In-vitro-Kultivierung ovarieller Stammzellen von Schwein und Rind

Da es bisher noch sehr wenige Studien zur In-vitro-Kultivierung porziner und boviner ovarieller Stammzellen gibt, wurden in der vorliegenden Arbeit verschiedene Zellkulturmedien verwendet, um unterschiedliche Kulturbedingungen zu testen.

Porzine und bovine Zellen wurden in MEM-α und DMEM unter Zusatz verschiedener Faktoren kultiviert. Zusätzlich wurden die bovinen Zellen noch in mTeSR1 (mit bFGF und IWR1) kultiviert, da in diesem Kulturmedium bovine embryonale Stammzellen erfolgreich in vitro kultiviert werden konnten (BOGLIOTTI et al. 2017, BOGLIOTTI et al. 2018). MEM-α wurde bereits erfolgreich zur In-vitro-Kultivierung von murinen und humanen ovariellen Stammzellen (WHITE et al. 2012, ZOU et al. 2009) und DMEM von porzinen ovariellen Stammzellen eingesetzt (BAI et al. 2013, BUI et al. 2014).

Murine Zellen wurden als Kontrolle in MEM-α in vitro kultiviert.

Nach der Anreicherung der ovariellen Zellen durch MACS wurden die mit Hilfe von Vasa und Fragilis selektierten Zellen in den oben genannten Zellkulturmedien in vitro kultiviert und zunächst bezüglich Morphologie und Proliferationsverhalten beurteilt.

Murine ovarielle Stammzellen wiesen direkt nach Isolation einen Zelldurchmesser von 5-8µm (WHITE et al. 2012), porzine von ca. 7µm (BUI et al. 2014) und bovine von ca.

15µm (DE SOUZA et al. 2017) auf. Die in dieser Arbeit Vasa- bzw. Fragilis-positiv selektierten Zellen aller drei Spezies wiesen direkt nach dem MACS einen Zelldurchmesser von etwa 20µm auf und sind damit größer als die in der Literatur beschriebenen Zellen. ZOU et al. (2009) isolierten Zellen aus murinen Ovarien mit einer Größe von 12 bis 20µm.

Bei den als Kontrolle dienenden murinen Vasa-positiv und Fragilis-positiv selektierten Zellen konnten runde, ca. 15µm große Zellen in allen Versuchsansätzen beobachtet werden. Die Zellen in den Vasa-positiv selektierten Zellfraktionen formten nach einiger Zeit in der In-vitro-Kultur sichtbare Kolonien, während die Zellen in den Fragilis-positiv selektierten Zellfraktionen im Gegensatz dazu nur vereinzelt auftraten. Die in dieser Arbeit in vitro kultivierten murinen Zellen zeigten eine morphologische Ähnlichkeit zu

groß, traten nach der Isolierung vereinzelt auf und bildeten nach einigen Wochen In-vitro-Kultur Zellcluster bzw. Zellkolonien (ZOU et al. 2009).

In den porzinen VASA-positiv und FRAGILIS-positiv selektierten Zellfraktionen konnten, einmal in MEM-α und mehrmals in DMEM, runde Zellen beobachtet werden.

Während die VASA-positiven Zellen eher Kolonien bildeten, traten die FRAGILIS-positiv selektierten Zellen vereinzelt auf. Bei den VASA-FRAGILIS-positiv selektierten Zellen war noch zusätzlich ein zweiter Zelltyp zu beobachten, runde dunkle Zellen, die entweder vereinzelt oder in kleinen Clustern auftraten. Morphologisch sind diese Zellen den von BUI et al. (2014) beschriebenen Zellen ähnlich, die ebenfalls dunkel erschienen und nach einer Woche In-vitro-Kultur eine Größe von 10-12µm aufwiesen.

Übereinstimmend mit unseren Ergebnissen, befanden BUI et al. (2014) DMEM-F12 als ein geeignetes Medium zur In-vitro-Kultur von porzinen ovariellen Stammzellen.

Im Gegensatz zum Schwein, konnten bei den bovinen VASA-positiv und FRAGILIS-positiv selektierten Zellen runde, Kolonien bildende Zellen nur im mTeSR1-Medium mit Zusätzen beobachtet werden. In MEM-α, konditioniertem MEM-α, DMEM und mTeSR1-Medium ohne Zusätze gab es keine morphologischen Unterschiede zwischen positiv und negativ selektierten Zellfraktionen. Die Ergebnisse der In-vitro-Kultivierung von bovinen Zellen stimmen somit nicht mit der Studie von DE SOUZA et al. (2017) überein, in der bovine ovarielle Stammzellen in MEM-α kultiviert werden konnten. Bovine embryonale Stammzellen wurden in mTeSR1-Medium in vitro kultiviert (BOGLIOTTI et al. 2017, BOGLIOTTI et al 2018). Die Kombination der Faktoren, insbesondere die Zugabe von IWR1 war für die Ableitung dieser Zellen entscheidend. Außerdem war die Zugabe von IWR1 wichtig für die Ableitung muriner Epiblast-Stammzellen und humaner primed pluripotenter Stammzellen (SUGIMOTO et al. 2015, WU et al. 2015). IWR1 blockiert die Tranlokation von β-Catenin in den Nukleus (KIM et al. 2013). In bovinen Spezies ist die Aufrechterhaltung des inaktiven kanonischen WNT-Signalwegs für eine normale Embryoentwicklung wichtig (DENICOL et al. 2013, DENICOL et al. 2014). Eine Aktivierung des WNT-β -Catenin-Signalwegs durch AMBMP wirkte sich nachteilig auf die bovine

Blastozystenentwicklung aus und reduzierte die Anzahl der Zellen in der ICM (DENICOL et al. 2013). Zusätzlich wurde das Überleben boviner Embryonen nach Transfer in Empfänger durch Inhibierung des WNT-Signalwegs signifikant verbessert (DENICOL et al. 2014). Deswegen erscheint es plausibel, dass die Verwendung von mTeSR1 unter Zusatz von IWR1 die In-vitro-Kultivierung von ovariellen Stammzellen ermöglichen kann. Nur in diesem Medium zeigten Zellen der Negativfraktionen eine veränderte Morphologie. Sie formten nach einigen Wochen große Zellklumpen, die im Gegensatz zu den in anderen Medien kultivierten Negativfraktionen nicht fibroblasten-ähnlich waren.

Im Gegensatz zu den Ergebnissen dieser Arbeit, konnten die murinen und porzinen Zellen anderer Studien über mehrere Monate in vitro kultiviert werden (BAI et al. 2013, BUI et al. 2014, WHITE et al. 2012, ZOU et al. 2009). In der vorliegenden Arbeit konnten murine und porzine Zellen nur über wenige Passagen kultiviert werden, die bovinen Zellen konnten nur direkt nach dem MACS beobachtet werden und proliferierten danach nicht mehr. Der Zusatz weiterer Faktoren wäre eine weitere Möglichkeit, die In-vitro-Kulturbedingungen der isolierten ovariellen Zellen zu optimieren. In der Studie von BUI et al. (2014) wurden dem Kulturmedium die Faktoren B27 und SCF zugesetzt. Bei SCF wurde eine Konzentration von 40ng/ml als am effektivsten für die Proliferation der porzinen ovariellen Stammzellen bewertet (BUI et al. 2014).

Da sowohl die VASA-positiv als auch die FRAGILIS-positiv selektierten Zellfraktionen viele somatische Zellen enthielten, überwuchsen diese nach einigen Wochen die sichtbaren Zellkolonien. Eine mögliche Erklärung dafür ist, dass die Zellen beim Magnetic-activated cell sorting nur angereichert, und nicht hoch reine Zellpopulationen generiert werden. Der Grad der Anreicherung ist von Zelltyp zu Zelltyp unterschiedlich.

Wenn man davon ausgeht, dass die Inzidenz der ovariellen Stammzellen im Ovar, wie die von spermatogonialen Stammzellen im Hoden, bei 0,03% liegt (TEGELENBOSCH und DE ROOIJ 1993), wären bei einer 100-fachen Anreicherung lediglich 3% ovarielle Zellen in der angereicherten Fraktion vorhanden.

Ebenfalls gegensätzlich zu den Studien von BAI et al. (2013), BUI et al. (2014), WHITE et al. (2012) und ZOU et al. (2009), konnten in der vorliegenden Arbeit, weder das Vasa- noch Fragilis-Protein in den in vitro kultivierten Vasa- bzw. Fragilis-positiv selektierten Zellen aller drei Spezies, nachgewiesen werden. Dies deckt sich mit den Ergebnissen von ZARATE-GARCIA et al. 2016. Die mit Vasa als Selektionsmarker mittels FACS isolierten murinen ovariellen Zellen, exprimierten direkt nach der Isolierung kein Vasa und kein Fragilis. Nach zwei Monaten In-vitro-Kultur konnten sowohl Vasa als auch Fragilis nachgewiesen werden. Diese in vitro kultivierten Zellen exprimierten keine Eizellmarker und degenerierten nach einigen Monaten der In-vitro-Kultur (ZARATE-GARCIA et al. 2016). Die Ergebnisse von ZARATE-GARCIA et al.

(2016) legen nahe, dass es sich bei den mit Hilfe von Vasa isolierten Zellen nicht um ovarielle Stammzellen handelte und dass diese Zellen nicht aufgrund ihrer Vasa-Expression isoliert worden sind. Es ist möglich, dass nach zwei Monaten In-vitro-Kultur die Expression einiger prämeiotischer Marker durch die Kulturbedingungen induziert wurde (ZARATE-GARCIA et al. 2016).

Bei den Zellen, die in der vorliegenden Arbeit beschrieben wurden, wurde die Expression der Vasa- und Fragilis-Proteine nach etwa dreiwöchiger In-vitro-Kultur analysiert. Eine Möglichkeit die fehlende Proteinexpression zu erklären ist, dass der Sekundärantikörper, bzw. die daran gebundenen magnetischen Beads, ebenfalls unspezifisch an Zellen binden, und somit die selektierten Fraktionen eine Mischpopulation von spezifisch und nicht spezifisch selektierten Zellen darstellen.

Weiterhin könnten die In-vitro-Kulturbedingungen einen Einfluss auf die Expression von Vasa und Fragilis haben. Die langsame Proliferation der Zellen ist möglicherweise ein Zeichen dafür, dass essentielle Faktoren, die diese Zellen zum Wachstum benötigen, in den verwendeten Kulturmedien gefehlt haben. Möglicherweise haben die Zellen zum Zeitpunkt der Selektion die beiden Keimzellmarker noch exprimiert und haben die Expression während der dreiwöchigen In-vitro-Kultur eingestellt. Zumindest auf mRNA-Ebene konnten sowohl VASA- als auch FRAGILIS-Expression in allen porzinen und bovinen Zellfraktionen direkt nach dem MACS nachgewiesen werden.

Eine Alternative würde somit eine Überprüfung der Proteinexpression direkt nach der Selektion darstellen, somit wäre ein direkter Vergleich der Genexpression auf mRNA-

und Proteinebene möglich. Die Verwendung zusätzlicher Keimzellmarker wie PRDM1 oder DPPA3 wäre eine weitere Möglichkeit, die in vitro kultivierten Zellen auf Keimzelleigenschaften zu prüfen bzw. diese zu untermauern.