Enzymnachweise

3.2.12.1. Enzymhistochemische Nachweise

Das Prinzip der Methoden ist, eine Umsetzung von spezifischem Substrat durch die im Gewebe bzw. in den Zellen enthaltenen Enzyme zu erreichen. Die Aufspaltung des Substrates bewirkt eine je nach eingesetztem Chromogen unterschiedliche Färbung in den Bereichen, in denen die Enzyme exprimiert werden.

51 Fa. Fluka, Neu-Ulm, Art. 78672

52 Fa. Amersham, Art. NA 931

Die Enzymnachweise wurden an den kultivierten Darmepithelzellen und zum Vergleich an Gefrierschnitten der fetalen Rinderdärme durchgeführt. Die Gefrierschnitte wurden für die Spülungen und Behandlungen mit den Inkubationslösungen in Glasküvetten verbracht und die Reaktionen bei 37° C fanden jeweils im Wasserbad statt. Bei kleineren Flüssigkeitsmengen an Inkubationslösung wurden die zu untersuchenden Bereiche auf den Objektträgern mit einem Fettstift eingekreist und die Lösung direkt auf diese Stellen pipettiert. Hier lief die Reaktion dann in feuchten Kammern ab (s. Aminopeptidase M). Bei den Epithelzellkulturen wurden die Lösungen direkt in die Vertiefungen der Kulturschalen pipettiert und die Reaktionen bei 37° C im Wärmeschrank durchgeführt.

Zur Kontrolle wurden Präparate jeweils parallel mit substratfreiem Medium inkubiert.

Alkalische Phosphatase:

Nach 10-minütiger Fixierung in Formol-Kalzium wurden die Präparate zunächst dreimal mit Aqua dest. gespült. Die Inkubationslösung bestand aus

- 10 ml 3%igem 2-Glycerophosphat⁵³ - 10 ml 5%igem Barbital-Natrium - 15 ml 2%igem Kalziumchlorid⁵⁴ - 10 ml 2%igem Magnesiumsulfat⁵⁵.

Sie wurde unmittelbar vor der Reaktion frisch angesetzt, gründlich gemischt und filtriert. Die Inkubationszeit betrug 30 Minuten bei 37° C. Anschließend wurden die Päparate in Aqua dest. gewaschen, für 5 Minuten mit 2%igem Cobaltnitrat⁵⁶ inkubiert und wieder in Aqua dest.

gewaschen. Dann schloß sich für 5 Minuten eine Reaktion mit 1%igem Ammoniumsulfid⁵⁷ an, nach der wiederum mit destilliertem Wasser gespült wurde. Zur Gegenfärbung wurde 2%iges Methylgrün verwendet. Die Gewebsschnitte wurden mit Kaisers Glyceringelatine eingedeckt. Das Enzym alkalische Phosphatase stellte sich schwarz vor einem hellblauen Hintergrund dar.

53 Fa. Sigma, Art. G 6251

54 Fa. Merck, Art. 2382

55 Fa. Merck, Art. 5886

56 Fa. Serva, Art. 27202

57 Fa. Merk, Art. 5442

Laktase:

Nach Fixierung der Zellen/Schnitte in Formol-Kalzium für 10 Minuten und dreimaligem Spülen mit Aqua dest. wurden die Proben in die wie folgt hergestellte Inkubationslösung verbracht:

- 12 mg 5-Brom-4-Chlor-3-indolyl-Fucosid⁵⁸ wurde in 750 µl N,N-Dimethylformamid⁵⁹ gelöst und mit 40 ml 0,1 M Zitronensäure-Phosphatpuffer (pH 6,5) gemischt.

- Diesem Gemisch wurden zunächst 3,6 ml 1,65%iges Kaliumhexacyanoferrat III⁶⁰ und dann 3,6 ml Kaliumhexacyanoferrat II⁶¹ beigegeben.

- Der pH-Wert der Lösung wurde auf 6,5 eingestellt.

Die Proben wurden für 4 Stunden bei 37° C in der Inkubationslösung belassen und danach eine Stunde unter fließendem Leitungswasser gespült. Hieran schloß sich eine Gegenfärbung mit Kernechtrot für 2 Minuten an. Im Falle eines positiven Laktasenachweises trat eine Blaufärbung gegen einen rosafarbenen Hintergrund auf.

Aminopeptidase M:

Nach 10-minütiger Fixierung der Proben in Formol-Kalzium wurden sie dreimal mit Aqua dest. gespült und in eine Inkubationslösung verbracht, die aus folgenden Komponenten bestand:

- 20 mg L-Alanin-4-methoxy-2-naphtylamid⁶² wurde in 1 ml N,N-Dimethylformamid gelöst.

- Eine Lösung aus 40 mg Fast Blue B⁶³ in 40 ml 0,1 M Kakodylatpuffer (pH 7,0) wurde hergestellt.

- Die beiden Lösungen wurden gemischt und filtriert.

- Der pH-Wert wurde auf 7,0 eingestellt.

Die Präparate wurden für 10 Minuten bei 37° C in die Inkubationslösung gegeben, 1 Stunde mit Aqua dest. gespült und für 12 bis 24 Stunden in 1%igem Glutaraldehyd in 0,1 M Kakodylatpuffer nachfixiert. Eine Gegenfärbung wurde mit saurem Hämalaun nach Mayer für eine Minute durchgeführt. Das Enzym Aminopeptidase M stellte sich mit dieser Reaktion rot gegen den blauvioletten Hintergrund dar.

3.2.12.2. Quantitativer biochemischer Enzymnachweis

Folgender Nachweis wurde an kultivierten Epithelzellen , welche mittels Gummischaber (Cell Scraper⁶⁴, von den Kulturgefäßen geschabt wurden und zur Kontrolle an frisch gewonnenen Darmschleimhautmassen, die zunächst in PBS tiefgefroren wurden, durchgeführt.

Saccharase-Isomaltase:

Das Prinzip zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität der Saccharase oder Isomaltase ist auch hier die Spaltung der Substrate Saccharose bzw. Isomaltose durch die Enzyme im Gewebe. Die bei der Spaltung enstehende Glukose wird nach Zugabe von Glukose-Oxidase oxidiert, wobei Glucon-1,4-lacton und Wasserstoffperoxid entstehen. Im Beisein von H₂O₂ oxidiert Peroxidase das farblose Reagenz O-Dianisidin. Dieses nimmt eine braune Farbe an, die fluorimetrisch gemessen werden kann.

Die Proben wurden zunächst 1 Stunde bei 37° C unter Anwesenheit der Substrate Saccharose und Isomaltose inkubiert (je 50 µl Probe plus 50 µl Substrat). Gleichzeitig wurden Substratblindwerte angesetzt, bei denen anstelle der Probe den Substraten Wasser beigemischt wurde. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 900 µl Wasser gestoppt, die Proben für 4 Minuten gekocht und dann abgekühlt.

Zur Messung wurde zunächst ein Glukosestandard erstellt Hierzu wurden 100 µl-Ansätze einer Glukosestammlösung hergestellt, welche jeweils 5, 10, 20, 40 und 80 µg Glukose enthielten. Als Leerwert (Standardblank) wurde reines Wasser eingesetzt. Nun fügte man den abgestoppten Proben, dem Glukosestandard und dem Standardblank je 2 ml des Reaktionsgemisches GOPOD (Glukose-Oxidase/Peroxidase/O-Dianisidin) zu. Nach Vortexen wurden die Proben maximal 30 Minuten inkubiert, bis eine ausreichende Braunfärbung festzustellen war. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 2 ml 10 N Salzsäure gestoppt und die Proben gevortext, was zu einem Farbumschlag nach rot führte. Zum Schluß ließ man die Proben für 10 Minuten stehen und konnte dann bei einer Wellenlänge von 530 nm die Extinktion gegen den Leerwert ablesen.

64 Fa. Nunc, Art. 179707

Zur Berechnung der Enzymaktivität (I.E. = µmol hydrolisiertes Disaccharid/Min.) wurde zunächst eine Standardkurve gezeichnet und die Glukosemenge [µg] bei der Extinktion 1,0 abgelesen. Nun konnte man zur Berechnung der Enzymaktivität folgende Formel einsetzen:

Extinktion der Probe bei 530 nm x µg Glukose bei E 1,0

____________________________________________________________ = I.E./ml 198,2 (Mol.gewicht Glukose) x Min. Inkubationszeit x Probenvol. [ml]