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Isolierung, in vitro Kultivierung und Charakterisierung von keimbahnspezifischen Stammzellen beim Schwein

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Academic year: 2022

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Tierärztliche Hochschule Hannover

Isolierung, in vitro Kultivierung und Charakterisierung von keimbahnspezifischen Stammzellen beim Schwein

INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin

der Veterinärmedizin

- Doctor medicinae veterinariae – ( Dr. med. vet. )

vorgelegt von Franziska Jacob

Cottbus

Hannover 2014

(2)

Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Heiner Niemann, Institut für Nutztiergenetik,

Friedrich–Loeffler–Institut, Mariensee

1. Gutachter: Prof. Dr. Heiner Niemann

2. Gutachter: Prof. Dr. Burkhard Meinecke

Tag der mündlichen Prüfung: 12.11.2014

(3)

Meiner Mutti und Kurt

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(5)

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung………....1

2 Literaturübersicht……….….3

2.1 Aufbau und Funktion des Hodens……….……... 3

2.2 Spermatogenese……….…...….5

2.2.1 Hormonelle Steuerung der Spermatogenese ………..……...6

2.2.2 Stammzellnische des Hodens……….………7

2.3 Keimbahnspezifische Stammzellen....……….……11

2.3.1 Gonozyten……….………11

2.3.2 Spermatogoniale Stammzellen (SSCs)……….……12

2.4 Isolierung und Charakterisierung keimbahnspezifischer Stammzellen…………..16

2.4.1 In vitro Kultivierung ………...16

2.4.2 Marker für keimbahnspezifische Stammzellen………19

2.4.3 Anreicherungsmethoden……….…….22

2.5 Verwendung keimbahnspezifischer Stammzellen ……….….…...26

3 Material und Methoden……….……..28

3.1 Versuchsdesign……….……...28

3.2 Versuchstiere und Hodenentnahme……….….…...29

3.3 In vitro Kultivierung keimbahnspezifischer Stammzellen………..29

3.3.1 Herstellung einer Einzelzellsuspension………29

3.3.2 Bestimmung der Zellzahl und Vitalität mit Trypan Blau……….…31

3.3.3 In vitro Kulturbedingungen……….…….33

3.3.3.1 Beschichtung von Zellkulturplatten……….…..33

3.3.3.2 In vitro Kultur von testikulären Zellen………..34

3.4 Anreicherung keimbahnspezifischer Stammzellen……….……37

3.4.1 Differentielles Plattieren……….…..37

3.4.2 Dichtegradientenzentrifugation (Percoll)……….38

3.5 Charakterisierung der testikulären Zellen ……….….40

3.5.1 Genexpressionsanalyse (RT-qPCR)……….40

3.5.1.1 Isolierung der Gesamt-RNA……….….40

3.5.1.2 Reverse Transkription……….…..42

(6)

3.5.1.3 SYBR green qPCR………43

3.5.1.4 Auswertung der qPCR Ergebnisse………45

3.5.2 Immunfluoreszenzfärbung……….….46

3.5.2.1 Testung der Antikörper ………....47

3.5.2.2 Anfertigung von Paraffinhodenschnitten………..50

3.5.2.3 Immunhistologische Färbung von Hodenschnitten…………...51

3.5.2.4 Immunhistochemische Färbung von Hodenzellen………53

3.5.2.5 Auswertung der Immunhistochemie……….56

3.6 Statistische Auswertung der Daten……….…57

4 Ergebnisse………....58

4.1 In vitro Kultur juveniler und adulter testikulärer Zellen in verschiedenen Kulturmedien………60

4.1.1 Vitalität der in vitro kultivierten testikulären Zellen………60

4.1.2 Zelldichte, Proliferationsverhalten und Morphologie der in vitro kultivierten testikulären Zellen………..64

4.1.3 Genexpression der in vitro kultivierten testikulären Zellen ………70

4.1.4 Analyse von spezifischen Proteinen der in vitro kultivierten testikulären Zellen……….77

4.2 Auswirkung verschiedener Kulturzusätze auf die in vitro Kultur juveniler und adulter testikulärer Zellen……….93

4.2.1 Expression von hodenzellspezifischen Genen……….93

4.2.2 Analyse von hodenzellspezifischen Proteinen………...100

4.3. Anreicherung keimbahnspezifischer Stammzellen………..107

4.3.1 Differentielles Plattieren………107

4.3.1.1 Charakterisierung des Differentiellen Plattierens bei juvenilen testikulären Zellen………...108

4.3.1.2 Charakterisierung des Differentiellen Plattierens bei adulten testikulären Zellen………...112

4.3.2 Dichtegradientenzentrifugation (Percoll)………...116

4.3.2.1 Anreicherung und Charakterisierung der keimbahnspezifischen Stammzellpopulation von juvenilen Tieren……….……...117

(7)

4.3.2.2 Anreicherung und Charakterisierung der keimbahnspezifischen

Stammzellpopulation von adulten Tieren………124

4.4 In vitro Kultur der mittels Percoll angereicherten juvenilen testikulären Zellpopulation……….131

4.4.1 In vitro Kulturbedingungen………....131

4.4.2 Analyse von hodenzellspezifischen Proteinen………...132

4.5 Zusammenfassende Darstellung der wesentlichen experimentellen Befunde. …133 5 Diskussion………..………...134

5.1 In vitro Kultivierung porciner keimbahnspezifischer Stammzellen……….135

5.2 Anreicherung keimbahnspezifischer Stammzellen………...140

5.3 Bedeutung und Perspektiven………145

6 Zusammenfassung………..….148

7 Summary………..……152

8 Literaturverzeichnis……….…….……..155

9 Abkürzungsverzeichnis………...…174

10 Verzeichnis der Abbildungen und Tabellen……….………176

11 Anhang……….185

11.1 Zusammensetzung der verschiedenen Medien………...185

11.2 Liste der verwendeten Chemikalien……….…..188

Danksagung……….….190

(8)
(9)

1

1 Einleitung

Die weiblichen und männlichen Keimzellen (Eizellen und Spermien) eines Organismus geben die genetische Information von einer Generation an die nächste weiter. Die zuverlässige Bildung dieser Gameten sichert nicht nur das Fortbestehen einer Spezies, sondern auch die genetische Vielfalt.

Im Hoden geschlechtsreifer Individuen bildet die Spermatogenese die Basis der männlichen Fortpflanzungsfähigkeit und stellt während dieser Lebensphase des Individuums die benötigte Menge an Spermien bereit. Die Entwicklung und Reifung der männlichen Keimzellen ist ein lang andauernder und äußerst komplexer Prozess, der fast die gesamte fetale und neonatale Entwicklung bis hin zur Pubertät umfasst. Die ersten auftretenden Keimzellen sind die so genannten Vorläufer Keimzellen; sie bilden damit den Ursprung der männlichen Keimbahn (CHIQUOINE 1954; GINSBURG et al. 1990). Nach einer schnellen Zunahme der Anzahl der Vorläufer Keimzellen durch mitotische Teilungen werden sie in der G1/G0 Phase des Zellzyklus arretiert und werden dann als Gonozyten bezeichnet. Im Normalfall beginnen die Gonozyten noch vor der Geburt sich mitotisch zu teilen. Dieser Prozess setzt sich dann in den neonatalen Samensträngen fort (COUCOUVANIS et al. 1993; DE ROOIJ 1998; JIANG und SHORT 1998). Später entwickeln sich aus den Gonozyten die spermatogonialen Stammzellen, welche der Ursprung der Spermatogenese im adulten Organismus sind (DE ROOIJ 1998; JIANG und SHORT 1998).

Obwohl die Existenz spermatogonialer Stammzellen schon seit Jahrzehnten postuliert wurde (CLERMONT und LEBLOND 1953; DE ROOIJ und KRAMER 1968), gelang ihr sicherer Nachweis erst 1994, als nach einer Transplantation von Keimzellen eines fertilen Individuums in die Tubuli seminiferi eines infertilen Empfängers eine vom Spender ausgehende Spermatogenese nachgewiesen werden konnte (BRINSTER und ZIMMERMANN 1994;

BRINSTER und AVARBOCK 1994).

Um diese Stammzellen weiter erforschen und charakterisieren zu können, wurden schon in den 1960ern Versuche unternommen, ein in vitro Kultursystem zu entwickeln, allerdings zunächst mit wenig Erfolg (PARVINEN et al. 1983; LIM et al. 2010). Erst KANATSU- SHINOHARA et al. (2003) gelang es, eine Methode mit Hilfe von Wachstumsfaktoren und Feederzellen zur Langzeitkultur von murinen spermatogonialen Stammzellen zu entwickeln.

(10)

2

Mit Hilfe der Langzeitkultur von spermatogonialen Stammzellen konnte gezeigt werden, dass sie ein nützliches Hilfsmittel zur weiteren Analyse dieser Zellpopulation darstellt. Außerdem hat sie eine große Bedeutung für die Herstellung von transgenen Organismen und für andere medizinische Fragestellungen.

Allerdings konnten bisher nur bei Nagetieren, Ratte (HAMRA et al. 2005), Maus (KO et al.

2009; SHEN et al. 2010) und Hamster (Kanatsu-Shinohara et al. 2008), diese Langzeitkulturen etabliert werden.

Die vorliegenden Untersuchungen wurden an porcinen keimbahnspezifischen Stammzellen durchgeführt.

Ziel der vorliegenden Doktorarbeit war es, die keimbahnspezifischen Stammzellen aus juvenilen (Gonozyten) und adulten (spermatogoniale Stammzellen (SSCs)) Schweinehoden zu isolieren und ein in vitro Kultursystem zu etablieren. Durch die Verwendung der beiden Altersgruppen war es möglich, altersbedingte Unterschiede in den Anforderungen an ein funktionierendes in vitro Kultursystem zu analysieren. Um geeignete in vitro Kulturbedingungen für Wachstum und Erhaltung der Stammzellen zu definieren, wurden der Zellkultur verschiedene Faktoren, die Wachstum und Vermehrung von Zellen beeinflussen können, zugesetzt und ihre Effekte bewertet.

Die Beurteilung der kultivierten Zellen erfolgte mikroskopisch anhand ihrer Morphologie.

Dies war aber nur der erste Schritt, um die verschiedenen Kultursysteme mit einander zu vergleichen und zu beurteilen. Ein zweiter Schritt bestand in der detaillierten molekularen und zellbiologischen Charakterisierung der Zellen. Die Zellen wurden mit einem Markerpanel mit Hilfe der quantitativen Real-Time PCR sowie durch spezifische Färbung mit Fluoreszenz markierten Antikörpern analysiert.

Außerdem wurden zwei verschiedene Methoden (differentielles Plattieren und Dichtegradientenzentrifugation) zur Anreicherung dieser in der komplexen Zellpopulation des Hodens nur in sehr geringer Anzahl vorkommenden Zellen getestet und optimiert. Die Beurteilung der Ergebnisse erfolgte wiederum mit Hilfe der quantitativen Real-Time PCR sowie durch Färbung mit Fluoreszenz markierten Antikörpern.

(11)

3

2 Literaturübersicht

2.1 Aufbau und Funktion des Hodens

Ort der Spermatogenese ist bei allen Säugetieren der Hoden. Er hat im Allgemeinen eine elliptische Form und befindet sich meistens im Skrotum. Er ist von einer Bindegewebskapsel, der Tunica albuginea, umgeben. Diese wiederum ist mit dem Musculus cremaster verbunden, der zum Zwecke der Temperaturregulation im Hoden ein Hochziehen in die Nähe der Bauchwand ermöglicht (SCHLATT und EHMCKE 2014).

Der Säugetierhoden besteht aus zwei Kompartimenten. Das sind einerseits die Tubuli seminiferi (Samenkanälchen), sie machen im adulten Organismus ca. 90% der Masse des Hodens aus, und andererseits das Interstitium (SCHLATT und EHMCKE 2014) (Abb. 1).

Abbildung 1: Schematischer Aufbau eines Säugerhodens.

Quelle: SCHLATT und EHMCKE 2014

Die Samenkanälchen sind von der Lamina propria umgeben. Diese besteht aus der Basalmembran und den peritubulären Myoidzellen (DYM und FAWCETT 1970). Die Tubuli sind der Ort der Spermienproduktion und somit auch Sitz der spermatogonialen Stammzellen.

Als einziger somatischer Zelltyp befinden sich die Sertolizellen innerhalb dieses Kompartiments. Sie umschließen die Keimzellen mit ihren Fortsätzen und versorgen sie so

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4

mit lebenswichtigen Substanzen wie Wachstumsfaktoren, Hormonen und Cytokinen. Die Sertolizellen bilden untereinander Verbindungen (Tight Junctions) aus; sie bilden die sogenannte Blut-Hoden-Schranke. Die Keimzellen werden dadurch vor schädlichen Stoffen und Autoantikörpern geschützt (JANECKI und STEINBERGER 1986; HANDELSMAN et al. 1989).

Das Bindegewebe des Hodens besteht aus Fibroblasten, Immunzellen, Blutgefäßen und den zweiten hodenspezifischen somatischen Zellen, den Leydigzellen. Diese produzieren Testosteron, das wichtigste männliche Geschlechtshormon (SCHLATT und EHMCKE 2014).

(13)

2.2 Spermatogenese

Als Spermatogenese bezeichnet man den Prozess, bei dem

Hodens aus den diploiden Spermatogonien durch die Reifeteilung (Meiose) haploide Spermatozoen entstehen (Abb. 2).

Die Spermatogonien unterliegen nach der Vermehrung der primordialen Keimzellen während der Embryonalentwicklung einem Meioseblock. Dieser wird erst mit Beginn der Pubertät und der damit einsetzenden Produktion von FSH und Testosteron wieder aufgehoben (PHILLIPS et al. 2010).

Die Spermatogonien teilen sich zunächst mitotisch, wobei ein Teil von ihnen sich nicht weiter differenziert, sondern als Stammzellpopulation erhalten bleibt (Selbsterneuerung). Der andere Teil tritt anschließend in die Meiose ein. Der erste Schr

Verdopplung des diploiden Chromosomensatzes. Diese Zellen nennt man nun primäre Spermatozyten (CLERMONT 1972). Während der ersten Reifeteilung entstehen aus ihnen die haploiden sekundären Spermatozyten. In den sekundären Sperm

Vermehrung der DNA statt, sondern es beginnt sofort die zweite Reifeteilung. Die nun entstandenen Spermatiden besitzen jeweils nur eine Kopie des gesamten Chromosomensatzes.

Das heißt, aus einer diploiden primären Spermatozyte sind 4 (CHENG et al. 2011).

Abbildung 2: Schematische Darstellung der Spermatogenese.

Quellen: mod. nach HUNTER et al. 2012 und CHENG et al. 2011

5 2.2 Spermatogenese

Als Spermatogenese bezeichnet man den Prozess, bei dem

aus den diploiden Spermatogonien durch die Reifeteilung (Meiose) haploide Spermatozoen entstehen (Abb. 2).

togonien unterliegen nach der Vermehrung der primordialen Keimzellen während der Embryonalentwicklung einem Meioseblock. Dieser wird erst mit Beginn der Pubertät und der damit einsetzenden Produktion von FSH und Testosteron wieder aufgehoben (PHILLIPS

Die Spermatogonien teilen sich zunächst mitotisch, wobei ein Teil von ihnen sich nicht weiter differenziert, sondern als Stammzellpopulation erhalten bleibt (Selbsterneuerung). Der andere Teil tritt anschließend in die Meiose ein. Der erste Schr

Verdopplung des diploiden Chromosomensatzes. Diese Zellen nennt man nun primäre Spermatozyten (CLERMONT 1972). Während der ersten Reifeteilung entstehen aus ihnen die haploiden sekundären Spermatozyten. In den sekundären Sperm

Vermehrung der DNA statt, sondern es beginnt sofort die zweite Reifeteilung. Die nun entstandenen Spermatiden besitzen jeweils nur eine Kopie des gesamten Chromosomensatzes.

aus einer diploiden primären Spermatozyte sind 4 (CHENG et al. 2011).

Schematische Darstellung der Spermatogenese.

Quellen: mod. nach HUNTER et al. 2012 und CHENG et al. 2011

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Als Spermatogenese bezeichnet man den Prozess, bei dem in den Tubuli seminiferi des aus den diploiden Spermatogonien durch die Reifeteilung (Meiose) haploide

togonien unterliegen nach der Vermehrung der primordialen Keimzellen während der Embryonalentwicklung einem Meioseblock. Dieser wird erst mit Beginn der Pubertät und der damit einsetzenden Produktion von FSH und Testosteron wieder aufgehoben (PHILLIPS

Die Spermatogonien teilen sich zunächst mitotisch, wobei ein Teil von ihnen sich nicht weiter differenziert, sondern als Stammzellpopulation erhalten bleibt (Selbsterneuerung). Der andere Teil tritt anschließend in die Meiose ein. Der erste Schritt der Meiose besteht in der Verdopplung des diploiden Chromosomensatzes. Diese Zellen nennt man nun primäre Spermatozyten (CLERMONT 1972). Während der ersten Reifeteilung entstehen aus ihnen die haploiden sekundären Spermatozyten. In den sekundären Spermatozyten findet keine Vermehrung der DNA statt, sondern es beginnt sofort die zweite Reifeteilung. Die nun entstandenen Spermatiden besitzen jeweils nur eine Kopie des gesamten Chromosomensatzes.

aus einer diploiden primären Spermatozyte sind 4 haploide Spermatiden entstanden

Schematische Darstellung der Spermatogenese.

Quellen: mod. nach HUNTER et al. 2012 und CHENG et al. 2011

in den Tubuli seminiferi des aus den diploiden Spermatogonien durch die Reifeteilung (Meiose) haploide

togonien unterliegen nach der Vermehrung der primordialen Keimzellen während der Embryonalentwicklung einem Meioseblock. Dieser wird erst mit Beginn der Pubertät und der damit einsetzenden Produktion von FSH und Testosteron wieder aufgehoben (PHILLIPS

Die Spermatogonien teilen sich zunächst mitotisch, wobei ein Teil von ihnen sich nicht weiter differenziert, sondern als Stammzellpopulation erhalten bleibt (Selbsterneuerung). Der andere itt der Meiose besteht in der Verdopplung des diploiden Chromosomensatzes. Diese Zellen nennt man nun primäre Spermatozyten (CLERMONT 1972). Während der ersten Reifeteilung entstehen aus ihnen die atozyten findet keine Vermehrung der DNA statt, sondern es beginnt sofort die zweite Reifeteilung. Die nun entstandenen Spermatiden besitzen jeweils nur eine Kopie des gesamten Chromosomensatzes.

haploide Spermatiden entstanden

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Nach Vollendung der Spermatogenese gelangen die reifen Spermatozoen in das Lumen der Tubuli seminiferi. Von dort wandern sie durch das Rete testis und die Ductuli efferentes testis in den Nebenhoden (FRANCA et al. 2005). Die Differenzierung der Spermatiden in Spermatozoen nennt man Spermiogenese. Dieser Prozess ist mit einer Vielzahl morphologischer Veränderungen verbunden (CLERMONT 1972). Die Dauer eines Spermatogenesezyklus variiert bei den verschiedenen Spezies. Sie dauert beim Schwein 34 Tage, beim Rind 54 Tage und beim Schaf 49 Tage (SCHNORR und KRESSIN 2001).

2.2.1 Hormonelle Steuerung der Spermatogenese

Die beiden wichtigsten Hormone bei der Steuerung der Spermatogenese sind FSH (follikelstimulierendes Hormon) und LH (luteinisierendes Hormon). Die Freisetzung dieser beiden Gonadotropine aus der Adenohypophyse wird durch das hypothalamische Hormon GnRH (Gonadotropin-Releasing-Hormon) gesteuert. Außerdem wird die Ausschüttung von FSH und LH über einen negativen Rückkopplungsmechanismus auch vom Hoden selbst gesteuert: Die FSH-Sekretion wird durch das von den Sertoli-Zellen produzierte Inhibin B, die LH-Sekretion durch das von den Leydig-Zellen produzierte Testosteron gehemmt (SCHLATT und EHMCKE 2014).

Sertolizellen besitzen sowohl für FSH als auch für Testosteron Rezeptoren. Durch die Bindung von FSH wird nicht nur die Produktion von Inhibin, sondern auch die von Follistatin indirekt beeinflusst (TEOBOSCH et al. 1988). Follistatin spielt zusammen mit Activin eine entscheidende Rolle bei der Reifung von Gonozyten in Spermatogonien (MEEHAN et al.

2000). Auch die Sekretion von GDNF (Glial cell line-derived neurotrophic factor), ein wichtiger Wachstumsfaktor, der für die Selbsterneuerung von spermatogonialen Stammzellen verantwortlich ist, wird durch einen FSH Stimulus angeregt (TADOKORO et al. 2002).

Außerdem stimuliert FSH die Produktion von SCF (Stem cell factor) durch die Sertolizellen (HERMO et al. 2010). Man geht davon aus, dass SCF zusammen mit c-Kit-R die Proliferation sowie das Überleben von späteren Stadien der Keimzellen beeinflusst (GRIMALDI et al.

2002). LH wiederum stimuliert in den Leydigzellen vor allem die Produktion von Testosteron. In vitro Studien beim Menschen haben gezeigt, dass Testosteron zusammen mit FSH die Apoptose von Keimzellen verhindern kann (ERKKILÄ et al. 1997). Im Hoden ist

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Testosteron vor allem für den kontinuierlichen Ablauf der Spermatogenese verantwortlich.

Dabei erfolgt die Wirkung von Testosteron auf die Keimzellen nicht direkt, sondern indirekt über die Sertolizellen (PRINT und LOVELAND 2000). Im Hoden werden mehrere Gene (z.B. PEM (Placentae and embryos oncofetal gene) und MHC Klasse I) exprimiert, die durch Testosteron reguliert werden (SADATE-NGATCHOU et al. 2004). Allerdings ist der molekulare Mechanismus, durch den Testosteron die Funktion von somatischen Zellen und Keimzellen reguliert, unklar. Es konnte zwar gezeigt werden, dass auch differenzierende Keimzellen einen Androgenrezeptor besitzen (VORNBERGER et al. 1994), allerdings scheint er für die Spermatogenese nicht essentiell zu sein (JOHNSTON et al. 2001). Auch der Einfluss vieler anderer Substanzen, die von den Leydig- und Sertolizellen durch die Wirkung von LH und FSH produziert werden, ist bisher noch nicht vollständig geklärt (SCHLATT und EHMCKE 2014).

2.2.2 Stammzellnische des Hodens

Als Stammzellnische wird in der Biologie eine Umgebung innerhalb eines mehrzelligen Organismus bezeichnet, die die Erhaltung von Stammzellen ermöglicht. Dabei spielen sowohl zelluläre und strukturelle Faktoren als auch Signalmoleküle eine Rolle. Diese Signale regulieren die Selbsterneuerung, die Differenzierung, sowie das Überleben und somit die Erhaltung der Stammzellen (JONES und WAGERS 2008).

Man weiß im Allgemeinen sehr wenig über die genaue Struktur von Stammzellnischen. Am besten untersucht sind die Nische der Keimbahnstammzellen von Drosophila und die Nische der hämatopoetischen Stammzellen im Knochenmark bei Säugern (SPRANDLING et al.

2001). Im Falle der spermatogonialen Stammzellen haben in vivo Studien gezeigt, dass die Verteilung der Spermatogonien in den Tubuli seminiferi im engen Zusammenhang mit der Verteilung der Kapillaren im Bindegewebe steht (CAIRES et al. 2010). YOSHIDA et al.

(2007) gingen deshalb davon aus, dass bestimmte Wachstumsfaktoren und Hormone die mit dem Blut transportiert werden, das Verhalten der SSCs beeinflussen können. Die Konzentration der von den somatischen Zellen abgegebenen Stoffe, insbesondere die Androgene der Leydigzellen, ist dort besonders hoch. Das heißt je weiter von den kleinen Blutgefäßen und den somatischen Zellen entfernt sich die Spermatogonien befinden, desto

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niedriger wird die Konzentration dieser Stoffe und desto eher differenzieren sich die Spermatogonien.

Bei der Bildung und Funktion dieser Nische spielen somatische Zellen eine wichtige Rolle.

Zu ihnen gehören Sertoli-, Leydig- und peritubuläre Muskelzellen (Abb. 3). Vor allem Sertolizellen, die einzigen somatischen Zellen innerhalb der Tubuli seminiferi, spielen eine entscheidende Rolle. Dies wird auch dadurch deutlich, dass es in vivo zwar Hoden ohne Keimzellen, aber keine Hoden, in denen ausschließlich Keimzellen vorkommen, gibt (GRISWOLD 1998). Wie schon erwähnt, werden von den somatischen Zellen Wachstumsfaktoren wie GDNF, bFGF (basic fibroblast growth factor) und EGF (epidermal growth factor), die für das Wachstum und die Selbsterneuerung der SSCs relevant sind (KOSTEREVA und HOFMANN 2008) produziert.

Eine wesentliche Rolle für Erhaltung und Selbsterneuerung spermatogonialer Stammzellen spielt GDNF, dessen Produktion in den Sertolizellen durch FGF (SIMON et al. 2007) und FSH (TADOKORO et al. 2002) gesteuert wird. GDNF gehört zur Familie der transformierenden Wachstumsfaktoren und bindet an einen Mehrkomponenten-Rezeptor, bestehend aus RET (Rezeptor-Tyrosinkinase) und seinem Co-Rezeptor GFRα1 (GDNF family receptor alpha-1). Während der Embryonalentwicklung von Mäusen ist dieser Rezeptor in fast allen Organsystemen (z.B. Nerven-, Verdauungs- und Urogenitalsystem) zu finden (GOLDEN et al. 1999). Im adulten Organismus spielt er vor Allem in neuronalen Zellen (MOORE et al. 1996) und in den Keimdrüsen eine Rolle, wo er bei Mäusen (HOFMANN et al. 2005) und Ferkeln (LEE et al. 2013) spezifisch für eine Subpopulation der Spermatogonien ist. Untersuchungen bei Mäusen haben gezeigt, dass Störungen in der GDNF/Ret/GFRα1 Signalkaskade zum Verlust der Fähigkeit zur Selbsterneuerung der SSCs und somit zum progressiven Verlust der Spermatogenese führen (NAUGHTON et al. 2006).

Ein anderes wichtiges Molekül zur Erhaltung der Nische und der Spermatogenese ist Etv5 (Ets variant 5). Etv5 ist ein Transkriptionsfaktor, der von Sertoli- und Keimzellen exprimiert wird. Während die Expression in den Keimzellen durch GDNF gesteuert wird, wird sie bei den Sertolizellen durch FGF2 und EGF reguliert (OATLEY et al. 2006; SIMON et al. 2007).

Da Etv5 essentiell für die Produktion von Chemokinen (SDF-1 (stromal cell-derived factor), CXCL5 (C-X-C motif chemokine 5) und MMP12 (Matrix Metalloproteinase 12) ist (CHEN et al. 2005), und diese wiederum die Rekrutierung und Migration von Stammzellen beeinflussen

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(HEISSIG et al. 2002; VON LÜTTICHAU et al. 2005), spielt Etv5 eine wichtige Rolle in der Erhaltung der Nische.

CLL/lymphoma 6, member

associated protein 14, homolog B) protein (TBP)-

Erhaltung und Selbsterneuerung d

konnte bisher noch nicht geklärt werden.

Aber nicht nur Wachstumsfaktoren, die direkt im Hoden produziert werden, sondern auch solche die in anderen Organen des Körpers entstehen und durch die Kapil

werden, können Einfluss auf die Hodennische haben. Zu den Faktoren, die auf diese Weise wirken, gehört IGF

synthetisiert. Die genaue Wirkung von IGF

geklärt. Allerdings konnte gezeigt werden, dass IGF Leydigzellen bei Ratten und Pferden

ROSER 2010). Bei Schweinen stimuliert IGF in vitro (JAILLARD et al. 1987).

Die Rolle der peritubulären Muskelzellen innerhalb der Stammzellnische des Hodens war lange umstritten. Neue Studien zeigen aber dass CSF1 (colony

diesen Zellen produziert wird, Einfluss auf die Erhaltung von SSCs hat (OATLEY et al.

2009).

Abbildung 3: Nische der SSCs im Hoden. Viele Komponenten (somatische Zellen und Kapillaren) sind an der Nischenbildung beteiligt. Die Rolle einiger Faktoren, wie G

relativ gut erforscht und die anderer, wie Testosteron, ist noch relativ unklar.

Quelle: mod. nach PHILLIPS et al. 2010

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(HEISSIG et al. 2002; VON LÜTTICHAU et al. 2005), spielt Etv5 eine wichtige Rolle in der Erhaltung der Nische. Es wurden auch noch weitere Transkriptionsfaktoren wie Bcl6b (B cell CLL/lymphoma 6, member b) (OATLEY et al. 2006), Utp14b (

associated protein 14, homolog B) (BRADLEY et al. 2004) und Taf4b (TATA box binding associated factor) (FALENDER et al. 2005) gefunden, die wichtig für Erhaltung und Selbsterneuerung der Stammzellen sind. Die genaue Funktion dieser Moleküle konnte bisher noch nicht geklärt werden.

Aber nicht nur Wachstumsfaktoren, die direkt im Hoden produziert werden, sondern auch solche die in anderen Organen des Körpers entstehen und durch die Kapil

werden, können Einfluss auf die Hodennische haben. Zu den Faktoren, die auf diese Weise wirken, gehört IGF-1 (Insulin-like growth factor 1). IGF

synthetisiert. Die genaue Wirkung von IGF-1 auf die Zelle geklärt. Allerdings konnte gezeigt werden, dass IGF

Leydigzellen bei Ratten und Pferden in vitro hat (OZKURKCUGIL et al. 2004; YOON und ROSER 2010). Bei Schweinen stimuliert IGF-1 au

(JAILLARD et al. 1987).

Die Rolle der peritubulären Muskelzellen innerhalb der Stammzellnische des Hodens war lange umstritten. Neue Studien zeigen aber dass CSF1 (colony

esen Zellen produziert wird, Einfluss auf die Erhaltung von SSCs hat (OATLEY et al.

Nische der SSCs im Hoden. Viele Komponenten (somatische Zellen und Kapillaren) sind an der Nischenbildung beteiligt. Die Rolle einiger Faktoren, wie G

relativ gut erforscht und die anderer, wie Testosteron, ist noch relativ unklar.

Quelle: mod. nach PHILLIPS et al. 2010

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(HEISSIG et al. 2002; VON LÜTTICHAU et al. 2005), spielt Etv5 eine wichtige Rolle in der Es wurden auch noch weitere Transkriptionsfaktoren wie Bcl6b (B cell b) (OATLEY et al. 2006), Utp14b (U3 small nucleolar RNA

(BRADLEY et al. 2004) und Taf4b (TATA box binding associated factor) (FALENDER et al. 2005) gefunden, die wichtig für er Stammzellen sind. Die genaue Funktion dieser Moleküle

Aber nicht nur Wachstumsfaktoren, die direkt im Hoden produziert werden, sondern auch solche die in anderen Organen des Körpers entstehen und durch die Kapillaren transportiert werden, können Einfluss auf die Hodennische haben. Zu den Faktoren, die auf diese Weise like growth factor 1). IGF-1 wird hauptsächlich in der Leber

1 auf die Zellen des Hodens in vivo

geklärt. Allerdings konnte gezeigt werden, dass IGF-1 einen anti-apoptotischen Effekt auf hat (OZKURKCUGIL et al. 2004; YOON und 1 außerdem die Proliferation von Sertolizellen

Die Rolle der peritubulären Muskelzellen innerhalb der Stammzellnische des Hodens war lange umstritten. Neue Studien zeigen aber dass CSF1 (colony-stimulating factor 1), der von esen Zellen produziert wird, Einfluss auf die Erhaltung von SSCs hat (OATLEY et al.

Nische der SSCs im Hoden. Viele Komponenten (somatische Zellen und Kapillaren) sind an der Nischenbildung beteiligt. Die Rolle einiger Faktoren, wie G

relativ gut erforscht und die anderer, wie Testosteron, ist noch relativ unklar.

(HEISSIG et al. 2002; VON LÜTTICHAU et al. 2005), spielt Etv5 eine wichtige Rolle in der Es wurden auch noch weitere Transkriptionsfaktoren wie Bcl6b (B cell U3 small nucleolar RNA- (BRADLEY et al. 2004) und Taf4b (TATA box binding associated factor) (FALENDER et al. 2005) gefunden, die wichtig für er Stammzellen sind. Die genaue Funktion dieser Moleküle

Aber nicht nur Wachstumsfaktoren, die direkt im Hoden produziert werden, sondern auch laren transportiert werden, können Einfluss auf die Hodennische haben. Zu den Faktoren, die auf diese Weise 1 wird hauptsächlich in der Leber in vivo ist noch nicht apoptotischen Effekt auf hat (OZKURKCUGIL et al. 2004; YOON und ßerdem die Proliferation von Sertolizellen

Die Rolle der peritubulären Muskelzellen innerhalb der Stammzellnische des Hodens war stimulating factor 1), der von esen Zellen produziert wird, Einfluss auf die Erhaltung von SSCs hat (OATLEY et al.

Nische der SSCs im Hoden. Viele Komponenten (somatische Zellen und Kapillaren) sind an der Nischenbildung beteiligt. Die Rolle einiger Faktoren, wie GDNF, ist

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Zwar ist die genaue Regulierung des Wachstums der spermatogonialen Stammzellen in ihrer Nische noch nicht bis ins Detail geklärt, dennoch wird klar, dass es sehr komplexe Zusammenhänge zwischen den verschiedenen Zellen sowie Hormonen und Wachstumsfaktoren gibt. Vor allem die somatischen Zellen sind essentiell für die Erhaltung der SSCs. Das bedeutet dass auch für eine erfolgreiche in vitro Kultur das Vorhandensein dieser Zellen erforderlich sein könnte.

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11 2.3 Keimbahnspezifische Stammzellen

Wie alle Stammzellen besitzen auch keimbahnspezifische Stammzellen zwei grundlegende Eigenschaften. Erstens sind sie dazu in der Lage, sich stetig selbst zu erneuern und somit den Stammzellpool aufrecht zu erhalten, zweitens besitzen sie das Potential, sich in Spermien zu differenzieren (APONTE et al. 2005; VAN PELT et al. 1996).

Während der Ontogenese unterscheidet man zwei Arten von keimbahnspezifischen Stammzellen. Die Erste tritt nur im juvenilen Organismus auf und wird als Gonozyten bezeichnet. Erst im adulten Organismus entwickeln sich aus diesen dann die spermatogonialen Stammzellen.

2.3.1 Gonozyten

Der Ursprung dieser Zellen befindet sich im embryonalen Ektoderm. Aus diesen Zellen des Epiblasts entwickeln sich die so genannten Vorläufer Keimzellen (primordial germ cells, PGCs) (LAWSON und PEDERSON 1992). Bei der Maus können sie erstmals 7 - 7,25 Tage post coitum anhand ihres positiven alkalischen Phosphatase Verhaltens identifiziert werden (PHILLIPS et al. 2010). Bei der Maus gelang es erstmals Anfang der 90er Jahre aus PGCs undifferenzierte embryonale Keimzelllinien, sog. EGCs (embryonic germ cells), zu etablieren (MATSUI et al. 1992; RESNICK et al.1992). Diese Zellen gelten als pluripotente Zellen, da es möglich ist, sie sowohl in vitro als auch in vivo (Teratombildung) zu Derivaten aller drei Keimblätter zu differenzieren. 1997 wurden von SHIM et al. EGC-ähnliche Zellen von Schweinen isoliert und kultiviert.

Während der weiteren Entwicklung vermehren sich die Vorläufer Keimzellen und wandern entlang des Enddarms in die Keimbahnleiste ein (CLERMONT und PEREY 1957). Dies geschieht bei der Maus zwischen Tag 8,5 und Tag 11,5 post coitum (DE MIGUEL et al.

2009). Beim Menschen findet diese Wanderung zwischen der 5. und 8.

Schwangerschaftswoche statt (MOLYNEAUX und WYLIE 2005). Beim Schwein konnten PGCs durch eine Färbung mit SSEA-1 (stage-specific embryonic antigen-1) an Tag 18 post coitum identifiziert werden (SHIM et al. 1997). Sie wandern zwischen Tag 18 und 22 in die Keimbahnleiste ein (HYLDIG et al. 2011).

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Dort angekommen, werden sie von sich differenzierenden Sertolizellen umschlossen und so in die Samenkanälchen integriert (APONTE et al. 2005). Von diesem Zeitpunkt an nennt man diese Zellen Gonozyten oder Prospermatogonien (SAPSFORD 1962). Bei Ratten und Mäusen proliferieren die Gonozyten erst noch für einige Tage bevor sie in der G0/G1 Phase des Zellzyklus stehen bleiben. Erst nach der Geburt wird dieser Block wieder aufgehoben und sie entwickeln sich zu reifen Stammzellen (VERGOUWEN et al. 1991). Diese befinden sich anfangs in der Mitte der Tubuli seminiferi und wandern dann zur Basalmembran, wo sie sich in spermatogoniale Stammzellen differenzieren. Bei Ferkeln sind die Gonozyten bis zu einem Alter von 4 Monaten nachweisbar. Im Alter von 1 - 9 Monaten nimmt die Zahl der Spermatogonien zu, die aus Gonozyten, die zur Basalmembran wandern, entstehen (MURTA et al. 2010). Aber nicht alle Gonozyten entwickeln sich auch zu Stammzellen. Ein Teil degeneriert wahrscheinlich, da sie nicht zur Basalmembran wandern (ORWIG et al. 2002).

2.3.2 Spermatogoniale Stammzellen (SSCs)

Spermatogoniale Stammzellen (SSCs) sind einzelne Zellen, die in den Tubuli seminiferi im Hoden von Säugern an der Basalmembran lokalisiert sind. Durch ihre Fähigkeit zur asymmetrischen Teilung sind sie in der Lage, sich sowohl selbst zu erneuern als auch zu differenzieren und so dafür sorgen, dass es zu einer lebenslangen Spermatogenese beim männlichen Organismus kommt (DE ROOIJ und GROOTEGOED 1998).

Bei den verschiedenen Spezies werden die Spermatogonien in verschiedene Subtypen unterteilt (Abb. 4). Beim Menschen gibt es 3 Untergruppen: Adark, Apale und B Spermatogonien (CLERMONT 1966). Die Einteilung der A Spermatogonien erfolgte anhand ihres Kernfärbeverhaltens mit Hämatoxylin. Man nimmt an, dass die Adark Zellen Reservestammzellen sind und die Apale die sich selbst erneuernde Stammzellpopulation darstellen.

Bei Nagetieren gibt es neben den B Spermatogonien noch intermediäre sowie 7 Subtypen der A Spermatogonien. A und B Spermatogonien lassen sich anhand des Zustandes, in dem sich ihre DNA befindet, unterscheiden. So liegt die DNA in den A Spermatogonien als Euchromatin (typisch für undifferenzierte Zellen) und im Gegensatz dazu in den B Spermatogonien als Heterochromatin (typisch für mehr differenzierte Zellen) vor (DE ROOIJ

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und RUSSELL 2000). Zu den A Spermatogonien gehören die A-single, A-paired, A-aligned und die A1-A4. Diese Einteilung lässt sich auch auf das Schwein übertragen (FRANKENHUIS et al. 1982).

Abbildung 4: Schema zur Keimzelldifferenzierung bei Maus, Rhesusaffe und Mensch.

Die Einteilung bei der Maus lässt sich auch auf das Schwein übertragen.

Subtypen der Spermatogonien: As-Asingle, Apr-Apaired, Aal-Aaligned, I-Intermdiate, B-B Spermatogonien, Spc-Spermatozyten, RS-runde Spermatiden, S-Spermien.

Quelle: SCHLATT und EHMCKE 2014

Obwohl die wahre Identität der Stammzellen im Hoden immer noch unklar ist, geht man heute davon aus, dass sie eine Untergruppe der A-single bzw. Apale Spermatogonien bilden (DE ROOIJ 1998; HE et al. 2010). Der bisher sicherste Nachweis für das Vorhandensein von spermatogonialen Stammzellen erfolgte durch einen Transplantationsassay, der 1994 von BRINSTER und ZIMMERMANN entwickelt wurde (Abb. 5). Dabei werden testikuläre Zellen (inklusive SSCs) von einem Spendertier in ein Empfängertier ohne eigene Spermatogenese transplantiert. Als Nachweis für das Vorhandensein von SSCs gilt dann eine von den Spenderzellen ausgehende Spermienproduktion oder zumindest die Besiedlung der Stammzellnische. Als Empfänger kommen Tiere in Frage, die entweder durch einen

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Gendefekt keine endogene Spermienproduktion aufweisen (Wv/Wv) oder bei denen die Keimzellen vorher zerstört wurden. Um dies zu erreichen, werden die Tiere meist mit dem Zytostatikum Busulfan behandelt, welches proliferierende Zellen zerstört und somit auch die Spermatogonien (HONARAMOOZ et al. 2005). Eine weitere Möglichkeit besteht in der lokalen Bestrahlung der Tiere. Diese Methode wurde beispielsweise bei Rindern angewendet, um sie auf die Transplantation vorzubereiten (IZADYAR et al. 2003a). Dadurch konnte gezeigt werden, dass durch homologe Transplantation in Mäusen eine vom Spendertier ausgehende Spermatogenese möglich ist (BRINSTER und ZIMMERMANN 1994). Aber auch heterologe Transplantationen von Rattenzellen (CLOUTHIER et al. 1996) und Hamsterzellen (OGAWA et al. 1999) in Mäuse waren erfolgreich und führten zu einer vollständigen Spermatogenese. Im Gegensatz dazu konnte nach heterologer Transplantation von Hundezellen (DOBRINSKI et al. 1999a), Rinderzellen (DOBRINSKI et al. 2000) und Schweinezellen (DOBRINSKI et al. 2000) keine vollständige Spermatogenese beobachtet werden. Durch homologe Transplantation bei Hunden (KIM et al. 2008), Ziegen (HONARAMOOZ et al. 2003) und Schweinen (HONARAMOOZ et al. 2002) war dies aber möglich.

Eine Quantifizierung ist insofern möglich, als dass man davon ausgeht, dass jede sich bildende Kolonie im Empfängerhoden aus einer Stammzelle des Spendertieres entstanden ist (DOBRINSKI et al. 1999b). Das heißt je mehr Kolonien sich nach 2-3 Monaten gebildet haben, desto mehr Stammzellen waren in der Ausgangszellpopulation, die transplantiert wurde, vorhanden.

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Abbildung 5: Schematische Darstellung der Transplantation von Keimzellen bei Nutztieren.

Vom Spenderhoden wird durch enzymatischen Verdau eine Einzelzellsuspension hergestellt.

Diese kann entweder direkt in den Empfängerhoden transplantiert werden

werden vorher angereichert und /oder genetisch verändert (transfiziert). Beim Empfängertier kann in Vorbereitung auf die Transplantation die Spermatogenese durch eine Behandlung mit Busulfan oder lokale Bestrahlung unterbunden werden. Nachdem

Empfängerhoden rekolonialisiert haben

Spenders tragen. Quelle: HONARAMOOZ und YANG 2011

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Schematische Darstellung der Transplantation von Keimzellen bei Nutztieren.

Vom Spenderhoden wird durch enzymatischen Verdau eine Einzelzellsuspension hergestellt.

Diese kann entweder direkt in den Empfängerhoden transplantiert werden

werden vorher angereichert und /oder genetisch verändert (transfiziert). Beim Empfängertier kann in Vorbereitung auf die Transplantation die Spermatogenese durch eine Behandlung mit Busulfan oder lokale Bestrahlung unterbunden werden. Nachdem

Empfängerhoden rekolonialisiert haben, kann dieser Nachkommen zeugen, die das Erbgut des Spenders tragen. Quelle: HONARAMOOZ und YANG 2011

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Schematische Darstellung der Transplantation von Keimzellen bei Nutztieren.

Vom Spenderhoden wird durch enzymatischen Verdau eine Einzelzellsuspension hergestellt.

Diese kann entweder direkt in den Empfängerhoden transplantiert werden

werden vorher angereichert und /oder genetisch verändert (transfiziert). Beim Empfängertier kann in Vorbereitung auf die Transplantation die Spermatogenese durch eine Behandlung mit Busulfan oder lokale Bestrahlung unterbunden werden. Nachdem die SSCs des Spenders den kann dieser Nachkommen zeugen, die das Erbgut des Spenders tragen. Quelle: HONARAMOOZ und YANG 2011

Schematische Darstellung der Transplantation von Keimzellen bei Nutztieren.

Vom Spenderhoden wird durch enzymatischen Verdau eine Einzelzellsuspension hergestellt.

Diese kann entweder direkt in den Empfängerhoden transplantiert werden oder die SSCs werden vorher angereichert und /oder genetisch verändert (transfiziert). Beim Empfängertier kann in Vorbereitung auf die Transplantation die Spermatogenese durch eine Behandlung mit die SSCs des Spenders den kann dieser Nachkommen zeugen, die das Erbgut des

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2.4 Isolierung und Charakterisierung keimbahnspezifischer Stammzellen

Die am häufigsten verwendete Methode zur Isolierung keimbahnspezifischer Stammzellen aus der komplexen Zellpopulation des Hodens ist die Herstellung einer Einzelzellsuspension nach enzymatischen Verdau (VAN PELT et al. 1996; DIRAMI et al. 1999; GOEL et al. 2007;

DE BARROS et al. 2012; HEIDAR et al. 2014). Die Zellen dieser Einzelzellsuspension werden dann entweder direkt in Kultur gebracht (siehe Abschnitt 2.4.1) oder zuvor mit oder ohne Hilfe eines mehr oder weniger spezifischen Antikörpers angereichert (siehe Abschnitt 2.4.3) und dann in vitro weiter kultiviert.

2.4.1 In vitro Kultivierung

Bisher haben 2 Faktoren die erfolgreiche Kultivierung spermatogonialer Stammzellen behindert, erstens das Fehlen eines spezifischen Markers zur Identifizierung dieser Zellen, zweitens das fehlende Wissen bezüglich essentieller Nährstoffe und Wachstumsfaktoren, die für eine in vitro Kultivierung notwendig sind.

Da die Nische, in der die SSCs physiologischerweise vorkommen, ein sehr komplexes System ist (siehe Abschnitt 2.2.2), bedarf es der Optimierung verschiedener Faktoren wie Kulturmedium, Wachstumsfaktoren, Hormonen, Feederzellen und die Beschichtung von Kulturplatten, um die Umgebung der SSCs so gut als möglich in vitro nachzuahmen.

So wurde die unterschiedliche Beschichtung der Kulturplatten mit extrazellulären Matrices wie Laminin, Gelatine, Kollagen Typ IV und Fibronektin in ihrer Fähigkeit, die Basalmembran, an der sich die SSCs im Hoden befinden, nachzubilden, und so deren Anhaftung an der Kulturplatte und entsprechende Koloniebildung zu erleichtern, intensiv untersucht (KIM et al. 2010; LUO et al. 2009). Typische SSC Kolonien bestehen aus 10-50 runden Zellen (OGAWA et al. 2004), die sich zu traubenartigen Gebilden zusammenschließen (siehe Abb. 6). Für porcine SSCs erwies sich bisher Gelatine am besten geeignet, um diese Zellen in Kultur nachweisen zu können (KIM et al. 2010; LEE et al.

2013).

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Maus Ratte Hamster

(KANATSU-SHINOHARA (RYU et al. 2005) (KANATSU-SHINOHARA et al. 2005b) et al. 2008)

Abbildung 6: Morphologie keimbahnspezifischer Stammzellen bei verschiedenen Spezies.

Bis heute gibt es nur von Maus (KANATSU-SHINOHARA et al. 2005a), Ratte (VAN PELT et al. 2002) und Hamster (KANATSU-SHINOHARA et al. 2008) etablierte SSC Linien, die über einen längeren Zeitraum in vitro kultiviert werden können (Abb.6). Sowohl beim Affen (EILDERMANN et al. 2012) als auch beim Menschen (LIU et al. 2011; KOSSACK et al.

2013) gibt es erste, noch präliminäre Untersuchungsergebnisse in diese Richtung. Allerdings sind diese besonders im humanen Bereich strittig (CHIKHOVSKAYA et al. 2012; KO et al.

2010), denn es könnte sich bei den hier kultivierten Zellen auch um multipotente stromale Zellen (MSCs) gehandelt haben. MSCs kommen im Bindegewebe vieler Organe und auch im menschlichen Hoden vor (GONZALEZ et al. 2009). Sie können sich in die verschiedenen Zellen des Bindegewebes differenzieren. Außerdem exprimieren sie nicht die für pluripotente Zellen typischen Marker OCT4 (octamer binding transcription factor 4) und SOX2 (SRY- Related HMG-Box Gene 2). Da sie aber morphologische Ähnlichkeiten mit spermatogonialen Stammzellen aufweisen und auch einige Marker wie THY-1 (Thymocyte antigen 1) und ITGA6 (Integrin Alpha-6), die als spezifisch für Spermatogonien angesehen werden (LEE et al. 2006; HE et al. 2010), exprimieren (DOMINICI et al. 2006) kann durchaus die Gefahr der Verwechslung bestehen.

Erste Versuche zur Etablierung eines geeigneten Mediums zur Kultivierung muriner testikulärer Zellen fanden schon in den 70er Jahren des letzten Jahrhunderts statt (BELLVÉ et al. 1977). Bei diesen ersten Versuchen handelte es sich hauptsächlich um Kurzzeitkulturen über 7 Tage. Damals wurden Medien mit meistens 10% FCS (fetal calf serum), eine

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Inkubationstemperatur von 37°C, eine Atmosphäre mit 5% CO2 und eine Dichte von 1-2x105 Zellen/cm2 verwendet (NAGANO et al. 1998). Unter diesen Bedingungen waren aber nur eine Erhaltung und keine Vermehrung der Stammzellen möglich.

Fortschritte gab es erst, als weitere Faktoren, die die Vermehrung der Stammzellen ermöglichten, dem Medium zugegeben wurden (KUBOTA et al. 2004). KANATSU- SHINOHARA et al. (2003) gelang ein Durchbruch, als sie StemPro-34 Medium (welches ursprünglich zur Kultivierung hämatopoetischer Stammzellen verwendet wurde) mit verschiedenen Zusätzen wie EGF, FGF, LIF (leukemia inhibitory factor) und GDNF verwendeten, um erfolgreich murine SSCs zu kultivieren. Außerdem setzten sie nach der zweiten oder dritten Passage inaktivierte MEFs (murine embryonale Fibroblasten) als Feederzellen ein. Der Nachweis von SSCs gelang auch noch nach 5 Monaten in vitro Kultur durch Transplantation.

NAGANO et al. (1998) gelang die Kultivierung muriner SSCs in DMEM mit Hilfe von STO als Futterzellen. Dieses Protokoll wurde durch die Zugabe von SCF, LIF, FGF, IGF-1, IL-11 (Interleukin 11), Oncostatin M und PDGF (platelet-derived growth factor) modifiziert (JEONG et al. 2003) und so die Bildung von SSC Kolonien verbessert. Auch hier war nach 3 Monaten ein Nachweis spermatogonialer Stammzellen möglich.

Es wurde gezeigt, dass der Einsatz von IGF-1 in einer Konzentration von 1-50ng/ml bei SSCs von Ratten und in einer Konzentration von 0,1-500ng/ml bei SSCs von Pferden die Überlebensrate von Leydigzellen in vitro verbesserte (COLÓN et al. 2007; YOON und ROSER 2010). Da diese Zellen eine wichtige Rolle in der Nische der SSCs spielen, wäre auch ein positiver Effekt auf die Stammzellen selbst denkbar.

Neben den Wachstumsfaktoren wurden auch verschiedene Hormone den Medien zugesetzt, um die Erhaltung und Vermehrung von SSCs in vitro zu erreichen. Mit Verwendung von FSH in einer Konzentration von 100ng/ml konnte die GDNF Produktion durch murine Sertolizellen gesteigert werden (SIMON et al. 2007). Auch hier ist ein positiver Einfluss auf die Stammzellen nicht auszuschließen. Obwohl in derselben Studie gezeigt wurde, dass Testosteron keinen direkten Einfluss auf die GDNF Produktion der Sertolizellen hat, ist doch ein Effekt auf die Erhaltung und Vermehrung der spermatogonialen Stammzellen nicht auszuschließen. Weitere Untersuchungen zum Einsatz von Testosteron in der Kultur von SSCs sind nicht bekannt.

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Bei Nutztieren wurden neben dem bei Mäusen erfolgreich eingesetzten StemPro-34 Medium (KO et al. 2009; SHEN et al. 2010) verschiedene andere Medien für die in vitro Kultivierung spermatogonialer Stammzellen verwendet. DIRAMI et al. (1999) fanden heraus, dass die Überlebensrate von porcinen A Spermatogonien in KSOM, einem Medium das ursprünglich zur Kultivierung muriner Blastozysten verwendet wurde, am höchsten war. Ein sehr viel einfacheres Medium im Vergleich zu StemPro-34 wird im Bereich boviner SSCs benutzt (IZADYAR et al. 2003b). Hierbei handelt es sich um MEM α (Minimum Essential Medium α). Der einzige Zusatz in diesem Falle besteht normalerweise aus FCS. APONTE et al. (2006) fanden jedoch heraus, dass der Zusatz von 50ng/ml GDNF Selbsterneuerungs- und Überlebensraten von bovinen SSCs verbesserte. Auch DMEM wurde in verschiedenen Variationen erfolgreich zur in vitro Kultivierung von bovinen (DE BARROS et al. 2012), caprinen (WANG et al. 2013) und humanen (LIM et al. 2010) Spermatogonien eingesetzt.

2.4.2 Marker für keimbahnspezifische Stammzellen

Die größte Herausforderung in der Erforschung spermatogonialer Stammzellen ist die Suche nach einem geeigneten Marker, mit dem diese Zellen eindeutig identifiziert werden können.

Die gezielte Suche wurde in erster Linie mit Hilfe des oben beschriebenen Transplantationsassays durchgeführt.

Tabelle 1 gibt einen Überblick über einige der bisher gefundenen Marker bei den verschiedenen Spezies. Dabei wurden aber nicht alle Zellpopulationen, die mit Hilfe des entsprechenden Markers isoliert oder analysiert wurden, durch einen Transplantationsassay oder Immunfluoreszenzfärbungen von Hodenschnitten im Detail charakterisiert.

Die wichtigsten Oberflächenmarker von SSCs bei Mäusen sind α6-integrin, β1-integrin und THY-1 (SHINOHARA et al. 1999; KUBOTA et al. 2003). Aber z.B. auch GFRα1 und PLZF (promyelocytic leukemia zinc finger) werden als Marker von Spermatogonien und ihren Vorläufern angesehen (MENG et al. 2000; BUAAS et al. 2004).

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Marker Spezifität Spezies Quelle

CD24 Spermatogonien Maus KUBOTA et al. 2003

CD9 Spermatogonien Maus KANATSU-SHINOHARA et al. 2004

DBA Gonozyten Schwein GOEL et al. 2007

A Spermatogonien Rind IZADYAR et al. 2002

FGFR3 A Spermatogonien Mensch VON KOPYLOW et al. 2012

GFR α1 Spermatogonien Maus MENG et al. 2000

Teil der Gonozyten Schwein LEE et al. 2013

GPR125 Vorläuferzellen Maus SEANDEL et al. 2008

Teil der Spermatogonien Mensch HE et al. 2010

Id4 SSCs? Maus CHAN et al. 2014

SSCs? Mensch SACHS et al. 2014

ITGA6 Spermatogonien Mensch VALLI et al. 2014

MAGE A4 Spermatogonien Affe EILDERMANN et al. 2012

Spermatogonien u.

Spermatozyten Mensch KOSSACK et al. 2013 PGP 9.5 Gonozyten/Spermatogonien Schwein LUO et al. 2006 Gonozyten/A Spermatogonien Rind HERRID et al. 2007

Spermatogonien Schaf RODRIGUEZ-SOSA et al. 2006

PLZF Spermatogonien Maus BUAAS et al. 2004

Teil der Spermatogonien Affe EILDERMANN et al. 2012

Spermatogonien Mensch SADRI-ARDEKANI et al. 2009

Spermatogonien Schwein LUO et al. 2009

Teil der Spermatogonien Rind REDING et al. 2010

SALL 4 Teil der Spermatogonien Affe EILDERMANN et al. 2012 SSEA-1 Spermatogonien Schwein KIM et al. 2013

Stra8 prämeiotische Keimzellen Maus OULAD-ABDELGHANI et al. 1996

Thy-1 Spermatogonien Maus KUBOTA et al. 2003

Spermatogonien Rind REDING et al. 2010

UTF1 Spermatogonien Mensch KOSSACK et al. 2013

VASA Spermatozyten Schwein LEE et al. 2005

alle bis Spermatozyten Maus TOYOOKA et al. 2000 α6-integrin Spermatogonien Maus SHINOHARA et al. 1999 β1-integrin Spermatogonien Maus SHINOHARA et al. 1999

Tabelle 1: Übersicht über die bisher bekannten wichtigsten Marker für keimbahnspezifische Stammzellen bei den verschiedenen Spezies und ihre Spezifität für Zellen der Spermatogenese.

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Allerdings kann nur ein Teil der bei der Maus verwendeten Marker (z.B. GPR125 und PLZF) auch beim Menschen genutzt werden, um Spermatogonien zu identifizieren (DYM et al.

2009). Es ist also längst nicht immer möglich, die Ergebnisse von einer Spezies auf eine andere zu übertragen. Diese Tatsache erschwert die Suche nach einem geeigneten Marker für spermatogoniale Stammzellen, vor allem bei den Spezies, bei denen noch keine SSCs Linien etabliert werden konnten.

VASA, eine ATP abhängige RNA Helikase (HAY et al. 1990), ist ein Marker, der auch bei Schweinen von den Vorläuferkeimzellen bis hin zu den Spermatozyten, aber nicht von SSCs exprimiert wird (LEE et al. 2005). Bei Primaten gelten SALL4 (Spalt-like 4) und MAGEA4 (Melanoma antigen family A4) als Marker für SSCs bzw. Keimzellen im Allgemeinen (EILDERMANN et al. 2012).

Das Problem bei den meisten Markern besteht darin, dass sie nicht nur an SSCs, sondern auch an andere Stadien der Spermatogonien spezifisch binden. Da es noch keinen eindeutigen Marker für spermatogoniale Stammzellen gibt, werden mehrere Marker, wie z.B. bei der Maus eine Kombination von Positiv-(THY-1) und Negativmarkern (c-kit) zusammen verwendet, um SSCs von anderen Spermatogonien und ihren Vorläufern nicht zu unterscheiden (KUBOTA et al. 2003).

Der bisher beste Marker für SSCs beim Schwein ist PGP 9.5 (LUO et al. 2006), da er sowohl für Gonocyten als auch für Spermatogonien spezifisch ist (Abb. 7). Das Synonym für PGP 9.5, nämlich UCH-L1 (Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase L1) erklärt auch dessen eigentliche Funktion, die Hydrolyse von Ubiquitin am C-terminalen Ende von Proteinen.

UCH-L1 kommt aber nicht nur ausschließlich im Hoden, sondern auch in neuronalen Zellen vor (WILKINSON et al. 1992).

Ein weiterer Marker, der bei Schweinen eingesetzt wird, ist DBA (Dolichos biflorus agglutinin). Im Gegensatz zu PGP 9.5 ist er allerdings nur für Gonozyten und nicht für Spermatogonien spezifisch (GOEL et al. 2007). Auch bei Rind (IZADYAR et al. 2002;

RATHI et al. 2005) und Schaf (RODRIGUEZ-SOSA et al. 2006) wurden diese beiden Marker eingesetzt, um Spermatogonien zu identifizieren. Nachteil dieser beiden Marker ist, dass sie im Zytoplasma lokalisiert sind und somit schlecht geeignet sind, um die entsprechenden Zellen zu selektieren.

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Abbildung 7: Verteilung von PGP 9.5 positiven Zellen in Hodenschnitten von Schweinen verschiedenen Alters. A: 1 Woche, B: 12 Wochen, C: erwachsener Eber. Balken = 50µm.

Quelle: LUO et al. 2006

2.4.3 Anreicherungsmethoden

Der Anteil spermatogonialer Stammzellen im Hoden von Säugetieren ist im Vergleich zu allen anderen Zelltypen sehr gering. TEGELENBOSCH und DE ROOIJ (1993) kalkulierten, dass sie nur ca. 0,03% der Zellen im Hoden ausmachen. Im Gegensatz dazu beträgt der Anteil der Gonozyten an allen Zellen der Tubuli seminiferi immerhin 7% (HONARAMOOZ et al.

2005). Aber verbunden mit dem Wissen, dass die somatischen Zellen des Hodens dazu neigen, die Zellkulturplatten zu überwachsen (OATLEY und BRINSTER 2006), ist es sinnvoll die keimbahnspezifischen Stammzellen in einer gewissen Weise anzureichern.

Um dieses Ziel zu erreichen, gibt es diverse Strategien, die bei den verschiedenen Spezies zum Einsatz kamen. Dazu gehören FACS (fluorescence activated cell sorting), z.B. beim Rind (IZADYAR et al. 2002) und bei der Maus (LIU et al. 2007), MACS (magnetic activated cell sorting) bei der Maus (KUBOTA et al. 2004) und bei Primaten (GASSEI et al. 2010), differentielles Plattieren bei der Maus (KO et al. 2009), Schwein (LUO et al. 2006) und Mensch (KOSSACK et al. 2013) und die Dichtegradientenzentrifugation bei Ratte (VAN PELT et al. 1996), Schwein (KIM et al. 2010) und Büffel (AHMAD et al. 2013).

Da man für die ersten beiden Verfahren (FACS und MACS) einen spezifischen Oberflächenmarker benötigt, und dieser bisher für porcine spermatogoniale Stammzellen nicht zur Verfügung steht, ist es leider nicht möglich, sie zu diesem Zweck zu nutzen.

Von den beiden übrigen ist wohl das differentielle Plattieren das technisch einfachere Verfahren. Obwohl bei den verschiedenen Spezies in unterschiedlichster Form angewendet,

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ist die Grundidee ähnlich. Man geht davon aus, dass sich die somatischen Zellen schneller an der Kulturschale anheften als die SSCs. Dadurch erhält man bei weiterer Kultivierung des Überstandes nach einer bestimmten Zeit eine mit SSCs angereicherte Zellpopulation. Die Protokolle unterscheiden sich in den verwendeten Medien (MEM α – KOSSACK et al. 2013, DMEM – KALA et al. 2012, StemPro-34 – KO et al. 2009), der Dichte der ausgesäten Zellen (50.000/cm2 – KOSSACK et al. 2013, 200.000/cm2 – GOEL et al. 2010, 1,5x106/cm2 – LUO et al. 2006) und der Beschichtung der Platten (Gelatine – KUIJK et al. 2009, Laminin – AHMAD et al. 2013, BSA – GOEL et al. 2010).

Tabelle 2 gibt einen Überblick über die verschiedenen Zeitabstände bei den unterschiedlichen Spezies, nach denen der Überstand auf einer neuen Kulturplatte weiter kultiviert wurde.

Außerdem ist der Tabelle 2 zu entnehmen, dass mit Hilfe des differentiellen Plattierens eine Anreicherung der SSCs von bis zu 98% möglich war (DIRAMI et al. 1999)

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24 Anteil von SSCs

im Überstand Zeitabstand Spezies Quelle

81% 3h, 4h, 5h, 6h Ziege HEIDARI et al. 2014

80% ??? Büffel AHMAD et al. 2013

45% 1,5h Ratte VAN PELT et al. 1996

17% über Nacht Schwein KIM et al. 2013

80% über Nacht Schwein KIM et al. 2010

16% über Nacht Schwein LUO et al. 2006

91% 4h Schwein GOEL et al. 2007

98% 4h Schwein DIRAMI et al. 1999

??? über Nacht Mensch KOSSACK et al. 2013

??? 4h Mensch LIM et al. 2010

??? 3h Mensch HE et al. 2010

??? über Nacht Ziege WANG et al. 2013

??? über Nacht Rind KALA et al. 2012

45% über Nacht Rind IZADYAR et al. 2002

38% 2h Büffel GOEL et al. 2010

29% über Nacht Schaf RODRIGUEZ-SOSA et al. 2006

??? über Nacht Maus KANATSU-SHINOHARA et al. 2003

Tabelle 2: Übersicht zur Anreicherung von SSCs durch differentielles Plattieren bei den verschiedenen Spezies sowie des Zeitabstandes nach dem der Überstand auf eine neue Kulturplatte überführt wurde. Die fett hervorgehobene Zeit gibt an, wann die höchste Anreicherung erreicht wurde. Die Fragezeichen bedeuten, dass es in der entsprechende Quelle keine Angaben zur erreichten Anreicherung gibt.

Eine weitere Methode um Zellen anzureichern, besteht darin, sie mit Hilfe eines Dichtegradienten ihrer Größe nach zu trennen. Es gibt die Möglichkeit diesen Gradienten mit verschiedenen Substanzen aufzubauen. Eine dieser Substanzen ist das Percoll. Es besteht aus gelösten, mit Polyvinylpyrrolidon beschichteten kolloidalen Silikatpartikeln und wird zur Trennung von Zellen, Organellen und Viren eingesetzt. Besonders geeignet zu diesem Zweck ist es durch seine hohe Viskosität, niedrige Osmolarität und niedrige Toxizität gegenüber Zellen (IZADYAR et al. 2002; HEIDARI et al. 2014). Die Unterschiede in den einzelnen Protokollen bestehen darin, wie genau der Gradient aufgebaut ist (siehe Tabelle 3) und unter

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welchen Bedingungen die Zellen anschließend zentrifugiert werden (600g/10min – KIM et al.

2010, 800g/30min – AHMAD et al. 2013).

Tabelle 3 ist zu entnehmen, dass es mit dieser Anreicherungsmethode möglich war, eine Zellpopulation mit einem Anteil von 95% SSCs zu erhalten.

Anteil von SSCs Gradientenaufbau Spezies Quelle

95% 20, 28, 30, 32% Ziege HEIDARI et al. 2014

1,7% 20,30,40,50,60% Schwein KIM et al. 2013

65% 20,25,30,33,36,40,45,50% Büffel AHMAD et al. 2013 80% 20,28,30,32,34,36,40,50,65% Ratte VAN PELT et al. 1996

5% 20,30,40,50,60% Schwein KIM et al. 2009

70% 20,30,40,50,60% Schwein GOEL et al. 2007

87% 11,19,27,35,43% Mensch LIU et al. 2011

75% Fraktion 3 Rind IZADYAR et al. 2002

??? 20,28,30,32,34,36,40,50,65% Rind KALA et al. 2012

55% 20,25,30,35,40,45,50% Büffel GOEL et al. 2010

Tabelle 3: Übersicht zum Aufbau des Percollgradienten bei den verschiedenen Spezies sowie die maximal erreichte Anreicherung von SSCs in einer Percollfraktion. Die fett gedruckten Prozentzahlen geben an, in welcher Fraktion die maximale Anreicherung stattfand. Die Fragezeichen bedeuten, dass es in der entsprechende Quelle keine Angaben zur erreichten Anreicherung gibt.

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2.5 Verwendung keimbahnspezifischer Stammzellen

Die Erforschung spermatogonialer Stammzellen hat in letzter Zeit großes Interesse erlangt, da es für sie eine Vielzahl von Einsatzmöglickeiten gibt. So stellen sie zum Beispiel ein primäres Ziel für genetische Modifikationen dar, da sie die einzigen adulten Stammzellen sind, die genetische Informationen direkt an die Nachkommen weitergeben. Die Möglichkeit, diese Zellen in vitro zu kultivieren und genetisch zu modifizieren, wäre also ein wertvolles Instrument, um transgene Tiere zu produzieren. Die Produktion transgener Tiere auf diesem Weg wäre eine gute Ergänzung zu den bisher vorhandenen Methoden, die meist mit einer geringen Effizienz und einer niedrigen Anzahl lebend geborener Nachkommen verbunden sind (PINKERT und MURRAY 1999; YANG et al. 2007). Ein weiteres Einsatzgebiet für spermatogoniale Stammzellen stellt die Erhaltung gefährdeter Wild- und Nutztiere dar (PUKAZHENTHI et al. 2006; SCHLATT 2002). Denn hier ist bisher nur möglich, durch das Tiefgefrieren des Spermas von erwachsenen Tieren genetische Ressourcen zu bewahren.

Es sind also neue Methoden notwendig, um diese auch von juvenilen Tieren zu erhalten.

Spermatogoniale Stammzellen können außerdem in der regenerativen Medizin und bei der Behandlung von Unfruchtbarkeit eingesetzt werden. Vor allem Jungen, die vor der Pubertät wegen einer Krebserkrankung behandelt werden müssen, und deshalb noch nicht die Möglichkeit haben, ejakulierte Spermien einfrieren zu lassen, um so später eigenen Nachwuchs zu bekommen (FUJITA et al. 2005), könnten von neuen Forschungsergebnissen profitieren. Denn ca. 30% aller Patienten, die eine Krebsbehandlung in der Kindheit überleben, zeigen vor allem nach Chemotherapie mit hohen Dosen, Ganzkörperchemotherapie und Bestrahlung im Genitalbereich eine Azoospermie (SADRI-ARDEKANI et al. 2009;

GEENS et al. 2008).

Sucht man nach einem geeigneten Modellorganismus, der es möglich macht, die gewonnenen Ergebnisse auch möglichst auf den Menschen übertragen zu können, so wird man eher im Bereich der Nutztiere fündig. Besonders das Schwein genügt durch seine hohe physiologische und anatomische Ähnlichkeit zum Menschen diesem Anspruch (KUES und NIEMANN 2004). Die Maus ist zwar wegen ihrer Größe, kurzen Trächtigkeitsdauer und einfachen Haltung ein viel verwendeter Modellorganismus (PETERS et al. 2007), aber Anatomie und Physiologie unterscheiden sich stark von der des Menschen, weshalb sie in diesem Falle

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ungeeignet ist. Auch aus diesem Grund wurden die Untersuchungen der vorliegenden Doktorarbeit an porcinen keimbahnspezifischen Stammzellen durchgeführt.

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3 Material und Methoden

3.1 Versuchsdesign

Ziel dieser Doktorarbeit war es, ein in vitro Kultursystem für porcine keimbahnspezifische Stammzellen zu etablieren. Zu diesem Zweck wurden Hoden von juvenilen und adulten Tieren gewonnen und aus ihnen eine Einzelzellsuspension hergestellt. Durch die Verwendung der beiden Altersgruppen sollten altersbedingte Unterschiede in den Anforderungen an das in vitro Kultursystem analysiert werden.

Anschließend wurden die Zellen in drei verschiedenen Kulturmedien (KSOM, MEM α und StemPro-34) in verschiedener Dichte kultiviert. Nach Bestimmung der Vitalität und ersten morphologischen Untersuchungen wurden im zweiten Versuchsabschnitt spezifische Zusätze (IGF-1, FSH, Testosteron, GDNF, Schweineserum, FCS) dem Kulturmedium zugesetzt. Im Anschluss erfolgte eine weitere Charakterisierung mit Hilfe von Genexpression und Immunfluoreszenzfärbungen (Abb. 8). Im dritten Versuchsabschnitt wurden verschiedene Methoden (Differentielles Plattieren, Dichtegradientenzentrifugation) zur Anreicherung der keimbahnspezifischen Stammzellen von juvenilen und adulten Tieren getestet und optimiert.

Auch hier wurden die angereicherten Zellpopulationen mit Hilfe von Genexpressionsanalysen und Immunfluoreszenzfärbungen charakterisiert. Abschließend erfolgte eine Kombination der bisherigen Ergebnisse, indem eine mit Stammzellen angereicherte Ausgangspopulation in den vielversprechendsten Kulturmedien kultiviert wurde. Diese in vitro Kulturen wurden dann mittels Immunfluoreszenzfärbungen analysiert.

Abbildung 8: Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus.

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29 3.2 Versuchstiere und Hodenentnahme

Die Versuchstiere stammten mit einer Ausnahme aus der Versuchsstation des Instituts für Nutztiergenetik (FLI) in Mariensee. Ein Eber kam aus der Klinik für kleine Klauentiere der Tierärztlichen Hochschule Hannover.

Bei 13 von den 15 aus Mariensee stammenden Ebern handelte es sich um Oct4-EGFP transgene Tiere. Im Gegensatz dazu wurden Wildtyp Ferkel verwendet. Alle in dieser Doktorarbeit verwendeten Tiere gehörten der Landrasse an.

Die 16 erwachsenen Tiere wurden im Alter zwischen 11 Monaten und 4 Jahren und 4 Monaten geschlachtet. Nach der Tötung erfolgte die äußere Reinigung der Hoden mit Wasser, um groben Schutz zu entfernen, und 80%igem Ethanol. Danach wurden das Skrotum eröffnet und die Hoden entnommen. Der Transport ins Labor erfolgte in einem Behältnis mit warmem Wasser.

Die Ferkelhoden wurden bei der routinemäßigen Kastration von 253 5 Tage alten Ferkeln gewonnen. Auch hier wurde im Vorfeld das Skrotum mit Ethanol gereinigt, um eine Kontamination des Probenmaterials zu verhindern. Die Ferkelhoden wurden in zuvor im Wasserbad erwärmtem DMEM/F12 Medium (PAA) mit doppelt Pen/Strep (AppliChem) und Amphotericin (PAA) in 50ml Falcons transportiert.

Alle Versuche wurden im Einklang mit den gesetzlichen Vorgaben durchgeführt.

Die gewonnenen Proben der juvenilen und adulten Tiere wurden anschließend direkt im Labor bearbeitet.

3.3 In vitro Kultivierung keimbahnspezifischer Stammzellen

3.3.1 Herstellung einer Einzelzellsuspension

Damit keimbahnspezifische Stammzellen kultiviert werden konnten, war es zunächst notwendig, sie aus der komplexen Zellpopulation des Hodens zu isolieren. Um das zu erreichen, wurde mit Hilfe eines enzymatischen Verdaus eine Einzelzellsuspension hergestellt. Dafür wurden als erstes die Hoden, bzw. Teile davon, in Petrischalen (Ø10 cm) mit DMEM/F12 Medium mit doppelt Pen/Strep und Amphotericin überführt, um ein Austrocknen zu verhindern. Anschließend wurden alle Hüllen (Lamina visceralis der Tunica

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