K ULTIVIERUNG VON D ARMEPITHELZELLEN

Kulturmedien:

Um die Proliferationsfähigkeit der Darmepithelzellen zu erhalten, wurden von den verschiedenen Untersuchern unterschiedliche Kulturmedien eingesetzt, sowie Kulturmedien optimiert und mit Zusätzen ergänzt. Die bei den einzelnen Spezies verwendeten Kulturmedien für Darmepithelzellen sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Tab. 1: Kulturmedien für Darmepithelzellen:

Spezies Benutztes Medium

Ratte - RPMI (KONDO et al. 1985)

- RPMI mit EDulb (1 : 1) (QUARONI 1985)

- EDulb (QUARONI u. ISSELBACH 1985; PAUL et al. 1993; BERNARD et al. 1989; PERREAULT u. BEAULIEU 1998)

- MEM und EDulb (EVANS et al. 1992)

- F 12 (FUKAMACHI 1992; FUKAMACHI et al. 1994) Maus - EDulb mit Ham´s F 12 (1 : 1) (BENS et al. 1996)

- EDulb (WHITEHEAD et al. 1993) Kaninchen - RPMI (NGUYEN et al. 1993)

Schwein - EDulb (KAEFFER et al. 1993)

Mensch - EDulb (SANDERSON et al. 1996; PERREAULT u. BEAULIEU 1996) - EDulb und OptiMEM (QUARONI u. BEAULIEU 1997)

Der Einfluß der Qualität des Kulturmediums auf die Anzucht von Epithelzellen zeigte sich auch in der Tatsache, daß bestes Wachstum bei der Verwendung von frisch angesetztem Medium erzielt wurde. Wurde das Medium aus Konzentraten hergestellt, die bereits über einen Monat gelagert worden waren, so ließen die Zellen deutlich in der Proliferation nach (EVANS et al. 1992).

Supplemente:

Fetales Kälberserum (FKS):

Bei Organkulturen konnte festgestellt werden, daß nur ein mit 5% FKS angereichertes Medium (1 : 1-Mischung aus DMEM und RPMI) im Vergleich zu einer serumfreien Mediumzubereitung mit bovinem Serumalbumin die Epithelzellen über einen längeren Zeitraum erhalten konnte (QUARONI 1985). Auch bei Monolayerkulturen kam es zum Einstellen des Wachstums der Zellen nach ca. zehn Tagen, sofern dem Kulturmedium FKS in einer Konzentration unter 1 % beigegeben wurde. Hohe Konzentrationen von FKS (10 %) bewirkten wiederum, daß mesenchymale Zellen derart stark proliferierten, daß sie die Epithelzellen überwucherten. Bei Zugabe von 2,5 % FKS zum Kulturmedium hielt sich das unerwünschte Wachstum von Bindegewebszellen des Darmes in Grenzen (EVANS et al.

1992).

Darmepithelzellen des Schweines konnten an ein Medium mit niedrigem FKS-Gehalt adaptiert werden (KAEFFER et al. 1993). Zwar waren sie bei einer Konzentration von 0,1 % FKS noch lebensfähig, jedoch stellte ein Serumanteil von 1 % die minimale Menge dar, die für das Zellwachstum benötigt wurde .

Durch die Verwendung serumfreier, supplementierter Medien konnten Epithelzellen sowohl zu Proliferation als auch zu morphologischer Differenzierung angeregt werden, jedoch schien die Interaktion mit mesenchymalen Zellen notwendig für die funktionelle Differenzierung der Zellen zu sein. Auch ließen sich die in solchen Medien angezüchteten Zellen nicht passagieren (FUKAMACHI 1992). Darüber hinaus wurde bei Langzeitkulturen normaler Kolonepithelzellen des Menschen beobachtet, daß in serumfreien Medien mit identischer Supplementierung wie in serumhaltigen Vergleichsmedien die Zellen erhebliche Vitalitätsverluste erlitten (BATEN u. SHAMSUDDIN 1992).

Wurde serumfreien Medien, in denen durch Zugabe von verschiedenen Supplementen das Wachstum der Epithelzellen gefördert werden sollte, Serum zugesetzt, so kam es durch Serumkonzentrationen von 2 – 20 % zu einer deutlichen Reduktion der Epithelzellproliferation (FUKAMACHI 1992). Dies wurde auf die Tatsache zurückgeführt, daß Serumkonzentrationen über 0,1 % die wachstumsstimulierenden Eigenschaften von Supplementen, wie beispielsweise EGF und Insulin, behindern (WU u. SMITH 1982).

Außerdem enthält Serum eine Reihe von Faktoren, insbesondere TGF-ß die die Differenzierung von Epithelzellen in Kultur beeinflussen (MASUI et al. 1986).

Epidermal Growth factor (EGF), Insulin, Choleratoxin, Transferrin, Hydrocortison:

Die Verwendung der oben aufgeführten Supplemente in serumfreien Medien zeigte, daß sie synergistisch die Proliferation von Enterozyten in Kultur stimulierten. Wenn sie jedoch nur einzeln dem Medium zugegeben wurden, war kein Anstieg des Zellwachstums zu registrieren (FUKAMACHI 1992). Für eine kontinuierliche Proliferation konditionell immortalisierter Darmepithelzellen des Menschen war ein spezielles Wachstumsmedium, welches sowohl Insulin als auch EGF enthielt, essentiell. Die alleinige funktionelle Expression des zur Immortalisation verwendeten SV40T-Ag war nicht ausreichend, um ein Wachstum über längere Zeiträume zu ermöglichen (QUARONI u. BEAULIEU 1997). Untersuchungen an intestinalen Kryptzellinien von Ratten zeigten, daß Insulin nur in supraphysiologischen Konzentrationen Zellproliferation induzieren konnte, wohingegen EGF auch in niedrigeren Konzentrationen, die den in vivo-Werten entsprechen, eine Steigerung der Epithelzellproliferation bewirkte (CONTEAS et al. 1989). EGF wird unter physiologischen Bedingungen im Sekret der Brunnerschen Drüsen der praepylorischen Region und des proximalen Duodenums gefunden (MEITZ et al. 1978). Bei Zugabe von Insulin in supraphysiologischer Dosis wurde eine erhöhte Bindungsaffinität der Zellen für EGF gemessen (CONTEAS et al. 1989). Dies könnte eine Erklärung für den Synergismus dieser beiden Supplemente bei der Zellkultivierung sein.

Heparin:

Heparin inhibierte ab Konzentrationen von 100 µg/ml die Proliferation von Zellen der glatten Muskulatur (smooth muscle like cells). Zugabe von Heparin zum Medium ließ einen deutlichen Anstieg des Wachstums epithelialer Zellen erkennen (EVANS et al. 1992).

Hepatocyte Growth Factor (HGF):

HGF konnte das Wachstum fetaler gastrointestinaler Zellen der Ratte dosisabhängig stimulieren (FUKAMACHI et al. 1994). HGF-mRNA wird nur in mesenchymalen Zellen exprimiert, während der HGF-Rezeptor c-met sowohl in epithelialem als auch in mesenchymalem Gewebe nachgewiesen wurde. Die Reaktion auf die mitogene Aktivität des HGF differierte je nach Gewebstyp, so war zum Beispiel das Epithel des Drüsenmagen etwas stärker stimulierbar als das des Darms. EGF wurde durch HGF in seiner Wirkung substituiert.

HGF verlor in Abwesenheit von Hydrocortison und Transferrin seine stimulierende Wirkung, was auf komplexe Interaktionen zwischen HGF und den anderen Wachstumsfaktoren hinweist.

2.3.2. Extrazelluläre Matrix

Die Anheftung der Epithelzellpopulation an die Kulturgefäße wurde durch unterschiedliche Arten der Beschichtung mit extrazellulären Matrixkomponenten verstärkt.

Eine verbesserte Anheftung von Epithelzellen der Ratte an die Kulturgefäße wurde durch Verwendung von Kornealendothelien des Rindes und 3T3-Fibroblasten als biologische Matrix registriert (EVANS et al. 1992). Auch bei Verwendung von Kollagenen aus der Rinderhaut, bzw. aus den Sehnen von Rattenschwänzen, wurde ein gutes Anheften der Epithelzellen auf diesen Unterlagen beobachtet. Auf diesen Matrizes wurde jedoch nur die Anheftung der Zellen, nicht aber deren Proliferation begünstigt. Ein Vergleich von normalen Plastikzellkulturgefäßen mit Fibronectin oder Kollagen I und IV beschichteten Unterlagen ergab keine Unterschiede bezüglich einer verstärkten Anheftung. Als äußerst ungünstig erwiesen sich Beschichtungen mit 1 – 2 mm dicken hydrierten Kollagengelen und Matrigel.

Letzteres stellt einen Extrakt der Basalmembran des Engelbreth-Holm-Swarm Tumors der Maus dar, welcher 60 % Laminin, 30 % Kollagen IV und geringe Mengen anderer Proteine enthält (KLEINMANN et al. 1986).

Durch Trypsinverdau gewonnene Darmepithelzellen des Kaninchens zeigten ein zweifach stärkeres Anheften auf matrigelbeschichteten Zellkulturflaschen im Vergleich zu normalen Plastikzellkulturgefäßen. Auch die Wachstumskapazität der Zellen auf Matrigel war signifikant höher (NGUYEN et al. 1992).

Differenzierte Enterozyten des Menschen wiesen nach Aussaat auf kollagenbeschichteter Unterlage ein intensiveres Ausbreiten von Epithelzellkolonien auf. Diese waren auf Kollagen im Vergleich zu Plastik auch länger lebensfähig, expandierten stärker und konfluierten zu Monolayern ( PERREAULT u. BEAULIEU 1998).

Intestinale Epithelzellen der Maus bildeten bei Verwendung semipermeabler transparenter Filter, die mit Kollagen beschichtet waren, Monolayer und behielten ihre strukturelle Polarität bei (BENS et al. 1996).

Die Verwendung extrazellulärer Matrix war nicht nur für die Anhaftung der Epithelzellen von Bedeutung, sondern beeinflußt auch den Phänotyp der kultivierten Zellen. So zeigte sich beispielsweise, daß fetale Darmepithelzellen des Menschen, sofern sie auf normalen Plastikzellkulturgefäßen gezogen wurden, völlig undifferenziert waren. Wachstum auf Matrigel hingegen bewirkte, daß die Zellen ausdifferenzierten, eine polarisierte Struktur und Aktivität von alkalischer Phosphatase aufwiesen (SANDERSON et al. 1995).