, In-vitro-Kultivierung und Charakterisierung von porzinen und bovinen ovariellen Stammzellen (Seite 47-0)