Untersuchung der Zellkulturen auf Kontamination mit BVD-Virus, bzw. Mykoplasmen

Mykoplasmen

Das Blut sämtlicher Feten, von denen Epithelzellen gewonnen wurden, wurde auf BVD-Virus und Antikörper gegen BVD-Virus im Institut für Virologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover untersucht. Nur die Zellen von nicht infizierten, seronegativen Tieren wurden weiter verwendet.

Zusätzlich wurden die Epithelzellkulturen, die sich für eine weitere Vermehrung und Charakterisierung der Zellen als brauchbar erwiesen, unter Verwendung eines BVD-virusspezifischen Antikörpers auf Infektion mit BVD-Virus getestet. Hierzu wurden die auf Zellkulturplatten befindlichen Zellen dreimal mit PBS gewaschen, durch Ausschlagen der

Platten von verbleibender Pufferlösung befreit und für drei Stunden bei 80° C hitzefixiert. Der Zellrasen wurde dann mit einem Peroxidase-konjugierten polyklonalen Antiserum gegen BVD-Virus aus dem Schwein (HYERA et al. 1987), welches mit PBS/Tween verdünnt wurde, überschichtet und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Hiernach wurden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen und 3-Amino-9Äthylcarbazol (AEC)-Lösung zugegeben.

Das Enzym Meerrettichperoxidase wurde durch das in der Lösung enthaltene H2O2 oxidiert und AEC in einen roten Farbstoff umgesetzt. Nach fünf Minuten wurde überschüssiges Substrat durch Waschen mit Aqua bidest. von den Platten entfernt.

Die Untersuchungen auf Kontamination der Zellen mit Mykoplasmen erfolgten mittels Anzüchtungsversuchen im Institut für Mikrobiologie und der Klinik für Geflügel, Tierärztliche Hochschule Hannover, sowie mit Antigen-Capture-ELISA im Veterinäruntersuchungsamt Hannover.

3.2.8. Morphologische Untersuchungen

3.2.8.1. Transmissionselektronenmikroskopie

Die Zellkulturen wurden für diese Untersuchung auf permeablen Filtern (Transwell²², Polycarbonatmembran, 0,4 µm Porengröße; bzw. Transwell Col²³, PTFE-Membran mit Kollagen I und III aus Rinderplazenten beschichtet, 0,4 µm Porengröße), die sich in Plastikhalterungen in 24-well-Zellkulturplatten befanden, angezüchtet.

Da die Zellen sich auf den in Plastikhalterungen befindlichen Filtereinsätzen nicht mikroskopieren ließen, wurde zeitgleich mit ihrer Aussaat die identische Zellzahl in Mikrotitervertiefungen verbracht, die in ihrem Durchmesser in etwa dem der Filteroberfläche (6,5 mm) entsprachen. Erst wenn die Zellen in den Mikrotitervertiefungen sich mikroskopisch als zu ca. 90 % dicht gewachsen erwiesen, wurden die auf den Filtern angewachsenen Zellen nach ein bis zwei Tagen Wartezeit in 2,5%igem kakodylatgepufferten, 4° C kaltem Glutaraldehyd für 15 Minuten fixiert. Hiernach schlossen sich wieder mehrere Spülungen mit Kakodylatpuffer an. Die Zellen in den Mikrotitervertiefungen wurden 3 Stunden bei 80° C hitzefixiert und immunhistochemisch auf das Vorkommen von Cytokeratin untersucht.

Nach der Fixierung wurden die Filtereinsätze mit einem Skalpell aus den Plastikhalterungen herausgetrennt, in Präparategläschen verbracht und zwei Stunden in 1%igem Osmiumtetroxid (in 0,1 M Kakodylatpuffer, pH 7,2) bei Raumtemperatur nachfixiert. Hiernach wurden wieder

22 Fa. Costar, Art. 3413

Spülungen mit Kakodylatpuffer durchgeführt. Es folgte eine Entwässerung der Präparate mit 30, 50, 70, 90%igem und absolutem Ethanol für jeweils 30 Minuten. Anschließend wurde das Material noch einmal für eine Stunde in absolutes Ethanol verbracht. Die Zellen wurden über Nacht bei 4° C in einem Ethanol-Epon-812-Gemisch (1 : 1) belassen, am nächsten Morgen für 2 Stunden bei Raumtemperatur in reines Epon-812²⁴ verbracht und anschließend in frisch angesetztem Epon unter Zugabe von 1 % Beschleuniger²⁵ in Flacheinbettungsformen²⁶ eingebettet. Die Polymerisation erfolgte in einem Wärmeschrank bei 45° C für einen Tag und bei 60° C für zwei Tage.

Die auspolymerisierten Kunststoffblöcke wurden mit einer Fräse²⁷ pyramidenförmig zugetrimmt. Dann wurden von ihnen mit Glasmessern²⁸ an einem Ultramikrotom²⁹ 0,75 µm dicke Semidünnschnitte angefertigt. Diese wurden in 0,25%iger Toluidinblau-O-Färbelösung verbracht und flottierten in dieser Lösung für ca. fünf Minuten. Danach wurden die Schnitte mehrfach in Aqau dest. gespült, bis keine Farbwolken mehr im Wasser entstanden, mit einer Metallöse auf Objektträger verbracht und bei 80° C getrocknet.

Nach dem Eindecken mit Entellan³⁰ wurden die Präparate zunächst lichtmikroskopisch beurteilt. Von ausgewählten Bereichen wurden ca. 80 nm dicke Ultradünnschnitte mit Hilfe eines Diamantmessers³¹ an einem Ultramikrotom hergestellt, auf Kupfernetze³² aufgezogen und im LKB-Ultrostainer³³ kontrastiert. Dies erfolgte in zwei Schritten, zunächst mit einer gesättigten Uranylacetatlösung³⁴ für 30 Minuten bei 40° C, dann in einer Bleizitratlösung³⁵ für 72 Sekunden bei 20° C. Die Auswertung der Proben wurde an einem Elektronenmikroskop EM10C/CR³⁶ durchgeführt.

23 Fa. Costar, Art. 3495

24 Fa. Serva, Heidelberg

25 DMP 30, Fa. Serva, Art. 36975

26 Fa. Plano, Art. G3503

27 TM 60, Fa. Reichert Jung, Nußloch

28 Fa. Plano, Art. G329

29 Ultracut E, Fa. Reichert Jung

30 Fa. Merck, Art. 7961

31 Fa. Leica, Bensheim

32 200 mesh, Fa. SCI, München, Art. G200TH Cu

33 Fa. Cambridge, Nußloch

34 LKB-Ultrostain I, Fa. Cambridge, Nußloch

35 LKB-Ultrostain II, Fa. Cambridge, Nußloch

36 Fa. Carl Zeiss, Oberkochem

3.2.8.2. Rasterelektronenmikroskopie

Nach mehrfachem Spülen der auf permeablen Filtern in 24-well-Platten, bzw. auf Deckgläschen im CCSC-System³⁷ angewachsenen Zellen mit PBS, wurden diese mit 2,5%igem kakodylatgepuffertem, 4° C kaltem Glutaraldehyd für 20 Minuten fixiert und hierauf sechsmal mit Kakodylatpuffer gespült. Die Filtereinsätze wurden wie unter 3.2.8.1.

beschrieben aus ihren Plastikhalterungen herausgetrennt und in Präparategläschen weiterbehandelt. Die Deckgläschen verblieben für die gesamte Präparation in den CCSC-Systemen.

Es folgte eine Nachfixierung bei Raumtemperatur in 1%igem Osmiumtetroxid (gelöst in Kakodylatpuffer), mehrmaliges Spülen mit Aqua dest. und eine halbstündige Infiltration mit Thiocarbohydrazid (1%ig in Aqua dest.). Im Anschluß an mehrere Spülungen mit Aqua dest.

erfolgte eine zweite Fixierung der Zellen in Osmiumtetroxid (1%ig in Aqua dest.) für zwei bis drei Stunden. Dann schlossen sich wie oben beschrieben mehrere Spülgänge mit Aqua dest., eine nochmalige Inkubation in Thiocarbohydrazid, Spülen mit Aqua dest. und eine dritte Fixierung mit Osmiumtetroxid an. Es folgte eine Entwässerung der Präparate in einer aufsteigenden Alkoholreihe mit 25, 50, 60, 70, 80, 90, 95%igem und absolutem Ethanol für jeweils 10 bis 15 Minuten. Der 95 und 100%ige Alkohol wurde einmal, bzw. zweimal erneuert. Im Anschluß daran wurde der Alkohol schrittweise durch Isoamylacetat substituiert.

Dies erfolgte in drei Schritten zu jeweils 15 Minuten, im Verhältnis Ethanol zu Isoamylacetat 3 : 1, 1 : 1 und 1 : 3. Dann wurden die Proben für 30 Minuten in reines Isoamylacetat gegeben. Dieses wurde noch einmal erneuert und die Proben verblieben über Nacht in Isoamylacetat.

Bei der folgenden Trocknung der Präparate im Critical-Point-Drying-Apparatus³⁸ wurde das Isoamylacetat durch CO2 ersetzt. Anschließend wurden die Proben mit leitfähigem Klebstoff³⁹ auf Messingpräparatehaltern befestigt und mit einer feinen Goldschicht (Schichtdicke 300 – 500 nm) in einem Sputter Coater⁴⁰ überzogen. Die Untersuchung der Zellen erfolgte in einem Rasterelektronenmikroskop⁴¹ bei einer Beschleunigungsspannung von 4, 10 oder 15 kV.

37 Fa. Menzel

38 E 3000. Fa. Polaron, London

39 Leitsilber 200, Fa. Demetron, Hanau

40 BAE 120, Fa. Baelzer, Wiesbaden

41 Digital Scanning Microscope DSM 940, Fa. Zeiss, Oberkochem