Untersuchung auf Kontamination mit BVD-Virus / Mykoplasmen

Die serologische und virologische Untersuchung des Blutes der für die Zellkulturen verarbeiteten Feten ergab, daß diese frei von BVD-Virus waren. Die anschließende

immunhistologische Überprüfung der Zellkulturen bestätigte, daß sie frei von einer Kontamination mit BVD-Virus waren.

Die Untersuchung auf Kontamination mit Mykoplasmen fiel bei sämtlichen Zellen sowohl bei den Anzüchtungsversuchen als auch über den Antigen-Capture-ELISA negativ aus.

4.3.4. Proliferationsmessungen

4.3.4.1. Bestimmung der Stoffwechselaktivität

Als Vergleich zur Bestimmung der Proliferationsrate der bovinen Darmepithelzellen und zur Ermittlung der für den Versuch optimalen Zellzahl wurde der Proliferationstest zunächst mit MDBK-Zellen durchgeführt (Abb. 14). Hierbei wurden die Zellen in einer Dichte von jeweils 5000, 10000, 15000, 20000 und 30000 Zellen pro Mikrotitervertiefung ausgesät und die optische Dichte als Maßstab für die Proliferationsaktivität der Zellen in Zeitabständen von 12, 24, 48 und 72 Stunden bestimmt.

Abb. 14: Proliferationstest mit MDBK-Zellen

0,000 0,100 0,200 0,300 0,400 0,500 0,600 0,700 0,800 0,900 1,000

12 24 48 72

Zeit nach Aussaat in Stunden

OD

5000 Zellen 10000 Zellen 15000 Zellen 20000 Zellen 30000 Zellen

Hier zeigte sich, daß die Proliferationsrate – gemessen an der optischen Dichte - bei Aussaat von größeren Zellzahlen höher lag als bei Verwendung einer niedrigeren Zelldichte; und daß die Zahl der proliferationsaktiven Zellen mit zunehmender Kulturdauer bei allen Versuchen stetig anstieg. Der gleichmäßigste Kurvenverlauf ergab sich bei der Verwendung von 5000 Zellen als Ausgangsmaterial.

Bei der Durchführung dieses Versuches mit den bovinen Darmepithelzellen wurde daher eine Ausgangszelldichte von 5000 Zellen/Vertiefung eingesetzt (Abb.15 a). Als Vergleichswert wurde die Lichtabsorptionsmessung nach 12 Stunden jedoch zusätzlich mit 10000 Zellen/Vertiefung durchgeführt (Abb. 15 b). Außerdem wurde noch ein weiterer Meßpunkt nach 96 Stunden angesetzt, da sich die bovinen Darmepithelzellen im Vergleich zu den vorher benutzten MDBK-Zellen durch ein langsameres Wachstum auszeichneten.

Bei den Darmepithelzellen (Kultur 2, 3 und 4) zeigte sich wie bei den MDBK-Zellen eine mit zunehmender Kulturdauer ansteigende Proliferationsaktivität (Abb. 15 a). Das bei der Zellkultur 2 schon durch mikroskopische Kontrolle der Zellen sichtbare bessere und schnellere Wachstum im Vergleich zu den anderen Zellkulturen spiegelte sich auch bei diesem Versuch durch eine gesteigerte Proliferationstätigkeit wieder. Für diese Messung wurde bereits der ZB 5-Mediumzusatz verwendet, auf den die Zellkultur 2 besonders gut ansprach.

Einzige Ausnahme bildeten die Zellen der Kultur 1, die nach längerem Verbleib bei –80 ° Celsius nicht mehr anwuchsen. Zwar ließen sich die Zellen nach dem Auftauen noch in der erforderlichen Dichte aussäen, jedoch starben sie innerhalb kurzer Zeit ab, was sich in der im Vergleich zu den anderen Zellen extrem niedrigen Proliferationsrate und dem anschließenden Sistieren der Proliferation wiederspiegelte (Abb. 15 a, b).

Abb. 15: Proliferationsrate der bovinen Darmepithelzellen

a) Proliferationsrate der bovinen Darmepithelzellen bei Aussaat von 5000 Zellen

b) Vergleich der Proliferationsrate von 5000, bzw. 10000 ausgesäten Zellen nach 12 Stunden

Im Vergleich zu den MDBK-Zellen (Abb. 14) war bei den Darmepithelzellen (Abb. 15) die nach 12 Stunden gemessene optische Dichte im Durchschnitt vergleichbar. Die MDBK-Zellen wiesen mit zunehmender Kulturdauer eine deutlich höhere Proliferationsrate auf. Dies wiederum entsprach auch dem bei mikroskopischer Kontrolle feststellbarem schnellerem Wachstum der MDBK-Zellen.

-0,04 0,01 0,06 0,11 0,16 0,21 0,26

12 24 36 48 72 96

Zeit nach Aussaat in Stunden

OD

Kultur 1 Kultur 2 Kultur 3 Kultur 4

0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 0,18 0,20

Kultur 1 Kultur 2 Kultur 3 Kultur 4

OD

5.000 Zellen 10.000 Zellen

4.3.4.2. Vergleich der Zellproliferation anhand der Expression zellzyklusassoziierten Ki67-Antigens

Der Nachweis des zellzyklusassoziierten Ki67-Antigens wurde bei den einzelnen Zellkulturen in unterschiedlichen Passagezahlen durchgeführt (Abb. 16). Es waren Zellen, die vor Durchführung des Versuchs bei –80° Celsius tiefgefroren waren und wieder in RPMI/EDulb-Medium aufgetaut wurden. Parallel zum Nachweis des Ki67-Antigens wurde das Zellwachstum in Kultur beobachtet und dokumentiert.

Bei sämtlichen Zellkulturen konnte ein deutlicher Rückgang der Proliferationsaktivität mit zunehmender Passagezahl festgestellt werden. Nach dem Auftauen benötigten die Zellen der Kulturen 2 bis 4 etwa doppelt so lange, um in gleicher Dichte anzuwachsen, wie es bei der in gleicher Zellzahl ausgesäten jüngeren Passage der Fall war. Die Epithelzellen der Kultur 1 zeigten unabhängig von der Passagezahl eine niedrige Wachstumsrate und Zelldichte.

Abb. 16: Anzahl Ki67-positiver Zellen in Zellpassagen unterschiedlichen Alters

0

Kultur 1 Kultur 2 Kultur 3 Kultur 4

Ki67-positive Zellen [%]

3. Passage 4. Passage 5. Passage 9. Passage

Diese Befunde zur Zellproliferation entsprachen den Beobachtungen in den Zellkulturen, die im Zusammenhang mit dem Passagieren und Konservieren der Zellen gemacht wurden: Die Epithelzellen der vier Kulturen ließen sich unterschiedlich oft passagieren (Tab. 15), wobei die Zellproliferation durch die individuelle Vitalität begrenzt war. Dies äußerte sich entweder durch ein völliges Sistieren des Zellwachstums (Kultur 1) oder durch eine drastische Zunahme der in jungen Passagen nur in minimalen Konzentrationen vorhandenen Fibroblasten, die die in ihrer Proliferation nachlassenden Epithelzellen völlig überwucherten.

Dies wurde vor allem bei Kultur 3 beobachtet.

Tab. 15: Anzahl durchgeführter Passagen bei den unterschiedlichen Epithelzellen

Zellkultur 1 2 3 4

Letzte Passage 9. 12. 6. 9.

Desweiteren zeigte sich bei Epithelzellen sämtlicher Kulturen (und nicht nur der älteren Passagen), welche ein halbes Jahr oder länger bei -80 ° Celsius konserviert wurden, daß sie nach dem Auftauen nur spärlich, überhaupt nicht (Kultur 1) oder äußerst langsam wieder in Kultur anwuchsen. In diesem Fall wurde den Zellen ZB5-Medium zu der ansonsten verwendeten RPMI/EDulb-Mischung im Verhältnis 1 : 1 beigegeben. Die bereits inaktiven Zellen der Kultur 1 ließen sich trotzdem nicht mehr weiter anzüchten. Im Gegensatz dazu zeigten die Epithelzellen der Kultur 2 wieder eine deutlich gesteigerte Wachstumsaktivität.

Die Epithelzellen der Kulturen 3 und 4 ließen sich durch den ZB5-Zusatz zwar zur weiteren Proliferation stimulieren, diese war jedoch nicht so stark ausgeprägt wie bei den Zellen der Kultur 2.

4.3.5. Expression von Epithelzellmarkern, pan-Cytokeratin, CK 8 und CK 19